Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Geavanceerd hartritmebeheer door toepassing van optogenetische multi-site fotostimulatie in muizenharten

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62335
Automatic Translation
*1,2, *1, 8,9, 1,3,4,6, 8,9, 1,5,6,7
1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg
* These authors contributed equally

Summary

Dit werk rapporteert een methode voor het regelen van het hartritme van intacte muizen van transgene channelrhodopsine-2 (ChR2) muizen met behulp van lokale fotostimulatie met een micro-LED-array en gelijktijdige optische mapping van epicardiale membraanpotentiaal.

Abstract

Ventriculaire tachyaritmieën zijn wereldwijd een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit. Elektrische defibrillatie met behulp van hoogenergetische elektrische schokken is momenteel de enige behandeling voor levensbedreigende ventriculaire fibrillatie. Defibrillatie kan echter bijwerkingen hebben, waaronder ondraaglijke pijn, weefselschade en verslechtering van de prognose, wat wijst op een significante medische behoefte aan de ontwikkeling van zachtere strategieën voor het beheer van het hartritme. Naast energiereducerende elektrische benaderingen, werd cardiale optogenetica geïntroduceerd als een krachtig hulpmiddel om hartactiviteit te beïnvloeden met behulp van lichtgevoelige membraanionkanalen en lichtpulsen. In de huidige studie zal een robuuste en geldige methode voor succesvolle fotostimulatie van Langendorff doordrenkte intacte muizenharten worden beschreven op basis van multi-site pacing met een 3 x 3 array van micro-light-emitting diodes (micro-LED). Gelijktijdige optische mapping van epicardiale membraanspanningsgolven maakt het mogelijk om de effecten van regiospecifieke stimulatie te onderzoeken en evalueert de nieuw geïnduceerde hartactiviteit direct ter plaatse. De verkregen resultaten tonen aan dat de werkzaamheid van defibrillatie sterk afhankelijk is van de parameters die zijn gekozen voor fotostimulatie tijdens een hartritmestoornis. Er zal worden aangetoond dat het verlichte gebied van het hart een cruciale rol speelt voor het succes van beëindiging en hoe de gerichte controle van hartactiviteit tijdens verlichting voor het wijzigen van aritmiepatronen kan worden bereikt. Samenvattend biedt deze techniek de mogelijkheid om de manipulatie van het mechanisme ter plaatse te optimaliseren op weg naar real-time feedbackcontrole van het hartritme en, met betrekking tot de regiospecificiteit, nieuwe benaderingen om de potentiële schade aan het hartsysteem te verminderen in vergelijking met het gebruik van niet-specifieke elektrische schoktoepassingen.

Introduction

Vroege onderzoeken van de ruimtelijk-temporele dynamiek tijdens aritmie onthulden dat de complexe elektrische patronen tijdens hartfibrilleren worden aangedreven door vortexachtige roterende excitatiegolven1. Deze bevinding gaf nieuwe inzichten in de onderliggende mechanismen van aritmieën, wat vervolgens leidde tot de ontwikkeling van nieuwe elektrische beëindigingstherapieën op basis van multi-site excitatie van het myocard 2,3,4. Behandelingen met behulp van elektrische veldstimulatie zijn echter niet-lokaal en kunnen alle omliggende prikkelbare cellen innerveren, inclusief spierweefsel, wat cellulaire en weefselschade veroorzaakt, evenals ondraaglijke pijn. In tegenstelling tot elektrische therapieën bieden optogenetische benaderingen een specifieke en weefselbeschermende techniek voor het oproepen van cardiomyocytenactiepotentialen met een hoge ruimtelijke en temporele precisie. Daarom heeft optogenetische stimulatie het potentieel voor minimale invasieve controle van de chaotische activeringspatronen tijdens hartfibrilleren.

De introductie van het lichtgevoelige ionkanaal channelrhodopsine-2 (ChR2) in prikkelbare cellen via genetische manipulatie 5,6,7, maakte de depolarisatie van het membraanpotentiaal van exciteerbare cellen mogelijk met behulp van fotostimulatie. Verschillende medische toepassingen, waaronder de activering van neuronale netwerken, de controle van hartactiviteit, het herstel van het gezichtsvermogen en het gehoor, de behandeling van ruggenmergletsels en andere 8,9,10,11,12,13,14 zijn ontwikkeld. De toepassing van ChR2 in de cardiologie heeft een aanzienlijk potentieel vanwege de milliseconde responstijd15, waardoor het zeer geschikt is voor de gerichte controle van aritmische hartdynamiek.

In deze studie wordt multi-site fotostimulatie van intacte harten van een transgeen muismodel getoond. Samenvattend werd een transgene alfa-MHC-ChR2-muislijn opgericht in het kader van het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) en vriendelijk verstrekt door prof. S. E. Lehnart. Over het algemeen werden transgene volwassen mannelijke C57/B6/J, die Cre-recombinase onder controle van alfa-MHC tot expressie brachten, gekoppeld om te paren met vrouwelijke B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Omdat de cardiale STOP-cassette in de tweede generatie werd verwijderd, vertoonden de nakomelingen een stabiele MHC-ChR2-expressie en werden ze gebruikt om cardiale lichtgevoelige kolonies in stand te houden. Alle experimenten werden gedaan met volwassen muizen van beide geslachten op een leeftijd van 36 - 48 weken. De verlichting wordt bereikt met behulp van een 3 x 3 micro-LED-array, vervaardigd zoals beschreven in 16,17, behalve dat de op silicium gebaseerde behuizing en de korte optische glasvezels niet zijn geïmplementeerd. Het eerste gebruik in een cardiale toepassing wordt gevonden in18. Een lineaire micro-LED-array op basis van een vergelijkbare fabricagetechnologie is toegepast als een penetrerende sonde voor hartpacing19. De micro-LED's zijn gerangschikt in een 3 x 3 array met een pitch van 550 μm, wat zowel een hoge ruimtelijke resolutie als een hoog stralingsvermogen op een zeer klein gebied biedt. De auteurs demonstreren in dit werk een veelzijdige lokale multi-site fotostimulatie die het pad kan openen voor het ontwikkelen van nieuwe anti-aritmische therapiemethoden.

Het volgende experimentele protocol omvat een retrograde Langendorff-perfusie ex vivo, waarvoor de gecannuleerde aorta functioneert als perfusie-inlaat. Door de toegepaste perfusiedruk en de hartcontractie stroomt het perfusaat door de kransslagaders, die zich vertakken van de aorta. In het gepresenteerde werk wordt het hart doordrenkt met behulp van een constante drukopstelling die wordt bereikt door de perfusaatreservoirs te verhogen tot 1 m hoogte, wat overeenkomt met 73,2 mmHg, wat resulteert in een stroomsnelheid van 2,633 ± 0,583 ml / min. Twee soorten Tyrode's oplossing worden gebruikt als perfusaat tijdens het experiment. De oplossing van reguliere Tyrode ondersteunt een stabiel sinusritme, terwijl de oplossing van Low-K+ Tyrode wordt gemengd met Pinacidil om de inductie van aritmie in muizenharten mogelijk te maken. Het gebruik van een zeshoekig waterbad maakt de observatie van het hart door zes verschillende vlakke vensters mogelijk, waardoor de koppeling van verschillende optische componenten mogelijk is met minder vervorming door breking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten volgden strikt de dierenwelzijnsverordening, in overeenstemming met de Duitse wetgeving, lokale bepalingen en in overeenstemming met de aanbevelingen van de Federatie van Europese Verenigingen voor Proefdierwetenschappen (FELASA). De aanvraag voor goedkeuring van dierproeven is goedgekeurd door de verantwoordelijke dierenwelzijnsautoriteit en alle experimenten zijn gerapporteerd aan onze vertegenwoordigers voor dierenwelzijn.

1. Experimenteervoorbereiding en materialen

  1. Optische mapping setup
    OPMERKING: De optische opstelling en de elektrische opstelling worden weergegeven in figuur 1. Alle componenten die worden gebruikt in de optische en elektrische opstelling worden in detail vermeld in de tabel met materialen.
    1. Gebruik LED 1 en LED 2 voor inductie van aritmie en back-up defibrillatie. Kies hoogvermogen LED's met een golflengte λblauw in de buurt van 475 nm, wat de piek is van de excitatiegolflengte van ChR26. Om het optische spectrum verder te verkleinen, gebruikt u een 470 ± 20 nm bandpass filter.
      OPMERKING: In dit werk hebben LED 1 en LED 2 een typische stralingsstroom van 3,9 tot 5,3 W, volgens de datasheet20.
    2. Verlicht het epicardium voor optische mapping met een krachtige rode LED (LED 3 in figuur 1), die licht uitzendt met een middengolflengte van λrood = 625 nm en een stralingsstroom van 700 mW21. Het rode licht wordt gefilterd met een 628 ± 20 nm bandpass filter en gereflecteerd door een long pass dichroic mirror (DM) met een cutoff golflengte van λDM = 685 nm.
    3. Gebruik een emissiefilter met λfilter-cam = 775 ± 70 nm voor het cameradoel om alleen de fluorescentie-emissie van de hartactiviteit te registreren. Gebruik een snel objectief dat zeer geschikt is voor toepassingen bij weinig licht.
      OPMERKING: De frequentie van fibrillatie van een muizenhart varieert van 20 tot 35 Hz; gebruik daarom een camera die snel genoeg is om op te nemen met een frequentie van 1 tot 2 kHz, of zelfs hoger.
  2. Micro-LED-array
    OPMERKING: De micro-LED-arrays die hier worden toegepast, worden gerealiseerd met behulp van microsysteemverwerking zoals elders verder beschreven16,17.
    1. Spinlaag een 5 μm dikke polyimide (PI) laag op 4-inch silicium substraten (enkelzijdig gepolijst, 525-μm dik).
    2. Hard deze PI-laag uit bij een maximumtemperatuur van 450 °C onder een stikstofatmosfeer. Houd de maximumtemperatuur constant gedurende 10 minuten.
    3. Deponeer en patroon een beeldomkering fotoresist (PR) met behulp van ultraviolette (UV) lithografie en sputterafzetting een 250-nm dunne platina laag (Pt).
    4. Verdik deze Pt-gebaseerde metallisatie door een 1 μm dikke gouden (Au) laag te galvaniseren met het patroon PR als maskerende laag.
    5. Voordat u een tweede PI-laag spint, stelt u de wafer met de eerste PI-laag en de Au-gegalvaniseerde metallisatie bloot aan een zuurstofplasma dat het oppervlak van de PI-laag chemisch activeert.
    6. Hard de tweede PI-laag opnieuw uit bij 450 °C, breng UV-lithografie aan om een PR-laag te patroon en open de contactpads van de array voor de micro-LED-chips en de interfacing printed circuit board (PCB) door reactieve ionenets (RIE) met behulp van de patroon-PR als maskeringslaag.
      OPMERKING: In deze RIE-processtappen wordt aanbevolen om 200 W en 100 W gedurende respectievelijk 10 en 30 minuten toe te passen om de contactpadopeningen en de buitenvorm van de tweedimensionale (2D) micro-LED-array te definiëren.
    7. Strip de PR met oplosmiddelen en plasma-etsen. Verdikken de contactpads verder door een extra goudlaag van 6 μm dik te galvaniseren.
    8. Bevestig de micro-LED-chips aan de contactpads met behulp van een flip-chip bonder.
    9. Activeer het PI-oppervlak in een zuurstofplasma en vul de micro-LED-chips onder met een oplosmiddelvrije lijm. Laat de lijm vervolgens 12 uur uitharden bij 120 °C.
    10. Om de micro-LED-chips in te kapselen, voert u nog een plasmabehandeling uit met Argon en brengt u handmatig een dunne fluorpolymeerlaag aan. Laat deze laag voorharden bij 80 °C gedurende 1 uur.
    11. Breng siliconen handmatig aan als de laatste inkapselingslaag na blootstelling van de micro-LED-array aan een zuurstofplasma, dat wordt gebruikt om de siliciumhechting aan de onderliggende fluorpolymeerlaag te verbeteren. Hard de siliconenlaag uit bij 80 °C en 180 °C gedurende elk 1 uur. Deze laatste uithardingsstappen genezen ook de fluorpolymeerlaag volledig.
    12. Soldeer de contactpads van het PI-substraat aan een printplaat die stripconnectoren draagt voor interconnectie van de array met een extern instrumentarium. Bedek de soldeerpads op de printplaat met een lijm.
  3. Elektrische opstelling
    1. Gebruik elektroden die geschikt zijn voor het opnemen van een elektrocardiogram (ECG), bijvoorbeeld zilver/zilverchloride-elektroden of Monophasic Action Potential (MAP) elektroden en een ECG-versterker om de elektrische activiteit van het hart continu te controleren. Gebruik bovendien een geschikt acquisitieapparaat (AD) om alle verkregen elektrische signalen op te nemen.
    2. Kies een geschikte driver voor de krachtige LED's (LED 1, LED 2 en LED 3), die de maximale stroom die op elk apparaat wordt toegepast, kan beheren. Gebruik een arbitrary function generator (AFG) om de output van de LED-drivers nauwkeurig te regelen.
    3. Gebruik een meerkanaals LED-stuurprogramma om de stroom te regelen die door de micro-LED-array stroomt. Een AFG met meerdere uitgangen is ook geschikt voor deze taak.
      OPMERKING: Het is raadzaam om LED-stuurprogramma's te kiezen die de stroom beperken tot de maximale stroom van de micro-LED, anders kunnen de diodes beschadigd raken. Een voorbeeld van een meerkanaals micro-LED-driver wordt beschreven in een ander werk18. Indien nodig kan de AFG of een ander LED-stuurprogramma op een computer worden aangesloten om de micro-LED-instellingen op afstand te bedienen. Als dit het geval is, sluit u het LED-stuurprogramma aan op de computer met het communicatieprotocol van uw keuze, bijvoorbeeld General Purpose Interface Bus (GPIB) of een seriële verbinding.

   

2. Experimentele procedures

  1. Oplossingsvoorbereiding
    1. Bereid de oplossing van Tyrode: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 24 mM NaHCO3, 1,8 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 5,6 mM Glucose, 0,1% BSA/Albumine.
    2. Bereid Low-K+ Tyrode's oplossing: Low-K+ Tyrode's wordt op dezelfde manier gemaakt als de oplossing van gewone Tyrode, behalve dat slechts de helft van de hoeveelheid KCl wordt toegevoegd (2 mM in plaats van 4 mM KCl).
      OPMERKING: Voor een experiment van 3 uur zijn meestal 2-3 L Low-K+ Tyrode's (bovendien gemengd met Blebbistatin (stap 2.1.5) als optische mapping wordt uitgevoerd) en 1-2 L reguliere Tyrode's voldoende.
    3. Voeg Pinacidil toe aan de Low-K+ Tyrode-oplossing om het proces van aritmie-inductie, zoals beschreven in22, te vergemakkelijken om een concentratie van 100 mM te verkrijgen. Draag beschermende laboratoriumhandschoenen bij het hanteren van Pinacidil.
    4. Bereid 1 ml 50 μM DI-4-ANBDQPQ met de reguliere oplossing van Tyrode. Bescherm de kleurstof tegen licht om fotobleaching te voorkomen.
    5. Maak een 10 mM stockoplossing van Blebbistatin. Meng voor optische mapping Blebbistatin met de 100 mM Pinacidil-Tyrode's-oplossing (stap 2.1.3) om een 5 μM-oplossing te verkrijgen. Draag beschermende laboratoriumhandschoenen bij het hanteren van Blebbistatin.
      OPMERKING: Houd zowel de kleurstof als de Blebbistatin-oplossing opzij totdat de optische mapping begint.
  2. Langendorff perfusie
    OPMERKING: De opstelling bestaat uit twee reservoirs voor de twee oplossingen van Tyrode. Ze zijn verbonden met een bellenvanger via buizen met drieweg hanen. Het hart wordt later aan de bellenvanger bevestigd door een Luer-slotconnector en wordt vervolgens opgehangen in een zeshoekig waterbad. Het waterbad is op zijn beurt verbonden met een afvalcontainer om de gebruikte Oplossing van Tyrode op te vangen.
    1. Reinig alle buizen voor elk experiment met volledig gedemineraliseerd water.
    2. Belucht beide oplossingen van Tyrode met Carbogen (5% CO2 en 95% O2) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voordat het experiment begint. Stel de pH-waarde van de oplossingen van de Tyrode in op 7,4 met NaOH.
    3. Vul 500 ml van de oplossing van elke Tyrode in het overeenkomstige reservoir en ontlucht de buizen en de bellenvanger door de oplossing van Tyrode door het perfusiesysteem te laten lopen totdat er geen opgesloten luchtbellen meer worden gezien in de buizen of in de bellenvanger.
    4. Blijf de oplossingen van Tyrode beluchten tijdens het hele experiment in de reservoirs met Carbogen om ervoor te zorgen dat de pH van het perfusaat later tijdens de perfusie stabiel blijft.
    5. Verwarm het perfusiesysteem tot 37 °C met een waterwarmtepomp. Houd de perfusaattemperatuur constant in het waterbad door een extra verwarmingselement te gebruiken, zoals een waterdichte verwarmingskabel.
      OPMERKING: Tijdens het experiment is het cruciaal om de reservoirs van de Tyrode opnieuw te vullen voordat ze leeg raken. Anders kunnen luchtbellen het hart binnendringen, wat de bloedvaten kan verstoppen en tot ischemie kan leiden.
  3. Muis voorbereiding
    1. Injecteer subcutaan 0,1 ml 500 D.w.z. heparine 30 minuten vóór de hartisolatieprocedure.
    2. Vul een petrischaaltje van 6 cm en een spuit van 2 ml met ijskoude Tyrode-oplossing. Plaats onder de stereoscopische microscoop.
    3. Voer korte anesthesie van muizen uit door een verzadigde Isofluraan-omgeving gedurende 2 minuten en onmiddellijke cervicale dislocatie daarna.
      OPMERKING: Om voldoende anesthesie te controleren, is een controle op de negatieve interteenreflex absoluut noodzakelijk.
    4. Open de borst, verwijder het hart, zoals elders beschreven23, en plaats het in de petrischaal van 6 cm met ijskoude Tyrode-oplossing. Hartkloppingen zullen worden verminderd als gevolg van temperatuurdaling.
    5. Doe de fijne bereiding onder een stereoscopische microscoop, zoals elders beschreven23. Bevestig de aorta op de stompe naald en bevestig het vat met hechtmateriaal.
    6. Injecteer als controle de oplossing van ijskoude Tyrode door de naald in het hart en controleer of het hart stevig is gemonteerd. Deze stap spoelt ook het resterende bloed uit het hart.
    7. Breng het gemonteerde hart over naar het perfusiesysteem. Zorg ervoor dat het perfusaat stroomt om te voorkomen dat lucht het hart binnendringt terwijl de naald wordt verbonden met de bellenvanger. Controleer of het hart bedekt is met de oplossing van Tyrode in het waterbad. De stappen 2.3.4, 2.3.5 en 2.3.7 zijn geïllustreerd in figuur 2.
    8. Zorg ervoor dat het hart binnen een paar minuten begint te kloppen. Laat het hart zich gedurende 15 tot 20 minuten aanpassen aan de perfusie-opstelling en schakel vervolgens over naar low-K+ Tyrode's oplossing met Pinacidil (Stap 2.1.3) respectievelijk low-K+ Tyrode's oplossing met Pinacidil en Blebbistatin (Stap 2.1.5) als optische mapping moet worden uitgevoerd.
  4. Inductie van aritmie en optische defibrillatie
    1. Plaats een van de ECG-elektroden zo dicht mogelijk bij het hartoppervlak om een goede signaalkwaliteit te garanderen. Hang de tweede ECG-elektrode op in de oplossing van tyrode. Zorg ervoor dat het verkregen ECG wordt geregistreerd door het AD van keuze.
    2. Plaats de micro-LED-array op het interessegebied van het onderzoek, bijvoorbeeld op de linker ventrikel.
    3. Verander de perfusie naar low-K+ Tyrode's met Pinacidil en perfuseer het hart gedurende 15 tot 30 minuten.
    4. Om aritmie te induceren, verlicht u het hart met LED 1 en LED 2 met een trein van 20 tot 50 lichtpulsen met een frequentie find van 25 tot 35 Hz, pulsduur Wind van 2 tot 15 ms en lichtintensiteit LIopt_ind van 2,8 mW mm-2.
    5. Herhaal het proces totdat aritmie is geïnduceerd.
      OPMERKING: Aritmieën zijn gemakkelijk te identificeren in het ECG-signaal omdat de frequentie en morfologie van het signaal verschillen van het normale sinusritme. Als de aritmie binnen de volgende 5 s eindigt, classificeer het dan als zelf-beëindigd en start een nieuwe inductiepoging.
    6. Zodra een aanhoudende aritmie visueel is gedetecteerd, past u een uitbarsting van pulsen toe met verschillende breedtes Wdef en frequenties fdef, met behulp van drie, zes of negen micro-LED's van de array bij een pulserende stroomI-puls van 15 mA die resulteert in een lichtintensiteit LIμLED = 33,31 ± 2,05 mW mm-2.
    7. Als de aritmie doorgaat na vijf micro-LED array-gebaseerde defibrillatiestudies, classificeer de poging dan als mislukt en start back-up defibrillatie.
    8. Gebruik voor back-updefibrillatie LED 1 en LED 2 met dezelfde timingparameters als ingesteld voor de micro-LED-array.
      OPMERKING: Omdat het hart gedurende de hele experimentele periode wordt blootgesteld aan ischemische en metabole stress, is het mogelijk dat beëindigingspogingen van aritmie niet succesvol zijn, zelfs met back-updefibrillatie. Wanneer dit gebeurt, verander dan de perfusie-oplossing in de reguliere Tyrode's en laat het hart gedurende 5 tot 10 minuten herstellen. Wanneer het ECG terugkeert naar het sinusritme, herhaalt u het protocol uit stap 2.4.3 opnieuw.
  5. Optische mapping
    1. Perfuseer het hart met de Blebbistatin-oplossing bereid in stap 2.1.5 en wacht tot mechanische ontkoppeling optreedt. Dit wordt bereikt wanneer het hart stopt met kloppen, maar een ECG-signaal nog steeds meetbaar is.
      OPMERKING: Door de Blebbistatine-oplossing in de genoemde concentratie te mengen en het hart met deze oplossing doordrenkt te houden, blijft de cardiale mechanische activiteit tijdens het hele experiment losgekoppeld van de elektrische activiteit.
    2. Geef de 1 ml spanningskleurstof DI-4-ANBDQPQ (bereid in stap 2.1.4) als een bolus in de bellenvanger van de Langendorff-perfusie. Wacht 5 tot 10 minuten om de kleurstof gelijkmatig in het hart te laten doordringen.
      OPMERKING: Voorkom fotobleaching van de kleurstof door het rode licht uit te schakelen wanneer er geen opname wordt gemaakt. Als de signaal-ruisverhouding van de opname te klein wordt (het verkregen signaal is te luidruchtig), herhaalt u stap 2.1.4 en 2.5.2.
    3. Richt de camera op het hartoppervlak, schakel LED 3 in en pas 1,27 mW mm-2 optisch vermogen toe.
    4. Doe de laboratoriumverlichting uit en begin met opnemen. Zorg ervoor dat een optisch signaal wordt verkregen door de frequentie van het verkregen signaal te vergelijken met de frequentie van het opgenomen ECG. Dit zorgt ervoor dat het verkregen optische signaal puur gerelateerd is aan de elektrische activiteit van het hart.
      OPMERKING: Aangezien het fluorescentielicht dat door de kleurstof wordt uitgestraald zeer week is, wordt optische mapping gedaan in een donkere kamer. Dit voorkomt signaalinterferentie van andere lichtbronnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het protocol maakt de inductie van ventriculaire aritmieën in intacte muizenharten mogelijk met behulp van fotostimulatiepulsen gegenereerd door LED 1 en LED 2 (figuur 1) met eenfrequentie tussen 25 Hz en 35 Hz en een pulsduur Wind tussen 2 ms en 10 ms. Houd er rekening mee dat het doel van dergelijke snelle lichtpulsen niet is om het hartritme vast te leggen, maar eerder om de hartactiviteit uit balans te brengen, zodat grillige elektrische golven kunnen worden gegenereerd, die vervolgens een aritmie vergemakkelijken. Het voordeel van het induceren van aritmie met licht over inductie met elektrische stimulatie is dat er geen artefacten worden uitgelokt in het ECG, wat de mogelijkheid biedt om het verworven signaal zonder beperkingen te analyseren en zelfs de elektrische reactie van het hart te evalueren tijdens snelle pacing, dit feit biedt ook de mogelijkheid om het hartgedrag tijdens foto-defibrillatie te observeren. Dit is niet mogelijk met elektrische inductie- of defibrillatiemethoden. Niettemin, als de gebruikte opstelling het gebruik van externe high-power LED's niet toestaat, bijvoorbeeld vanwege plaatsbeperkingen, kan een extra pacing-elektrode op het hart worden geplaatst om aritmie te induceren, zoals elders getoond 3,22,24.

Zodra fibrillatie is geïnduceerd, moet de aritmie ten minste 5 seconden duren om ervoor te zorgen dat deze aanhoudt, waarna de micro-LED-gebaseerde defibrillatiepogingen worden gestart. Aangezien de belangrijkste parameters van hartritmestoornissen, zoals basiscycluslengte of dominante frequentie, amplitude en morfologie, voortdurend veranderen en omdat het up-to-date niet mogelijk is om te voorspellen welke fotodefibrillatieparameters het beste resultaat bieden, was het van groot belang om te begrijpen of er een relatie is tussen de frequentie, pulsbreedte, gebied van fotostimulatie en afgiftetarief. Daarom werd een reeks experimenten met verschillende frequenties fdef, aantal micro-LED's en pulsduur Wdef getest en werd het slagingspercentage voor N = 11 muizen geëxtraheerd, zoals weergegeven in figuur 3.

Er kan worden aangetoond dat pulsen met een duur van 1 tot 20 ms kunnen defibrilleren met verschillende slagingspercentages (figuur 3). Aangezien de lichtintensiteit LIμLED constant werd gehouden tijdens elke fotostimulatiepuls, zoals vermeld in stap 2.4.6, en het slagingspercentage van drie micro-LED's tegen negen aanzienlijk lager is, suggereren de gepresenteerde resultaten dat het gebied dat op het hart wordt bedekt, het aantal micro-LED's en dus de totale toegepaste stralingsflux cruciale factoren zijn bij het bereiken van defibrillatie. Gezien het feit dat elke micro-LED op de array een Lambertiaanse lichtbron is en dat ze direct op het oppervlak van het hart worden geplaatst, zodat de geschatte afstand tot het weefsel nul is, kan worden aangenomen dat de bestralingscontour van het verlichte gebied op het hart bij gebruik van een enkele micro-LED gelijk is aan AμLED = 0,059 mm², zoals ook weergegeven in25 voor platte rechthoekige LED's. Bovendien, hoewel sommige fotonen de micro-LED zijdelings vanaf de randen kunnen verlaten, wordt de bijdrage daarvan aan de totale lichtintensiteit als zo klein beschouwd dat hun effect kan worden verwaarloosd. Om het bestraalde licht van de array te kwantificeren, maten de auteurs de stralingsflux van de micro-LED-array met een commerciële vermogensmeter en berekenden ze de lichtintensiteit die het hart bereikt, zoals weergegeven in tabel 1. Uit tabel 1 kan ook worden afgelezen dat de stralingsflux toeneemt met het aantal gebruikte micro-LED's, maar dat de lichtintensiteit constant blijft door de eerder genoemde implicaties van het verlichtingsprofiel.

Interessant is dat ook kan worden waargenomen dat het slagingspercentage van negen LED's met Wdef = 1 ms (figuur 3a) en Wdef = 20 ms (figuur 3d) bij een defibrillatiefrequentie fdef = 18 Hz en fdef = 20 Hz vergelijkbaar hoog zijn. Gezien het feit dat de gemiddelde frequentie van de geïnduceerde aritmieën 22,55 ± 4,03 Hz is, kan dit feit erop wijzen dat voor ChR2-muizenharten het slagingspercentage aanzienlijk toeneemt naarmate de pacingfrequentie dichter bij de aritmiefrequentie ligt. Dit blijkt ook uit numerieke simulaties26. Dit kan echter niet gemakkelijk worden gegeneraliseerd omdat de dominante frequentie van complexe aritmieën voortdurend verandert. Om dit te illustreren toont figuur 4 twee verschillende defibrillatiepogingen met fdef = 14 Hz.. Aan het begin van het ECG-segment in figuur 4a) en volgens de morfologie van het ECG-signaal wordt een ventriculaire fibrillatie (VF) getoond. Wanneer de micro-LED-fotostimulatie begint, wordt het fibrillatie omgezet in een meer geordende patroon dat eerder een ventriculaire tachycardie (VT) is. Wanneer de micro-LED-array wordt uitgeschakeld, nemen de oorspronkelijke chaotische VF-golven het weer over. De aritmie wordt dus niet beëindigd. Hoewel in dit voorbeeld de VF niet kan worden beëindigd met de gegeven parameters, wordt deze wel verstoord en kan deze worden gewijzigd in een meer regelmatig patroon (VT). Figuur 4b Segment 1 laat zien dat de dominante frequentie van 24 Hz iets toeneemt totdat de fotostimulatie begint en de VF in Segment 2 wordt omgezet in een VT, waar de dominante frequentie daalt tot 14 Hz. Verder toont figuur 4c een VT die kan worden beëindigd met dezelfde fdef als in figuur 4a, maar met een andere Wdef. Ten eerste verandert de micro-LED-fotostimulatie de morfologie van de aritmie, om deze uiteindelijk te beëindigen met 1:1 pacing-opname vanaf de19e puls. Deze resultaten kunnen impliceren dat de fotodefibrillatieparameters, bijvoorbeeld Wdef, zich moeten aanpassen aan de morfologische verandering van de aritmie in de loop van de tijd. De experimenten die tot deze resultaten leidden, werden uitgevoerd zonder Blebbistatine te gebruiken vanwege de resulterende verandering in actiepotentiaalduur (APD)27. Daarom werd in deze series geen optische mapping uitgevoerd.

Een andere reeks experimenten werd uitgevoerd voor optische mapping met behulp van de rood verschoven potentiometrische kleurstof (stap 2.1.4). Optische mapping met hogesnelheidscamera's maakt het mogelijk om zich voortplantende excitatiegolven op het oppervlak van het hart te observeren tijdens sinusritme (figuur 5) en complexe tachyaritmieën28. Omdat de fractionele verandering van de potentiometrische kleurstof zeer laag is, werden de verkregen video's nabewerkt met behulp van een wiskundige programmeertaal. De eerste stap om de kwaliteit van de optische signalen te verbeteren, is het verwijderen van ruis met een Gaussisch afvlakfilter met een standaarddeviatie van σ = 1, gevolgd door een bandpassfilter met hoekfrequenties fhoog = 0,1 Hz en flaag = 70 Hz. De stopband bij fhoog verwijdert langzame veranderingen in het signaal die niet gerelateerd zijn aan de sinusfrequentie van het hart die tussen 3 Hz < fsinus < 8 Hz ligt, terwijl de stopband flaag hoogfrequente ruis verwijdert die door de camera wordt opgevangen. Het is belangrijk op te merken dat zowel blauwlichtemissies van LED 1, LED 2 als van de micro-LED-array crosstalk en een zeer hoog interferentiesignaal in optische mapping kunnen veroorzaken. Bovendien werd waargenomen dat zelfs een zeer smal bandpassfilter voor de camera, met golflengte λfilter-cam, zoals vermeld in stap 1.2.3, de invloed van het blauwe licht niet zou filteren. Dit kan deels worden veroorzaakt door de excitatierespons van de kleurstof zelf. Wees daarom heel voorzichtig bij het kiezen van de optiek voor optische mapping. Voor de middelen van video-analyse moesten alle frames waarin blauw licht is opgenomen worden verwaarloosd zodat het in veel gevallen niet mogelijk is om het hart te visualiseren tijdens fotostimulatie, zoals ook vermeld in een ander onderzoek29.

Figure 1
Figuur 1: Schema van de elektrische en optische opstelling. (a) LED 1 en LED 2 bieden een blauwe lichtbron die wordt gebruikt voor inductie van aritmie en back-updefibrillatie. LED 3 wordt gebruikt als excitatielichtbron voor de rood verschoven kleurstof DI-4-ANBDQPQ. Het rode licht wordt naar het hart gericht door middel van de dichroïsche spiegel DM. Het in donkerrood weergegeven emissielicht wordt door de hogesnelheidscamera geregistreerd door een emissiefilter, zoals vermeld in de tekst. LED 2- en ECG-elektroden worden niet voor de eenvoud getoond. b) Eén segment van het opgenomen ECG-signaal dat in het rood wordt weergegeven. Donkerblauw toont de lichtpulsen van LED 1 en LED 2 met een frequentie find = 35 Hz en Wind = 4 ms die wordt gebruikt om fibrillatie te induceren. Onmiddellijk na het beëindigen van de lichtprikkel kan ventriculaire fibrillatie (VF) worden waargenomen. De micro-LED-gebaseerde fotostimulatie weergegeven in lichtblauw (fdef = 16 Hz, Wdef = 20 ms) beëindigt met succes de aritmie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Hartvoorbereiding. (a) Open borst van een muis met het intacte hart en de omliggende organen. b) Gexplant hart ondergedompeld in ijskoude Tyrode-oplossing voor verdere bereiding. (c) Muishart correct bevestigd aan een stompe naald. d) Muizenhart gesuspendeerd in de oplossing van Tyrode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Experimenteel geëxtraheerde slagingspercentages. Succespercentages voor 30 micro-LED-gebaseerde fotostimulatiepulsen met behulp van drie, zes en negen LED's met verschillende pulsduur Wdef en frequenties fdef voor N = 11. Foutbalken weergegeven met standaardfout van gemiddelde S.E.M. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Manipulatie van het hartritme door middel van fotostimulatie. (a) Segment van een ECG-opname van een niet-beëindigde aritmie. b) Spectrogram van het ECG in paneel a. De vermogensspectrale dichtheid (PSD) van segment (1) vertoont een aritmie met een dominante frequentie van 24 Hz. Segment (2) fotostimulatie met de getoonde parameters. Er kan worden waargenomen dat de dominante frequentie daalt tot 14 Hz. Segment (3) Mislukte beëindiging en terugkeer naar aritmisch gedrag met een dominante frequentie van 24 Hz. (c) ECG van een succesvolle defibrillatiepoging. d) Spectrogram van de succesvolle beëindiging weergegeven in paneel c. Segment (1) toont een ventriculaire tachycardie (VT) met een dominante frequentie van 23 Hz. Segment (2) fotostimulatie met behulp van de getoonde instellingen. Segment (3) geeft een succesvolle beëindiging weer, wat leidt tot een normaal sinusritme met een fundamentele frequentie van 3,5 Hz en de resulterende harmonischen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Optische mapping van het hele hart. De verandering van fluorescentie-intensiteit tijdens een enkele slag van het hart in normaal sinusritme wordt getoond. Het hart was naar de camera gericht, zodat de rechter- en linkerkamer zichtbaar zijn (RV, LV). Het sterretje toont de pixel waarop het actiepotentiaal dat bovenaan wordt weergegeven, is uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aantal microLED Bestraald gebied Aμled [mm2] Stralingsflux φ [mW] Lichtintensiteit LI [mW mm-2]
3 0.178 5,9 ± 0,47 33,11 ± 2,66
6 0.356 11,91 ± 0,84 33,42 ± 2,37
9 0.535 17,85 ± 0,61 33,39 ± 1,14

Tabel 1: Gemeten stralingsstroom van de micro-LED-array en de bijbehorende lichtintensiteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een succesvolle behandeling van cardiale tachyaritmieën is de sleutel tot harttherapie. De biofysische mechanismen die ten grondslag liggen aan aritmie-initiatie, -bestendiging en -beëindiging zijn echter niet volledig begrepen. Daarom is cardiaal onderzoek gericht op het optimaliseren van elektrische schoktherapie naar een zachtere beëindiging van aritmieën, waardoor de kwaliteit van leven van patiënten 28,29,30,31 wordt verhoogd. Elektrische benaderingen met lage energie beloven een aanzienlijke vermindering van ernstige bijwerkingen, maar kunnen nog steeds ongewenste spierexcitaties veroorzaken. Cardiale optogenetica zou deze beperking kunnen overwinnen en niet alleen een weefselvriendelijke beëindigingstechniek kunnen bieden, maar ook een flexibel platform om de aritmiespecifieke gerichte controle van vortexachtige excitatiegolven in het intacte muizenhart en in celculturen te onderzoeken32,33.

Gezien die motivatie werden een robuuste fotostimulatie-instelling en een protocol ontworpen en geïmplementeerd, beide met een zeer aanpasbaar optisch systeem, dat gemakkelijk kon worden uitgebreid tot driedimensionale panoramische optische mappingstudies34.

Er kan worden aangetoond dat hartritmestoornissen met succes kunnen worden beëindigd met verschillende slagingspercentages, afhankelijk van de parameters die worden gekozen voor fotostimulatie, bijvoorbeeld het verlichte gebied op het hart. De gepresenteerde resultaten suggereren dat het vergroten van het bestraalde oppervlak een kritisch aantal cardiomyocyten rekruteerde die de chaotische activiteit doofden door geleidingsblok zoals ook aangetoond in22. In deze studie is de energie die nodig is om fotodefibrilleren E = 10,69 ± 0,37 mJ (met behulp van negen micro-LED's, 30 pulsen en pulsbreedte Wdef = 20 ms). Dit blijkt lager te zijn dan eerder gemeld in 22,24 met E22 = 228,8 mJ en E24 = 153,6 mJ, waar respectievelijk een groter gebied22 of het hele hart24 werden verlicht. Niettemin, in vergelijking met de benadering getoond in 35, waar een goed afgebakend patroongebied wordt verlicht met 10 fotodefibrillatiepulsen resulterend in E35 = 1,8 mJ, is de fotodefibrillatie-energie in de huidige studie aanzienlijk hoger. In tegenstelling tot de drie andere benaderingen kon met het gepresenteerde protocol geen slagingspercentage van meer dan 90% worden bereikt. Een mogelijke reden voor de verminderde prestaties ondanks een hogere fotodefibrillatie-energie zou kunnen zijn dat de complexiteit van de onderliggende aritmie niet wordt overwogen. Met betrekking tot de resultaten gepresenteerd in 35, waar een hoge afgiftesnelheid wordt bereikt door een klein gebied op het hart te verlichten en tegelijkertijd de ruimtelijk-temporele dynamiek van een aritmie te meten, kan de gepresenteerde benadering zeker verder worden verbeterd door feedback-controle te overwegen, die reageert met een ander patroon van micro-LED-verlichting, afhankelijk van de huidige toestand van het hart.  Bovendien werd ook aangetoond dat hoewel aritmieën niet altijd kunnen worden beëindigd met de huidige methode, de intrinsieke complexe dynamiek tijdens fotostimulatie kan worden verstoord, wat leidt tot een meer geordende temporele toestand. Zoals getoond in36, is de afgiftesnelheid significant anders bij het aanpakken van monomorfe (meer geordende) en polymorfe (minder geordende) aritmieën. Vandaar dat de logische stap naar een betere defibrillatiesnelheid zou kunnen zijn om de hartdynamiek tijdens een VF-episode te beïnvloeden, de aritmie in een minder complex patroon te veranderen en te eindigen met een andere reeks pulsen, waarbij op deze manier een tweestaps fotostimulatiebenadering wordt opgebouwd.

Met betrekking tot het perfusieprotocol worden de meest kritische stappen gevonden in de juiste extractie en voorbereiding van het hart en in de juiste aanpassing van de optische mappingoptiek. Het gebruik van optische mapping vereist strikt de juiste selectie van kleurstofspectra, geschikte excitatielichtbronnen en goed gekozen optische filters voor de camera29. Anders kunnen de opgenomen optische signalen te luidruchtig zijn en ook cross-talk van fotostimulatie met kleurstofexcitatie bevatten. Latere analyse zou daarom nabewerking van signalen met verschillende analytische filters en beeldafvlakking vereisen, wat vaak tot verslechtering leidt.

Een andere cruciale stap in dit protocol is de juiste en nauwkeurige plaatsing van de micro-LED array. Omdat de verbindingskabel tussen de micro-LED-array en de driver erg dun en flexibel is, is het soms een uitdaging om ervoor te zorgen dat de array zich voor elk experiment op ongeveer dezelfde locatie op het hartoppervlak bevindt. Om de positionering te vergemakkelijken en de verworven positie van de micro-LED-array te bevestigen, werd een houder ontworpen en geprint in 3D, waardoor de array aan een micromanipulator kon worden bevestigd. Dit geeft meer controle over de beweging van de array in de Oplossing van tyrode. Afhankelijk van het gekozen materiaal voor het verbindingssnoer van de micro-LED-array, is het gebruik van een houder mogelijk niet nodig.

Trouwens, een andere kritieke stap van het protocol is de toevoeging van pro-aritmie medicijnen, zoals bijvoorbeeld Pinacidil37. Aangezien verschillende chemische verbindingen bekend staan om het veranderen van de fysiologische reactie van het hart, moet hiermee rekening worden gehouden bij het analyseren en interpreteren van de resultaten. Wat optische mapping betreft, gebruikt het voorgestelde protocol Blebbistatin als een mechanische ontkoppelaar. Dit heeft het voordeel dat bewegingsartefacten tijdens het opnemen worden verwijderd, maar het kan ook de APD27 verlengen. Om dit nadeel te ondervangen, kan het analyseren van methoden voor het volgen van bewegingen tijdens de opname worden beschouwd als38,39. Op deze manier zou de normale fysiologische toestand van het hart behouden blijven en kan een signaal van hoge kwaliteit worden verkregen.

Hoewel het bewezen is dat het gepresenteerde protocol kan worden gebruikt voor multi-site foto-defibrillatie, heeft het nog steeds enkele beperkingen. Het is gebleken dat fibrillatie in sommige gevallen niet kan worden beëindigd door de op micro-LED gebaseerde fotostimulatie, maar alleen kan worden verstoord, wat resulteert in frequentieveranderingen. Een hypothese is dat de meanderende golven op het hart alleen uit de linker ventrikel worden verplaatst en zichzelf in andere delen van het hart regenereren. In vergelijking met andere methoden zoals globale verlichting24, biedt de huidige methode een lager slagingspercentage vanwege een kleinere dekking van het hart. We zijn er echter van overtuigd dat met de juiste hardwaregebaseerde herkenningsmethode van spiraalactiviteit, verbetering van het slagingspercentage van beëindiging haalbaar is.

Kortom, het gepresenteerde fotostimulatiesysteem vormt een krachtig experimenteel hulpmiddel voor meerdere cardioversiebenaderingen en manipulatiestudies van hartritmestoornissen. De kennis die in dit systeem wordt geleerd, zal worden gebruikt om nieuwe potentiële (foto)defibrillatieprotocollen in klinisch relevante grote diermodellen te onderzoeken en te evalueren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Acknowledgments

De auteurs willen Marion Kunze en Tina Althaus bedanken voor hun uitstekende technische ondersteuning tijdens experimenten. Het onderzoek dat tot de resultaten heeft geleid, heeft financiering ontvangen van het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap FP7/2007-2013 onder subsidieovereenkomstnummer HEALTH-F2-2009-241526. Ondersteuning werd ook geboden door het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek, DZHK e.V. (Project MD28), partnersite Goettingen, de Duitse Onderzoeksstichting CRC 1002 (project C03) en de Max Planck Society. Dit werk werd mede ondersteund door BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence gefinancierd door de Duitse Research Foundation (DFG, subsidienummer EXC 1086).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical Components
Blebbistatin TargetMol T6038 10 mM stock solution
BSA/Albumin Sigma-Aldrich A4919
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Carbogen Westfalen 50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ AAT Bioquest 21499 Dye for Optical Mapping
Glucose Sigma-Aldrich D9434 C6H12O6
Heparin LEO Pharma Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid Merck 1.09057.1000 HCl, 1 M stock solution
Isoflurane CP Pharma 1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride Merck 8.14733.0500 MgCl2
Monopotassium Phosphate Sigma-Aldrich 30407 KH2PO4
Pinacidil monohydrate Sigma-Aldrich P154-500mg 10 mM stock solution
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 KCl
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 NaCl
Sodium Hydroxide Merck 1.09137.1000 NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150 Biopac Systems MP150WSW data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C Biopac Systems ECG100C Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable RMS Heating System HK-5,0-12 Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply Thorlabs KPS101 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver Thorlabs LEDD1B T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode Hugo Sachs Elektronik BS4 73-0200 Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG Agilent Instruments A-2230 Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator Agilent Instruments A-2230 AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue Epoxy Technology EPO-TEK 353ND Two component epoxy
Fluoropolymer  Asahi Glass Co. Ltd. Cytop 809M Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist Merck KGaA AZ 5214E Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip  Cree Inc. C460TR2227-S2100 Blue micro-LED
Photoresist Merck KGaA AZ 9260 Thick Positive Photoresists
Polyimide UBE Industries Ltd. U-Varnish S Polyimide Solution
Silicone NuSil Technology LLC MED-6215 Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive John P. Kummer GmbH Epo-Tek 301-2 Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter Chroma Technology Corporation ET470/40x Blue excitation filter
Camera Photometrics Cascade 128+ High performance EMCCD Camera
Camera Objective Navitar DO-5095 Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror Semrock FF685-Di02-25x36 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter Semrock FF01-775/140-25 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink Advanced Thermal Solutions ATSEU-077A-C3-R0 Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2 LED Engin Osram LZ4-00B208 High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3 Thorlabs M625L3 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses LED Engin Osram LLNF-2T06-H LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter Thorlabs S120VC Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter
Red Filter Semrock FF02-628/40-25 BrightLine® single-band bandpass filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
  2. Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
  3. Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
  4. Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  6. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  7. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  8. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
  9. Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
  10. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  11. Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
  12. Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
  13. Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
  14. Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
  15. Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
  16. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. 36th Annual Internation Conference IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Chicago, IL, , 5252-5255 (2014).
  17. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. 28th IEEE Proceedigns. MEMS, Estoril, , 162-165 (2015).
  18. Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light - From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. 40thAnnual International Conference of IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Honolulu, HI, , 4832-4835 (2018).
  19. Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
  20. mouser.de, LED Engin, [Online]. , Available: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208- 1531969.pdf (2020).
  21. thorlabs.com, thorlabs, [Online]. , Available: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020).
  22. Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
  23. Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
  24. Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
  25. Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
  26. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Computing in Cardiology, Belfast, , 345-348 (2010).
  27. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
  28. Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
  29. O'Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping - Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
  30. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
  31. Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
  32. Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
  33. Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
  34. Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
  35. Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
  36. Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
  37. Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
  38. Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
  39. Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).

Tags

Geneeskunde cardiale optogenetica optische mapping LED DI-4-ANBDQPQ Blebbistatin channelrhodopsin-2 ChR2
Geavanceerd hartritmebeheer door toepassing van optogenetische multi-site fotostimulatie in muizenharten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diaz-Maue, L., Steinebach, J.,… More

Diaz-Maue, L., Steinebach, J., Schwaerzle, M., Luther, S., Ruther, P., Richter, C. Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (174), e62335, doi:10.3791/62335 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter