Summary
Denna studie beskriver en ny metod för att isolera murinbruna adipocyter för gen- och proteinuttrycksanalys.
Abstract
Brun fettvävnad (BAT) är ansvarig för icke-skakande termogenes hos däggdjur, och bruna adipocyter (BA) är de funktionella enheterna i BAT. BA innehåller både multilokulära lipiddroppar och rikliga mitokondrier, och de uttrycker frikopplingsprotein 1 (UCP1). BA kategoriseras i två undertyper baserat på deras ursprung: embryo-härledda klassiska BA (cBA) och vita adipocyter härledda BA. På grund av sin relativt låga densitet kan BA inte isoleras från BAT med traditionell centrifugeringsmetod. I denna studie utvecklades en ny metod för att isolera BA från möss för gen- och proteinuttrycksanalys. I detta protokoll smältes interscapular BAT från vuxna möss med kollagenas och Dispase-lösning, och de dissocierade BA berikades med 6% jodoxanollösning. Isolerade BA lyserades sedan med Trizol-reagens för samtidig isolering av RNA, DNA och protein. Efter RNA-isolering användes den organiska fasen av lysatet för proteinextraktion. Våra data visade att 6% jodoxanollösning effektivt berikade BA utan att störa uppföljande gen- och proteinuttrycksstudier. Trombocyt-härledd tillväxtfaktor (PDGF) är en tillväxtfaktor som reglerar tillväxten och spridningen av mesenkymala celler. Jämfört med den bruna fettvävnaden hade isolerade BA signifikant högre uttryck av Pdgfa. Sammanfattningsvis ger denna nya metod en plattform för att studera biologin hos bruna adipocyter på en enda celltypsnivå.
Introduction
Både möss och människor har två typer av fettvävnader: vit fettvävnad (WAT) och brun fettvävnad (BAT)1. WAT lagrar energi i form av triglycerider i vita adipocyter, och de bruna adipocyterna (BA) i BAT sprider kemisk energi som värme2. Baserat på deras utvecklingsursprung kategoriseras BA vidare i klassiska BA (cBA) som bildades under embryoutveckling och vita adipocyter härledda BA (beige / brite-celler, konverterade från vita adipocyter under stressförhållanden)3. BA är multilokulära och uttrycker det termogena proteinfrikopplingsproteinet 1 (UCP1)4. Interscapular BAT (iBAT) depå är en av de primära cBAs-depåerna i små däggdjur5, medan beige celler sprids inom WAT6.
På grund av deras natur att sprida energi har BA fått mycket uppmärksamhet som ett terapeutiskt mål för att minska fetma7. För att utnyttja BA för att behandla fetma är det viktigt att förstå de molekylära mekanismerna som styr BAs funktion, överlevnad och rekrytering. Fettvävnader inklusive BAT och WAT är heterogena. Med undantag för adipocyter innehåller fettvävnader många andra celltyper, såsom endotelceller, mesenkymala stamceller och makrofager8. Även om genetiska verktyg för att specifikt tömma kandidatgener hos möss BAs finns tillgängliga, såsom UCP1::Cre line9, är tekniker för att rena BA från BAT eller WAT begränsade, vilket gör det svårt att studera BA på encellstypnivå. Dessutom, utan att erhålla rena BAs, kommer förhållandet mellan BA och icke-BAs inte att vara tydligt avgränsat. Till exempel har trombocyt-härledd tillväxtfaktorreceptor alfa (PDGFRα) använts som en markör för odifferentierade mesenkymala celler, och det uttrycks i endotel- och interstitiella celler i BAT. Vid kallstressad BAT ger PDGFRα-positiva stamceller upphov till nya BAs10. PDGFRα aktiveras av dess ligand PDGF, en tillväxtfaktor som reglerar tillväxten och spridningen av mesenkymala celler11; Det är dock oklart om BA påverkar beteendet hos PDGFRα-positiva stamceller genom att utsöndra PDGF.
Nyligen har ett BAs-isoleringsprotokoll publicerats, som är baserat på fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)12. I detta protokoll användes 3% bovint serumalbumin (BSA) lösning för att separera BA från icke-BA, och de berikade BA: erna renades ytterligare av FACS. Tillämpningen av detta protokoll begränsas av kravet på FACS-processen, som bygger på både utrustning och FACS-driftsupplevelser. I denna studie utvecklades ett nytt protokoll för att isolera BA från BAT. De BA som isoleras av detta protokoll kan användas direkt för gen- och proteinuttrycksstudier. Dessutom tyder data från denna studie på att BA är en viktig PDGF-resurs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss upprätthölls under patogenfria förhållanden, och alla procedurer godkändes av Masonic Medical Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). UCP1::Cre9 och Rosa 26tdTomato möss linjer13 rapporterades tidigare. Alla möss hölls i rumstemperatur med en ljus/mörk cykel på 12 timmar.
1. Beredning av lösningar och brun fettvävnad (BAT)
- Förbered matsmältningslösning och separationslösning i 15 ml centrifugrör.
- 10 ml BAT-uppslutningslösning: Tillsätt 3,5 mg/ml Dispase II, 1 mg/ml Kollagenas II och 10 mM CaCl2till 10 ml BAT digestionslösning.
- 10 ml 12% jodoxanollösning (separationslösning): Blanda 1 ml 10x PBS, 2 ml 60% jodoxanol, 0,01 ml 1 M MgCl2, 0,025 ml 1 M KCl, 0,1 ml 0,2 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och 6,865 mlddH2Oför att erhålla 12% jodoxanol.
- Avliva en vuxen mus med CO2-överdosering . Kortfattat fyller du musburet med 100% CO2 med en förskjutningshastighet på 10-30% burvolym per min. 5 min senare, bekräfta döden genom att kontrollera om det inte finns synlig andning.
- Dissekera djuret och samla interscapular BAT. Ta bort WAT och muskellager under ett stereomikroskop.
- För att få tillräcklig matsmältning, skär varje BAT-lob i ~ 3 mm3 delar och placera dem i en ren 50 ml kolv med en metallrörstång och 5 ml uppslutningslösning. Innan matsmältningen påbörjas, låt kolven som innehåller BAT och digestionsbufferten sitta på is i 1 timme.
OBS: I följande steg användes cirka 80 mg BAT för isolering av bruna adipocyter.
2. Förfarande för isolering av BA
- Placera kolven på en magnetomrörare som är innesluten i en inkubator. Ställ in omrörningshastigheten på 60 rpm respektive inkubatorns temperatur på 35 °C. Matsmältningen kommer att pågå i cirka 30 minuter. Om BAT-skivorna bildar klumpar runt omrörarstången under uppslutningen, använd en 1 ml pipettspets för att störa de aggregerade vävnaderna.
- Placera ett 70 μm silfilter ovanpå ett rent 50 ml centrifugrör. Pipettera cirka 4 ml cellsuspension genom silen. Tvätta silen med 4 ml 12% jodoxanollösning. Pipettera upp och ner för att blanda cellerna och jodoxanollösningen. Överför cellblandningen till två klara 5 ml polystyrenprovrör.
OBS: I slutet av matsmältningen bör matsmältningslösningen vara grumlig, vilket indikerar tillräcklig matsmältning. Använd färsk matsmältningslösning varje gång. När den är beredd ska matsmältningslösningen användas inom 2 timmar. - Upprepa steg 2.2 och 2.3 en gång till om matsmältningen inte är tillräcklig.
- Lämna de klara polystyrenrören som innehåller separationslösningen och BA på is i 1 timme. BA: erna kommer att bilda ett lager på toppen.
- Ta ut 20 μl av de isolerade BA för mikroskopundersökning.
3. RNA och proteinisolering från BA
- Pipettera BAs-skiktet i två 1,7 ml mikrocentrifugrör för RNA- och proteinisolering. Ta försiktigt bort den överdrivna jodoxanollösningen utan att störa BAs-skiktet.
- Tillsätt 1 ml Trizol för att samtidigt isolera RNA, DNA och protein i celllösningen. Blanda tillräckligt för att lysera cellerna.
- Tillsätt 200 μl kloroform för att separera faserna.
- Centrifugera röret i 9,981 x g i 10 min vid 4 °C.
- Efter centrifugering, använd vattenfasen för RNA-isolering. I denna studie användes totalt RNA för omvänd transkription och kvantitativ RT-PCR utfördes med realtids-PCR. Primersekvenser listas i materialförteckningen.
- Överför 300 μl av den organiska fasen till ett 2 ml mikrocentrifugrör.
- Till den organiska fasen, tillsätt 2,5 volym 100% etanol och virvel i 10 s.
- Tillsätt 200 μl 1-Brom-3-klorpropan och virvel i 10 s.
- Tillsätt 600 μl dubbeldestillerat vatten och virvel i 10 s.
- Låt den blandade lösningen stå i 10 min vid rumstemperatur.
- Centrifugera vid 9,981 x g i 10 min vid 4 °C. I detta steg kommer faserna att separeras. Proteinfasen är lokaliserad i mellanskiktet.
- Ta bort den övre vattenhaltiga lösningen. Tillsätt 1 ml 100% etanol i den återstående lösningen.
- Centrifugera i 10 min, 9 981 x g, 4 °C. Efter centrifugering bildas proteinpelleten. Kassera supernatanten.
- Tvätta pelleten med 1 ml 100% etanol.
- Centrifugera i 10 min, 9981 x g, 4 °C. Spara pelleten och kassera supernatanten.
- Lufttorka pelleten i 10 min vid rumstemperatur.
- Mät vikten på den våta pelleten. Tillsätt 1% SDS-lösning i förhållandet 20 μl/mg pellet.
- Lös upp pelleten genom att sätta röret i en uppvärmd skakare. Ställ in temperaturen på 55 °C och hastigheten på 11 x g. Det tar vanligtvis 5-10 minuter att helt lösa upp proteinpelleten.
OBS: Koncentrationen av det upplösta proteinet kan mätas med BCA-analys14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beredning av interakapulär BAT för isolering av bruna adipocyter
Isoleringsprocessen för bruna adipocyter (BAs) visas i figur 1A. Hela processen, från beredning av BAT- och digestions-/separationslösningar till att erhålla isolerade BAs, kommer att ta cirka 4 timmar.
Hos vuxna möss finns riklig BAT i den interscapulära regionen. Denna interskapulära BAT (iBAT) täcks av muskellager och WAT (figur 1B). Innan matsmältningsproceduren påbörjas måste muskelskikten och WAT tas bort för att ge ren iBAT (figur 1C). I ett publicerat protokoll för isolering av BAs användes malet BAT för BAs-isolering12. I denna studie gav matsmältningen av3 mm 3 storlek BAT (figur 1D) mer BA än malet BAT.
Separering av BA från icke-BA med 3% BSA-lösning
Efter iBAT-rötning blandades dissocierade BA med icke-BA i digestionsprodukten. Eftersom BA innehåller lipiddroppar är deras densitet lägre än icke-BA; BAs densitet är dock inte tillräckligt låg för att låta dem effektivt flyta till toppen av en vanlig PBS-lösning. PBS innehållande 3% bovint serumalbumin (BSA) har använts för att separera BA från icke-BAs12, vilket framgångsrikt upprepades i denna studie (figur 2A).
Rosa 26 tdTomato är en reportermuslinje som uttrycker starkttdTomato (tdTom ) fluorescensprotein efter Cre-medierad rekombination13. Ucp1::Cre transgena möss uttrycker Cre-rekombinas i BAs9. Ucp1::Cre muslinje korsades med Rosa 26tdTomatotikmöss för att genetiskt märka BA med tdTom (Figur 2B). För validering av BAs isoleringsprocedur dissocierades iBAT från Ucp1::Cre;tdTom/+ möss. De flesta celler som berikades i det översta lagret av BSA-lösning var hallonform och innehöll multilokulära lipiddroppar. Dessutom var de flesta av dessa hallonformade celler tdTom-positiva (figur 2C), vilket bekräftade att de var bruna adipocyter.
Separering av BA från icke-BA med 6% jodoxanollösning
3% BSA-separationslösning berikade BAs. Det var oklart om dessa isolerade BA kunde användas för gen- och proteinuttrycksanalys. RNA och protein extraherades sedan från de berikade BA: erna. RNA-extraktion utfördes framgångsrikt enligt standard-RNA-isoleringsproceduren. Standard Trizol-proteinisoleringsprotokollet, även känt som Guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroformmetod (GTPC-metoden), fungerade dock inte bra, vilket var tråkigt och hade mycket lågt proteinutbyte. Därför antogs en förbättrad proteinisoleringsmetod för att extrahera protein från Trizol-lyserade BA.
I detta förbättrade GTPC-protokoll användes etanol, bromklorpropan och vatten för att extrahera protein från den organiska fas15. Efter tillsats av etanol, brom-klorpropan och vatten i den organiska fasen och efter centrifugering bildades proteinpellets mellan vattenfasen och den organiska fasen (figur 3A). Proteinpellet tvättades sedan med 100% etanol och löstes i 1% SDS. Denna förbättrade GTPC-metod användes för att extrahera protein från iBAT- och BSA-lösningsberikade BA. Även om BAT-proteinpelleten lätt löstes upp i 1% SDS, var en stor del av den isolerade BAs-proteinpelleten inte löslig. Därefter undersöktes det upplösta proteinet med SDS-PAGE-gel. Som visas i en Coomassie blåfärgad SDS-PAGE-gel (figur 3B) fanns ett massivt proteinband runt 60 kDa i de isolerade BA: erna men inte i BAT-proverna. Eftersom molekylvikten för BSA är 66 kDa, och riklig BSA finns i BAs separationslösning, bör detta dominerande proteinband vara BSA. Dessa data tyder på att BSA från BAs separationslösning stör proteinextraktionen.
Jodoxanol är ett icke-joniskt och iso-osmotiskt gradientmedium16 som har använts i stor utsträckning för cell 17 och adenoassocierad virus (AAV) rening18. För att undvika BSA-interferens av proteinuttrycksstudier användes jodoxanol för att ersätta BSA i en ny BAs-separationslösning. 3% BSA-lösning har en densitet av 1,03, vilket liknar 6% jodoxanol. I 6% jodoxanollösning flöt BA till toppen på 30-60 min (figur 3C). De BA som isolerades med denna lösning visade typisk hallonform och innehöll multilokulära lipiddroppar (figur 3D). Proteiner extraherade från dessa isolerade BA separerades fint i SDS-PAGE-gel (figur 3E).
För att verifiera om 6% jodoxanollösningen effektivt separerade BA från icke-BA, märkte vi genetiskt BA: erna med tdTom och undersökte cellerna som bor i den klara 6% jodoxanollösningen. Efter att ha separerat BA från icke-BA (steg 2.4) späddes 6% jodoxanollösningen under BAs-skiktet 6 gånger med PBS och centrifugerades sedan vid 600 x g i 5 min. Efter centrifugering bildades en liten röd cellpellets på botten, som kan vara stromala vaskulära fraktionsceller. Som visas i figur 3 var celler från BAs-lagret tdTom-positiva celler (figur 3F); celler som återhämtades från pelleten var dock tdTom-negativa (figur 3G). Dessutom var inga uppenbara lipiddroppar synliga i de tdTom-negativa cellerna. Dessa data tyder på att vårt nya protokoll effektivt kan separera BA från de fettfria cellerna.
Tillsammans visar dessa data att isolering av BA med 3% BSA-lösning stör uppföljning av biokemistudier och tyder på att 6% jodoxanollösning är bättre än 3% BSA-lösning för att isolera BA.
Gen- och proteinuttrycksanalys med isolerade BA.
För att validera detta nya BAs-isoleringsförfarande på molekylär nivå jämfördes uttrycket av tre gener mellan BAT och isolerade BA: Ucp1, Pdgfa och Pdgfra. I BAT uttrycks Pdgfra i endotelceller och interstitiella celler, och PDGFRα-positiva celler är förmodade stamceller10. mRNA-nivåerna av Ucp1 och Pdgfa var båda signifikant högre i de isolerade BA än i BAT (figur 4A,B). Tvärtom detekterades mRNA för Pdgfra endast i BAT (figur 4B).
PPARγ är en transkriptionsfaktor som styr fettvävnadsutveckling, UCP1 är ett mitokondriprotein och PDGFRα är ett membranreceptorprotein. Dessa tre proteiner representerar proteiner fördelade i olika cellulära fack. Western blots utfördes för att testa om protein extraherat från Trizol-lysed BA och BAT var lämpligt för proteinuttrycksanalys. UCP1 och PPARγ påvisades i både BA och BAT (figur 4C,D), vilket bekräftar att det totala proteinet som isolerats från Trizol-lyserade BA eller BAT är lämpligt för western blot. I överensstämmelse med qRT-PCR-resultaten berikades UCP1-protein dessutom i BA (figur 4C); PDGFRα påvisades endast i BAT men inte i rena BA (figur 4D). Sammanfattningsvis visar dessa data att vår nya BAs-isoleringsmetod är effektiv och tyder på att BA som berikas med denna metod kan användas direkt för gen- och proteinuttrycksstudier.
Figur 1: Beredning av iBAT för isolering av bruna adipocyter. (A) Arbetsflöde för isoleringsförfarandet för bruna adipocyter. (B) Ventral vy av den interskapulära vävnaden som innehåller BAT-, WAT- och muskelskikt. c) Interscapular BAT (iBAT). Muskellager och WAT intill iBAT togs bort. D) En representativ bild av iBAT-delar som används för isolering av bruna adipocyter. B-D, Skala bar = 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Separation av bruna adipocyter från matsmältningslösningen. (A) Bilder av dissocierade bruna adipocyter före och efter separation. 3% BSA-lösning användes för att separera bruna adipocyter från icke-bruna adipocyter. Skala bar = 1 cm. (B) Schematisk bild av genetisk märkning av bruna adipocyter med tdTomato fluorescensprotein. (C) Bilder av isolerade bruna adipocyter. DIC, differentiell interferenskontrast. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Extraktion av totalt protein från lyserade bruna adipocyter . (A) Separation av proteinfas från den organiska fasen. (B) Coomassiefärgning av SDS-PAGE-gel. Totalt protein extraherades från BAT eller 3% BSA-lösning renade bruna adipocyter. BSA-proteinbandet indikerades med en pil. (C) Brunt adipocytskikt bildat ovanpå 6% jodoxanollösning. Skalstång = 1 cm. (D) Bruna adipocyter isolerade med 6% jodoxanollösning. Bruna adipocyter indikerades med gula pilar. Skalstång = 50 μm. (E) Coomassiefärgning av SDS-PAGE-gel. Totalt protein extraherades från BAT eller 6% jodixanollösning berikade BA. (F) Bilder av tdTom märkta bruna adipocyter. (G) Bilder av celler som återvunnits från jodoxanollösningen under BAs-skiktet. F och G, skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Gen- och proteinuttrycksanalys av isolerade bruna adipocyter. Bruna adipocyter isolerade med jodoxanolmetoden användes i dessa gen- och proteinuttrycksstudier. (A,B) qRT-PCR-mätning av genuttryck. mRNA-nivåerna normaliserades till 36B4. N=3. Student t test, *, P<0,01; **, P<0,01. C) Western blotting av PPARγ och UCP1. d) Western blotting av PDGFRα. C och D, Ponceau S-färgat membran användes som lastkontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie utvecklades en ny metod för att isolera BA för gen- och proteinuttrycksanalys.
I ett publicerat BAs-isoleringsprotokoll användes 3% BSA-lösning för att berika BAs12. De berikade BA som uppnåddes genom detta publicerade protokoll kunde dock inte användas direkt för proteinuttrycksanalys. Detta beror på att den koncentrerade BSA som finns i BAs-lösningen stör uppföljningen av proteinextraktionen. När BA berikade i 3% BSA-lösningen behandlades med Trizol-reagens skulle klibbiga proteinaggregat bildas, varav majoriteten inte var löslig i GTPC-proteinextraktionsprocessen. I GTPC-proteinextraktionsprodukten var dessutom det mesta av proteinet BSA (figur 3B). I detta nya protokoll ersattes 3% BSA-separationslösning med 6% jodoxanol för rening av BA. 6% jodoxanollösning separerade effektivt BA från icke-BAs, och de isolerade BAs hade bevarad morfologi (Figur 3D). Överlägsen 3% BSA-lösning, 6% jodoxanollösning störde inte proteinextraktionen, och det extraherade proteinet var lämpligt för western blot-analys (figur 4C, D).
Fettvävnad innehåller stora mängder lipider, och lipidkontaminering i extraherade proteinprover hindrar mätning av proteinkoncentration. Nyligen har ett protokoll för att ta bort lipider från proteinextraktioner publicerats. I detta protokoll krävs en serie lågtemperaturcentrifugeringar, vilket är tråkigt och behöver en stor mängd utgångsmaterial19. I den aktuella studien antogs en förbättrad GTPC-metod15 för att isolera protein från BAT. Till skillnad från det klassiska GTPC-protokollet använde detta förbättrade GTPC-protokoll etanol, brom-klorpropan och vatten för att extrahera protein ur den organiska fasen. Våra data visade att protein isolerat med denna förbättrade GTPC-metod var kompatibelt med bicinchoninic acid assay (BCA) baserad proteinkoncentrationsmätning.
I det nuvarande BAs-isoleringsprotokollet placerades BAT- och digestionslösningsblandningen på is i en timme innan enzymdissociationsprocessen inleddes. Syftet med denna procedur är att minska cellmetabolismen och genuttryckshastigheten20, samt att låta matsmältningsenzymerna effektivt tränga in i den bruna fettvävnaden.
Den aktuella studien syftade till att utveckla en straitforward-metod för att isolera bruna adiopocyter från interskapulär BAT för genuttrycksstudie; emellertid kan kontaminering av vita adipocyter existera i de isolerade BA: erna. Detta beror på att interskapulär BAT ibland fästs med vit fettvävnad, som inte kan avlägsnas helt under BAT-beredningssteget. Det nuvarande protokollet kan inte separera BA från WAs baserat på celltäthet. Därför, om mycket hög renhet är avgörande, måste de isolerade BA: erna sorteras efter FACS innan de analyseras.
Den interskapulära BAT (iBAT) innehåller rikligt med klassiska BA som härrör från Myf5-cellinjen under embryonal utveckling21. Här användes iBAT som ett exempel för att isolera BA. I likhet med det publicerade protokollet12 kan vår metod också användas för att isolera beige celler från WAT. För att förvärva rena beige celler från WAT måste beigecellerna märkas med fluorescensprotein och berikas av FACS. Enligt vårt nuvarande protokoll kan de FACS-berikade beigecellerna användas för både gen- och proteinuttrycksanalys, vilket avsevärt förbättrar effektiviteten i användningen av biologiska material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Z. Lin stöddes av National Institutes of Health HL138454-01 och Masonic Medical Research Institute-medel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging |
References
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763 (2013).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cinti, S.
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
- Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
- Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
- Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
- Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
- Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
- Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
- Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
- Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).
