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Bioengineering

Assemblaggio a temperatura controllata e caratterizzazione di un bistrato di interfaccia a goccia

Published: April 19, 2021 doi: 10.3791/62362
Automatic Translation
1, 1
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee

Summary

Questo protocollo descrive in dettaglio l'uso di un sistema di riscaldamento a temperatura controllata a retroazione per promuovere l'assemblaggio monostrato lipidico e la formazione di bistrati di interfaccia a goccia per lipidi con temperature di fusione elevate e misurazioni della capacità per caratterizzare i cambiamenti guidati dalla temperatura nella membrana.

Abstract

Il metodo di battiscopi di interfaccia a goccia (DIB) per assemblare bistrati lipidici (cioè DIB) tra goccioline acquose rivestite di lipidi nell'olio offre vantaggi chiave rispetto ad altri metodi: i DIB sono stabili e spesso di lunga durata, l'area bistrato può essere sintonizzata in modo reversibile, l'asimmetria del foglio illustrativo è prontamente controllata tramite composizioni di goccioline e reti tissutali di bistrati possono essere ottenute confinando con molte goccioline. La formazione di DIB richiede l'assemblaggio spontaneo di lipidi in monostrati lipidici ad alta densità sulle superfici delle goccioline. Mentre questo si verifica prontamente a temperatura ambiente per i comuni lipidi sintetici, un monostrato o un bistrato stabile sufficiente non riesce a formarsi in condizioni simili per i lipidi con punti di fusione sopra la temperatura ambiente, inclusi alcuni estratti lipidici cellulari. Questo comportamento ha probabilmente limitato le composizioni - e forse la rilevanza biologica - dei DIB negli studi di membrana modello. Per affrontare questo problema, viene presentato un protocollo sperimentale per riscaldare attentamente il serbatoio dell'olio che ospita goccioline DIB e caratterizzare gli effetti della temperatura sulla membrana lipidica. In particolare, questo protocollo mostra come utilizzare un apparecchio in alluminio termoduttivo e elementi riscaldanti resistivi controllati da un circuito di feedback per prescrivere temperature elevate, che migliora l'assemblaggio monostrato e la formazione di due livelli per un set più ampio di tipi di lipidi. Le caratteristiche strutturali della membrana, così come le transizioni di fase termotropiche dei lipidi che compongono il bistrato, sono quantificate misurando i cambiamenti nella capacità elettrica del DIB. Insieme, questa procedura può aiutare a valutare i fenomeni biofisici nelle membrane modello a varie temperature, compresa la determinazione di una temperatura di fusione efficace(TM)per miscele lipidiche multicomponente. Questa capacità consentirà quindi una più stretta replicazione delle transizioni di fase naturali nelle membrane modello e incoraggerà la formazione e l'uso di membrane modello da una fascia più ampia di costituenti della membrana, compresi quelli che catturano meglio l'eterogeneità delle loro controparti cellulari.

Introduction

Le membrane cellulari sono barriere selettivamente permeabili composte da migliaia di tipi lipidici1,proteine, carboidrati e steroli che incapsulano e suddividono tutte le cellule viventi. Comprendere come le loro composizioni influenzano le loro funzioni e rivelare come le molecole naturali e sintetiche interagiscono, aderiscono, interrompono e traslocano le membrane cellulari sono, quindi, importanti aree di ricerca con implicazioni di vasta portata in biologia, medicina, chimica, fisica e ingegneria dei materiali.

Questi obiettivi di scoperta beneficiano direttamente di tecniche comprovate per assemblare, manipolare e studiare membrane modello , inclusi bistrati lipidici assemblati da lipidi sintetici o presenti in natura, che imitano la composizione, la struttura e le proprietà di trasporto delle loro controparti cellulari. Negli ultimi anni, il bistrato di interfaccia a goccia (DIB)metodo 2,3,4 per la costruzione di un bistrato lipidico planare tra goccioline d'acqua rivestite di lipidi nell'olio ha ricevutoun'attenzione significativa 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,e ha dimostrato vantaggi pratici rispetto ad altri approcci per la formazione della membrana modello: il metodo DIB è semplice da eseguire, non richiede una fabbricazione o una preparazione sofisticata (ad es. "pittura") di un substrato per sostenere la membrana, produce costantemente membrane con longevità, consente misurazioni elettrofisiologia standard e semplifica la formazione di membrane modello con composizioni asimmetriche di volantini3. Poiché il bistrato si forma spontaneamente tra goccioline e ogni goccia può essere su misura in posizione e trucco, la tecnica DIB ha anche attirato notevole interesse nello sviluppo di sistemi di materiali ispirati alle cellule che si basano sull'uso di membrane stimolanti-reattive18,24,25,26,27,28,29,compartimentazione e trasportobilanciati 14,30,31e materiali tissutali17,23,32,33,34,35,36.

La maggior parte degli esperimenti pubblicati sulle membrane modello, comprese quelle con DIB, sono stati eseguiti a temperatura ambiente (RT, ~ 20-25 ° C) e con una manciata di lipidi sintetici (ad esempio, DOPC, DPhPC, ecc.). Questa pratica limita la portata delle domande biofisiche che possono essere studiate nelle membrane modello e, in base all'osservazione, può anche limitare i tipi di lipidi che possono essere utilizzati per assemblare DIB. Ad esempio, un lipide sintetico come il DPPC, che ha una temperatura di fusione di 42 °C, non assembla monostrati ben imballati o forma DIB a RT37. La formazione di DIB a temperatura ambiente si è dimostrata difficile anche per gli estratti naturali, come quelli provenienti da mammiferi (ad esempio, estratto lipidico totale cerebrale, BTLE)38 o batteri (ad esempio, estratto lipidico totale di Escherichia coli, ETLE)37, che contengono molti tipi diversi di lipidi e provengono da cellule che risiedono a temperature elevate (37 °C). Consentire lo studio di diverse composizioni offre quindi l'opportunità di comprendere i processi mediati dalla membrana in condizioni biologicamente rilevanti.

Aumentare la temperatura dell'olio può servire a due scopi: aumenta la cinetica dell'assemblaggio monostrato e può causare ai lipidi di subire una transizione di fusione per raggiungere una fase disordinata liquida. Entrambe le conseguenze aiutanonell'assemblaggio monostrato 39, un prerequisito per un DIB. Oltre al riscaldamento per la formazione di due strato, il raffreddamento della membrana dopo la formazione può essere utilizzato per identificare le transizioni termotropiche in singoli bistrati lipidici38, compresi quelli in miscele lipidiche naturali (ad esempio, BTLE) che possono essere difficili da rilevare usando la calorimetria. Oltre a valutare le transizioni termotropiche dei lipidi, variare con precisione la temperatura del DIB può essere utilizzato per studiare i cambiamenti indotti dalla temperatura nella struttura della membrana38 ed esaminare in che modo la composizione lipidica e la fluidità influenzano la cinetica delle specie attive della membrana (ad esempio, peptidi che formano pori e proteine transmembrana37), comprese le membrane modello di mammiferi e batteriche a una temperatura fisiologicamente rilevante (37 °C).

Nel presente documento verrà spiegata una descrizione di come assemblare un serbatoio di olio DIB modificato e utilizzare un regolatore di temperatura di feedback per consentire l'assemblaggio monostrato e la formazione di due livelli a temperature superiori a RT. Distinto da un precedente protocollo40, è inclusoun dettaglio esplicito per quanto riguarda l'integrazione della strumentazione necessaria per misurare e controllare la temperatura in parallelo all'assemblaggio e alla caratterizzazione del DIB nel serbatoio dell'olio. La procedura consentirà quindi all'utente di applicare questo metodo per la formazione e lo studio dei DIB in una serie di temperature in una varietà di contesti scientifici. Inoltre, i risultati rappresentativi forniscono esempi specifici per i tipi di cambiamenti misurabili sia nella struttura della membrana che nel trasporto ionica che possono verificarsi man mano che la temperatura è varia. Queste tecniche sono importanti aggiunte ai numerosi studi biofisici che possono essere progettati ed eseguiti efficacemente nei DIB, incluso lo studio della cinetica delle specie attive a membrana in diverse composizioni di membrana.

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Protocol

1. Preparazione dell'apparecchio riscaldato

  1. Raccogliere 2 pezzi di gomma isolante spessa 1 mm tagliati a 25 mm x 40 mm di larghezza e lunghezza, rispettivamente, 2 pezzi di gomma spessa 6 mm che sono anche 25 mm x 40 mm, un gruppo di fissaggio di base in alluminio preparato e un serbatoio di olio acrilico che si adatta alla finestra di visualizzazione dell'apparecchio di base in alluminio (vedi figure S1, S2 e S3 per i dettagli sulla fabbricazione e una vista esplosa del gruppo). Preparare prima l'apparecchio in alluminio attaccando alla parte inferiore dell'apparecchio una finestra panoramica in vetro con adesivo polimerizzabile UV e aderendo a 1 elemento riscaldante resistivo nella parte superiore di ogni flangia laterale da 25 mm x 25 mm dell'apparecchio.
  2. Posizionare i pezzi di gomma più sottili sullo stadio del microscopio in modo che il bordo lungo di ciascun pezzo sia tangenziale all'apertura dello stadio, come mostrato nella (Figura 1).
  3. Posizionare l'apparecchio di base in alluminio sopra i cuscinetti isolanti con la finestra di visualizzazione dell'apparecchio centrata sopra l'obiettivo. È necessario un corretto allineamento per l'imaging delle goccioline collegate.
  4. Posizionare un pezzo di gomma più spesso sopra ogni elemento riscaldante resistivo e utilizzare una clip da palco del microscopio per tenerlo in posizione. Questi pezzi proteggono gli elementi riscaldanti dai danni causati dalle clip del palco e isolano da cortocircuiti elettrici accidentali tra gli elementi riscaldanti e sia l'apparecchio in alluminio che lo stadio del microscopio.
  5. Piegare con cura l'estremità di misura di una termocopia per ottenere un angolo di 90 ° a ~ 4 mm dall'estremità.
  6. Inserire la punta piegata della termocopia nell'angolo in basso a sinistra dell'apparecchio in alluminio e fissarla delicatamente con la vite di bloccaggio.
  7. Posizionare il serbatoio acrilico nel pozzo dell'apparecchio in alluminio. Questo viene fatto prima di aggiungere olio di esadecano al pozzo (fase 1.8) dell'apparecchio in alluminio per ridurre al minimo il rischio di intrappolare bolle d'aria tra la finestra di visualizzazione e il fondo del serbatoio acrilico, che può ostacolare la vista delle goccioline.
    NOTA: L'olio aggiunto al vano di visualizzazione dell'apparecchio in alluminio viene utilizzato per abbinare gli indici di rifrazione dell'acrilico e del vetro per un'immagine più chiara delle goccioline contenute all'interno del serbatoio acrilico. Pertanto, vale la pena notare che l'olio nel pozzo dell'apparecchio in alluminio non contatta il contenuto del serbatoio acrilico e non è necessaria una rigorosa pulizia dell'apparecchio in alluminio.
  8. Distribuire ~ 1.000 μL di olio di esadecano nel pozzo dell'apparecchio in alluminio (cioè, tra le pareti del serbatoio acrilico e dell'apparecchio in alluminio), facendo attenzione a non riempire troppo. Il livello dell'olio nel pozzo dell'apparecchio in alluminio dovrebbe essere il più alto consentito per massimizzare l'area della superficie per il trasferimento di calore, senza consentire all'olio di riversarsi sui bordi dell'apparecchio sullo stadio del microscopio o sulla lente oggettiva.
  9. Distribuire ~1.000 μL di olio di esadecano nel serbatoio acrilico, pur rimanendo consapevoli di non riempire troppo.
    NOTA: Il serbatoio acrilico deve sempre essere accuratamente pulito tra un esperimento e l'altro. L'utilizzatore deve impiegare un reggimento composto da risciacqui successivi con alcole etilico e acqua deionizzata seguita da essiccazione in una ciotola di essiccatore per oltre 12 ore.

Figure 1
Figura 1: Montaggio riscaldato dello stadio. Le immagini mostrano l'assemblaggio dell'apparecchio termicamente conduttivo e del serbatoio dell'olio per la formazione di DIB; i numeri sotto ogni immagine identificano il passaggio corrispondente del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Strumentazione per il controllo simultaneo della temperatura di feedback e caratterizzazione elettrica di un DIB

NOTA: Questo protocollo integra i seguenti strumenti per consentire il controllo della temperatura di feedback e la caratterizzazione elettrica simultanea di un DIB: un personal computer (PC) con due connessioni USB (Universal Serial Bus) disponibili, un amplificatore patch clamp abbinato a un sistema di acquisizione dati dedicato (DAQ-1), un generatore di forme d'onda, un secondo DAQ programmabile (DAQ-2) con moduli di ingresso di uscita e temperatura di tensione e un alimentatore / amplificatore. Le seguenti fasi descrivono le connessioni necessarie di questi strumenti (come illustrato nella figura 2a) necessarie per isolare la misurazione e il controllo della temperatura dall'elettrofisiologia simultanea di un DIB. Le sostituzioni di strumenti equivalenti possono essere effettuate secondo necessità.

  1. Stabilire connessioni di output e input ai moduli DAQ-2.
    1. Selezionare due coppie di terminali a vite sul modulo di uscita di tensione per connessioni di tensione differenziale e collegare i cavi del filo a queste posizioni. I terminali numerici dispari sono connessioni a terra comuni e i terminali numerici pari sono uscite non macinate, come mostrato nella (Figura 2c). Collegare ognuna di queste due coppie di fili di piombo a adattatori BNC a vite separati e quindi collegare ogni adattatore a un cavo BNC separato utilizzato per instradare i segnali di tensione ad altri strumenti.
      NOTA: In questa configurazione, le connessioni differenziali ai terminali 0 e 1 sono assegnate per l'uscita di controllo della temperatura all'amplificatore di potenza, mentre un'altra coppia di connessioni ai terminali 6 e 7 sono designate per l'uscita di tensione da inviare alle goccioline tramite l'amplificatore patch clamp.
    2. Facendo riferimento a (Figura 2c), selezionare un insieme di terminali di termocopia (ad esempio, i terminali 2 e 3 sono designati come coppia TC1) sul modulo di ingresso della termocopia e collegarvi i fili della termocopia.

Figure 2
Figura 2: Collegamenti di cablaggio di sistema. Uno schema dei dispositivi e del cablaggio necessari per il sistema è illustrato in (a), mentre uno sguardo dettagliato alle connessioni DAQ-2 è fornito in (b). L'illustrazione in( c) mostra goccioline acquose su elettrodi rivestiti di idrogel immersi nell'olio per la formazione di DIB. I due elettrodi sono collegati alle connessioni a terra e non messa a terra (V+), rispettivamente, sull'unità headstage dell'amplificatore del morsetto patch. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Dopo aver effettuato i collegamenti elettrici ai moduli DAQ-2, collegare lo chassis DAQ-2 a un PC tramite una connessione USB e connettersi a una fonte di alimentazione elettrica. Quindi confermare l'installazione di driver e software di successo prima dell'uso con un software commerciale.
  2. Configurare e collegare un amplificatore di potenza tra DAQ-2 ed elementi riscaldanti resistivi.
    1. Configura l'amplificatore per funzionare in modalità di amplificazione a guadagno fisso con un guadagno di 10X.
    2. Utilizzando un adattatore banana jack-BNC, collegare il cavo BNC proveniente dai terminali 0 e 1 sul modulo di uscita di tensione (Figura 2b) alle connessioni di ingresso sull'amplificatore di potenza.
    3. Utilizzando adattatori e cavi BNC aggiuntivi, collegare i terminali di uscita dell'amplificatore di potenza a entrambi i set di elementi riscaldanti, che sono cablati in parallelo tra loro e all'amplificatore per garantire che entrambi gli elementi mantengano la stessa caduta di tensione durante l'uso.
  3. Stabilire le connessioni necessarie per le apparecchiature di elettrofisiologia.
    1. Collegare un cavo BNC proveniente dai terminali 6 e 7 sul modulo di uscita di tensione (Figura 2b) ai connettori BNC Rear Switched External Command sul retro dell'amplificatore del morsetto patch.
    2. Collegare un secondo cavo BNC tra l'uscita del generatore di forme d'onda e il collegamento Front Switch External Command sul retro dell'amplificatore del morsetto patch.
      NOTA: Queste due connessioni forniscono metodi alternativi per generare forme d'onda di tensione che vengono applicate agli elettrodi a goccia tramite l'amplificatore del morsetto patch. Il generatore di forme d'onda è particolarmente utile per generare tensioni triangolari della forma d'onda utilizzate per misurare la capacità della membrana. L'utente può decidere quali, se uno dei due, sono necessari per la propria applicazione.
    3. Con un terzo cavo BNC, collegare l'uscita della corrente misurata situata sul pannello anteriore dell'amplificatore patch clamp a un connettore BNC di ingresso analogico disponibile sulla parte anteriore del DAQ-1.
    4. Con un quarto cavo BNC, collegare l'uscita della tensione di membrana misurata (sul retro dell'amplificatore del morsetto patch) a un connettore di ingresso analogico separato su DAQ-1. Ciò consente la digitalizzazione della tensione applicata attraverso gli elettrodi.
    5. Con i due elettrodi a goccia preparati e supportati su micromanipolatori come descritto nei passaggi 7-9 inrif.
      NOTA: Il ruolo del headstage è quello di controllare la tensione tra gli elettrodi e misurare la corrente risultante, che viene convertita in una tensione proporzionale che viene esente dall'amplificatore del morsetto patch in DAQ-1.
    6. Collegare DAQ-1 a un PC tramite una connessione USB e collegare i cavi di alimentazione corrispondenti sia all'amplificatore patch clamp che al DAQ-1.
  4. Accensione di tutte le apparecchiature di misura.
    NOTA: Forse il dettaglio più importante in questa configurazione è garantire che le connessioni di uscita dell'amplificatore di potenza (mA-A) siano isolate elettricamente dall'unità headstage dell'amplificatore del morsetto patch, che utilizza un circuito sensibile per misurare le correnti di livello pA-nA in un DIB.

3. Controllo della temperatura di feedback dei bistrati dell'interfaccia a goccia

NOTA: I seguenti passaggi per il funzionamento del sistema di controllo della temperatura di feedback si basano su un'interfaccia utente grafica (GUI) personalizzata creata per implementare il controllo della temperatura di feedback proporzionale integrale (PI)40,41 (vedere File di codifica supplementari). Altri software e algoritmi di controllo possono invece essere utilizzati. Una copia di questo programma viene fornita al lettore con le informazioni supplementari per il documento, tuttavia l'utente è responsabile di configurarlo per le proprie attrezzature ed esigenze.

  1. Avviare il software DAQ-2 sul PC e aprire il file del programma di controllo della temperatura. Una volta aperta la GUI, aprire nuovamente il programma facendo clic sull'icona della cartella nell'angolo in basso a sinistra della GUI e selezionando il programma di controllo della temperatura (Figura 3).
  2. Immettere valori numerici appropriati per il guadagno di controllo proporzionale (KP) e il guadagno del controllo integrale (KI).
    NOTA: I valori KP e KI rispettivamente di 0,598 e 0,00445 funzionano bene nella configurazione. Questi valori sono stati determinati iterativamente attraverso la simulazione utilizzando un modello di sistema che incorpora parametri ottenuti da risposte di riscaldamento a circuito aperto misurate (vedere figura 4). Durante il riscaldamento a circuito aperto,la potenza di riscaldamento prescritta è indipendente dalla temperatura misurata. Al contrario, il riscaldamento a circuito chiuso consiste nel regolare continuamente la potenza applicata ai riscaldatori in modo da aumentare la temperatura misurata alla temperatura desiderata. Questo è ottenuto qui usando uno schema di controllo PI.
  3. Per testare lo schema di controllo della temperatura, immettere la temperatura del set point desiderata (sopra la temperatura ambiente) e quindi attivare il controllo della temperatura di feedback all'interno della GUI. Osservare il segnale di temperatura misurato sotto il controllo di feedback (a circuito chiuso), che viene visualizzato nella GUI per i minuti successivi. Se la temperatura misurata dell'olio supera notevolmente la temperatura desiderata, reagisce troppo lentamente ai cambiamenti o non riesce a convergere al set point desiderato, l'utente dovrà regolare i guadagni di controllo per ottenere le prestazioni desiderate a circuito chiuso.
    NOTA: Il programma definisce un limite di saturazione per la potenza (e quindi la tensione) fornita agli elementi riscaldanti resistivi. Ad esempio, due elementi riportati nel presente documento consumano fino a 5 W di potenza ciascuno. Il loro cablaggio parallelo significa che il consumo energetico totale non deve superare i 10 W. Si consiglia all'utente di considerare la massima quantità di potenza che dovrebbe essere fornita ai dispositivi e sapere che questo limite può influire sulla velocità alla quale il sistema a circuito chiuso risponderà alle variazioni di temperatura desiderate. Elementi riscaldanti a potenza più elevata consentono un riscaldamento più rapido e temperature del set point più elevate, ma richiedono correnti fornite più elevate per il riscaldamento.
  4. Con il sistema sintonizzato su prestazioni a circuito chiuso accettabili, inserisci la temperatura dell'olio desiderata per la formazione di DIB come set point nella GUI.
    NOTA: Ad esempio, una temperatura del set point di 60 °C ha dato buoni risultati negli esperimenti con liposomi BTLE nelle goccioline acquose37. L'utente è indicato altrove2,40 per protocolli che spiegano l'assemblaggio DIB tra goccioline appese a elettrodi di tipo filo e configurazione di apparecchiature di elettrofisiologia utilizzando l'amplificatore patch clamp, DAQ-1 e il software di misurazione dell'elettrofisiologia. In particolare, il protocollo di Najem, etal. Oltre a questo passaggio, viene utilizzato un approccio leggermente diverso per la formazione di successo di monostrati e bistrati quando si utilizzano lipidi che richiedono il riscaldamento per promuovere la formazione di monostrato o bistrato.
  5. Abbassare le punte degli elettrodi di cloruro d'argento/argento (Ag/AgCl) nell'olio fino a quando non toccano quasi il fondo del serbatoio acrilico. Questo posizionamento delle punte degli elettrodi è fondamentale per mantenere la goccia sull'elettrodo in olio riscaldato, dove sono state osservate correnti convettive nell'olio per staccare le goccioline dagli elettrodi rivestiti di idrogel(Figura 2c).
  6. Pipettare una goccia da 250 nL di soluzione lipidica acquosa contenente 2 mg/mL di BTLE, cloruro di potassio da 100 mM (KCl) e acido propanosolfonico (MOPS) da 10 mM 3-(N-morpholino) su ogni punta dell'elettrodo e lasciarli incubare nell'olio riscaldato per un minimo di 10 minuti per promuovere la formazione di monostrato.
  7. Coprire il headstage e l'apparecchio riscaldato con una gabbia faraday a terra.
  8. Portare le goccioline in contatto delicato lentamente
    manipolare le posizioni orizzontali degli elettrodi fino a quando l'utente non vede le goccioline deformarsi dal contatto o iniziare a spostarsi a vicenda e attendere alcuni minuti fino all'inizio della formazione di due strato. Se dopo diversi minuti non si è formato un bistrato, le goccioline possono essere costrette insieme di più per facilitare la formazione di due strato. La formazione di un bistrato interfacciale assottigliato può essere confermata mediante ispezione visiva(Figura 5a)o misurando l'aumento dell'ampiezza di una corrente capacitiva forma d'onda quadra indotta da un generatore di forme d'onda che emette una tensione triangolare di 10 mV, 10 Hz22. Lasciare che il bistrato equilibra per un minimo di 10 minuti per raggiungere un'area interfacciale costante, alla formazione iniziale e prima della successiva caratterizzazione nel set point iniziale.
    NOTA: Il tipo di olio può avere un impatto significativo sul diradamento bistrato, sullo spessore della membrana e sull'angolo di contatto tra goccioline. In generale, più piccola è la molecola di olio, più facilmente può rimanere nel nucleo idrofobico del bistrato occupato da catene lipidiche acili. La ritenzione dell'olio aumenta le tensioni e lo spessore sia monostrato che bistrato e diminuisce l'area e l'angolo di contatto tra goccioline. Queste metriche indicano uno stato di adesione più debole. Molecole più grandi e ingombranti esercitano l'effetto opposto. Ad esempio, lo squalene è una molecola più ingombrante degli alcani come l'esadecano, che consente di escluderlo facilmente tra i monostrati durante il diradamento del bistrato. Come tali, i DIB formati in squalene sono più sottili, mostrano aree di contatto e angoli più alti e mostrano energie liberepiù elevate di formazione 22,42 (una misura di adesione goccia-goccia).

4. Caratterizzazione dei comportamenti dipendenti dalla temperatura nei DIB

NOTA: Molti processi fisici possono essere studiati nelle membrane modello basate su DIB, incluso il modo in cui i cambiamenti di temperatura influenzano la struttura e le proprietà di trasporto della membrana. I seguenti passaggi devono essere eseguiti dopo una formazione di doppio strato riuscita alla temperatura desiderata.

  1. Misurare la capacità nominale della membrana abbassando la temperatura del bagno d'olio da un set point che consente la formazione di bistrati per identificare le transizioni di fase termotropiche dei lipidi nella membrana38.
    1. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico della temperatura nell'interfaccia utente grafica e cancellare i dati visualizzati. Ciò garantisce che sia disponibile spazio sufficiente nel buffer per le registrazioni successive.
    2. Utilizzando il generatore di forme d'onda collegato all'amplificatore del morsetto patch, applicare una forma d'onda di tensione triangolare (ad esempio, 10 mV, 10 Hz) attraverso gli elettrodi DIB e registrare la risposta di corrente indotta attraverso il bistrato.
    3. Raffreddare il bistrato riducendo la temperatura del set point in incrementi di 5 °C e aspettando un minimo di 5 minuti alla nuova temperatura stazionaria tra le variazioni di temperatura fino al raggiungere la temperatura desiderata. In alternativa, provare a raffreddare passivamente il bistrato spegnendo il sistema di controllo del feedback. Tenere presente, tuttavia, che gli esperimenti che implementano il raffreddamento passivo da 50 a 60 °C hanno portato a tassi più elevati di coalescenza.
    4. Dopo che il bagno d'olio e il bistrato si raffredo alla temperatura minima desiderata, fare di nuovo clic con il pulsante destro del mouse sul grafico della temperatura nella GUI ed esportare i dati sulla temperatura rispetto al tempo in un software per fogli di calcolo. Interrompere la registrazione corrente.
    5. Dalla corrente misurata, calcolare la capacità nominale della risposta di corrente d'onda quadrata rispetto al tempo durante il periodo di raffreddamento.
    6. Tracciare la capacità nominale (C) rispetto alla temperatura ( T )per osservarecome è cambiata la capacità della membrana. Individuare i cambiamenti nonmononici in C rispetto a T per identificare TM.
      NOTA: La capacità nominale può essere calcolata dall'ampiezza della corrente di onde quadrate43 (| I|) utilizzando la relazione | Io| = C dv/dt, dove dv/dt è uguale a quattro volte il prodotto dell'ampiezza di tensione(| V|) frequenza (f) della tensione triangolare applicata. Da queste equazioni, C = | I|/(4| V|f).
  2. Analogamente, valutare la capacità specifica quasi statica (Cm) del bistrato a temperature fisse incrementando successivamente la temperatura del bagno d'olio e dell'area bistrato.
    1. Modificare la temperatura del set point in incrementi di 10 °C utilizzando la GUI e consentire al sistema di equilibrare alla nuova temperatura.
      1. Eseguire il passaggio 4.1.2 per avviare la misurazione della corrente capacitiva e della registrazione.
      2. Cambiare l'area del bistrato regolando attentamente le posizioni degli elettrodi utilizzando i micro manipolatori (cioè, separare gli elettrodi riduce l'area del bistrato). Consentire alla corrente ad onda quadra di raggiungere un'ampiezza dello stato stazionario e raccogliere immagini del DIB per consentire il calcolo dell'area della membrana rispetto al tempo utilizzando una fotocamera montata al microscopio per immagini il bistrato visto dall'apertura dello stadio del microscopio. Contemporaneamente, aggiungi un tag digitale nel software di registrazione corrente per contrassegnare il punto di tempo corrispondente per la raccolta di immagini.
        NOTA: I micro manipolatori consentono il controllo preciso degli elettrodi e quindi un contatto delicato tra goccioline. La manipolazione grossolana delle goccioline può portare ad un esperimento fallito per coalescenza delle goccioline o causando la caduta di una goccia dall'elettrodo. Come discusso altrove22, l'area del doppio strato viene calcolata in base alla lunghezza di contatto tra goccioline, che appaiono come cerchi sovrapposti in un'immagine in basso. Le posizioni e le dimensioni delle goccioline, e la lunghezza della linea di contatto, possono essere calcolate utilizzando un software di elaborazione delle immagini o con altri strumenti di programmazione scientifica.
      3. Ripetere il passaggio 4.2.1.2 almeno 4 volte per ottenere un totale di 5 immagini DIB e regioni in stato stazionario di corrente bistrato.
    2. Ripetere il passaggio 4.2.1 ad ogni temperatura desiderata.
    3. Nei punti di tempo taggati corrispondenti alle aree bistrato a stato stazionario per le immagini acquisite, analizzare le registrazioni correnti e le immagini DIB per estrarre i dati C e A per ogni temperatura.
    4. Tracciare i dati C rispetto a A per ogni temperatura e calcolare la pendenza di una regressione di primo ordine, che rappresenta il Cm del bistrato ad ogni temperatura22.
    5. Valori di plottaggio di Cm ottenuti dalla fase 4.2.4 rispetto a T.
    6. Esaminare i dati Cm rispetto a T per individuare variazioni non monotone per identificare le temperature di fusione, TM.
  3. Valutare la dinamica della formazione del canale ionio dipendente dalla tensione generando un ingresso del gradino di tensione cc attraverso il bistrato.
    1. Impostare Tensione iniziale sul valore del passo desiderato in mV (ad esempio, 100 mV).
    2. Impostare tensione finale e dimensione del passo su un valore superiore al passo desiderato (ad esempio, tensione finale di 110 mV e dimensioni del passo di 110 mV).
    3. Impostare un tempo di durata desiderato per l'input del passo in secondi (ad esempio, 90 s).
    4. Scegliere la polarità desiderata per l'ingresso del passo (ad esempio, positivo).
    5. Commutare l'amplificatore del morsetto patch per inviare al headstage la tensione di comando proveniente dal modulo di uscita GUI/tensione.
    6. Avviare le registrazioni correnti.
    7. Accendere la tensione e registrare la risposta di corrente indotta, che dovrebbe mostrare una risposta a forma di S a una tensione critica (ad esempio, ~ 70 mV per 1 μg / mL Mz in 2 mg / mL BTLE).
  4. Separatamente, le relazioni dinamica corrente-tensione per una membrana possono essere ottenute alle temperature desiderate per rivelare relazioni dipendenti dalla tensione, come i comportamenti del canale ionica.
    1. Commutare l'amplificatore del morsetto patch per inviare al headstage la tensione di comando proveniente dal generatore di forme d'onda e avviare le registrazioni di corrente.
    2. Sul generatore di forme d'onda, emettere una forma d'onda sinusoidale continua con ampiezza, offset e frequenza desiderati.
    3. Registrare la risposta di corrente indotta in uno o più cicli.
    4. Ripetere come desiderato per diverse ampiezze e frequenze e temperature dell'onda sine.

Figure 3
Figura 3: Interfaccia grafica per il controllo della temperatura. Questa figura evidenzia ed etichetta i passaggi critici necessari per utilizzare la GUI del programma per controllare la temperatura del bagno d'olio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Representative Results

La figura 1 mostra come l'apparecchio in alluminio e il serbatoio dell'olio acrilico sono preparati sullo stadio del microscopio per la formazione di DIB. I passaggi di assemblaggio 1.2-1.4 servono a isolare termicamente l'apparecchio dal palco per un riscaldamento più efficiente. I passaggi 1.5-1.7 mostrano come collegare correttamente la termocopia all'apparecchio e posizionare il serbatoio dell'olio, e i passaggi 1.8 -1.9 mostrano le posizioni consigliate per l'erogazione dell'olio in questi pezzi.

La figura 2 delinea i componenti utilizzati per stabilire il controllo della temperatura di retroazione ed eseguire misurazioni elettriche su un DIB: un PC, un amplificatore di potenza a guadagno fisso, un amplificatore patch clamp e un sistema DAQ (o strumento equivalente per l'applicazione di tensione e la misurazione di correnti di livello pA-nA), un secondo DAQ con ingressi e uscite analogiche appropriati, un generatore di forme d'onda e l'apparecchio in alluminio assemblato con riscaldatori resistivi collegati. Daq-2 si avvale di due moduli(Figura 2b). Un modulo di uscita di tensione analogica a 4 canali, ±10 V, a 16 bit viene utilizzato per avviare le tensioni indipendenti fornite all'ingresso dell'amplificatore di potenza (connessione blu nella figura 2a)e un ingresso comando esterno sull'amplificatore del morsetto patch (connessione verde). Il modulo di uscita di tensione è limitato da una corrente di uscita massima di 46 mA e una tensione di uscita massima di 10 V, mentre ogni elemento riscaldante utilizzato nel presente documento consuma fino a 5 W di potenza (~180 mA max) ad una tensione massima di 28 V. Per questo motivo, l'alimentatore /amplificatore è stato incluso per pre-amplificare la tensione di uscita e integrare la corrente fornita necessaria per alimentare gli elementi riscaldanti (cablati in parallelo) collegati all'apparecchio in alluminio. Un dispositivo di ingresso termoaccoppiale a 4 canali a 24 bit viene utilizzato per digitalizzare le misurazioni della temperatura dal serbatoio dell'olio vicino al DIB (connessione gialla). Poiché il modulo del dispositivo di ingresso della termocopia consente fino a 4 termocouple, l'utente può prendere in considerazione il monitoraggio delle temperature in altre posizioni dell'apparecchio. Se fatto, dovranno anche considerare quale segnale o combinazione di segnali viene utilizzata per il confronto con la temperatura del set point desiderata all'interno del ciclo di feedback.

Queste uscite e segnali misurati sono controllati tramite due software: 1) la GUI personalizzata per il controllo della temperatura; e 2) software di misurazione dell'elettrofisiologia. La figura 3 mostra uno screenshot della GUI e include annotazioni ai passaggi corrispondenti del protocollo. La GUI viene utilizzata per definire i parametri chiave (temperatura set point, guadagni di controllo PI, limiti di tensione), confrontare la temperatura misurata con la temperatura del set point e calcolare il segnale di controllo fornito all'amplificatore e quindi agli elementi riscaldanti, e registrare i dati della temperatura e della tensione applicata rispetto al tempo. Questo programma include anche la possibilità di comandare la tensione applicata agli elettrodi DIB (Figura 2c ) tramitel'amplificatore patch clamp. Separatamente, il software di misurazione viene utilizzato per configurare le misurazioni sia della tensione applicata agli elettrodi DIB che della corrente indotta attraverso il bistrato lipidico. Una tensione proporzionale alla corrente DIB viene esente dall'amplificatore del morsetto del patch e inviata tramite cavo BNC a DAQ-1 (connessione non mostrata).

La figura 4 traccia la variazione di temperatura e di potenza elettrica assoluta inviata ai riscaldatori rispetto al tempo in scenari di riscaldamento a circuito aperto e a circuito chiuso. Per il primo, una tensione di ingresso arbitraria corrispondente a ~5,2 W di potenza è stata applicata ai riscaldatori, il che ha portato ad un aumento esponenziale della temperatura con una costante di tempo di ~ 125 s e uno stato stazionario ΔT ≈ 4,5 °C/W dopo un ritardo iniziale di ~20 s. Queste caratteristiche del sistema a circuito aperto sono state utilizzate per costruire un modello del sistema a circuito chiuso in un software di simulazione (vedi figura S4 per i dettagli) che può essere utilizzato per determinare i valori per i guadagni di controllo proporzionali e integrali. Le risposte del modello a circuito chiuso e simulate nella figura 4 rappresentano quindi le risposte misurate e simulate del controller PI sintonizzato, con valori KP e KI rispettivamente di 0,598 e 0,00445, a una temperatura del set point superiore di 20 °C rispetto a RT. Rispetto al caso open-loop, sia la simulazione che le misurazioni confermano l'aumento della velocità di risposta nel sistema a circuito chiuso (costante di tempo ~63 s). La riduzione dei tempi di riscaldamento avviene a scapito di una maggiore potenza applicata iniziale. Tuttavia, la temperatura del set point desiderata e la temperatura dell'olio misurata sono rimaste entro 0,6 °C allo stato stazionario, che è stato ritenuto adatto per l'uso. La potenza totale fornita è limitata all'interno del programma durante il controllo a circuito chiuso in modo da non eclissare il limite di potenza totale di 10 W per i due riscaldatori.

Il sistema di controllo della temperatura è stato utilizzato per mostrare la dipendenza dalla temperatura del solvente in un DIB formato dai lipidi BTLE e il suo impatto sulla capacità della membrana (Figura 5). I lipidi BTLE sono stati scelti per questa misurazione perché il riscaldamento è necessario per la formazione di DIB a causa di una transizione di fase lipidica che si verifica tra 35-42 °C38. Il protocollo qui descritto è stato eseguito per avviare la formazione di due strato a 60 °C. Dopo la formazione della membrana e l'equilibrazione, la temperatura può essere successivamente abbassata o sollevata in base alle esigenze per caratterizzare la risposta della membrana. Ad esempio, la figura 5a mostra misurazioni rappresentative della corrente capacitiva grezza (forma d'onda a forma quadrata) e della temperatura rispetto al tempo durante un ciclo di riscaldamento da RT a ~60 °C. Si osservi che l'ampiezza della forma d'onda di corrente capacitiva si riduce di oltre la metà con l'aumentare della temperatura, che è causata dall'assorbimento di olio nel nucleo idrofobico della membrana. Questo cambiamento addensa l'interfaccia e altera la tensione laterale del bistrato22,37,38.

I dati della figura 5b documentano le variazioni in C (normalizzate dalla capacità a 27 °C) rispetto a T in un ciclo completo di raffreddamento-riscaldamento dopo la formazione iniziale di due livelli a 60 °C. Proprio come nella figura 5a, con l'aumentare della temperatura, la capacità diminuisce. Tuttavia, ciò che questa presentazione mostra più chiaramente sono i cambiamenti nonmononici che si verificano a temperature comprese tra ~ 30-42 ° C, che rappresenta la temperatura di fusione collettiva, TM, durante la quale la miscela lipidica passa tra una fase termotropica ordinata dal liquido e una fase termotropica disordinata dal liquido. La temperatura in cui si verifica il cambiamento nonmononico di capacità corrisponde ad un cambiamento nello spessore del doppio strato dall'esclusione dell'olio dalla membrana38. Inoltre, si noti che l'isteresi mostrata tra il ciclo di riscaldamento e il ciclo di raffreddamento è dovuta a cambiamenti irreversibili nell'area del bistrato che si verificano tra i cicli successivi, che sono stati in genere eseguiti a 10 minuti di distanza l'uno dall'altro.

Analogamente, la figura 6a,b mostra come le misurazioni quasi statiche di C m a temperature diverse possono essere utilizzate per identificare TM. Qui, l'area della membrana viene variata successivamente aumentando manualmente la distanza tra gli elettrodi a goccia. Durante questo esperimento, le goccioline vengono prima spinte insieme per promuovere la massima area della membrana prima delle successive riduzioni dell'area di contatto con separazioni stepwise tra gli elettrodi. Ad ogni livello di contatto, la capacità nominale del bistrato viene valutata dalla corrente indotta e la sua area è determinata attraverso l'analisi dell'immagine. La tracciatura tra C e A consente una regressione lineare, in cui la pendenza rappresenta il valore di Cm come mostrato nella figura 6a. Ripetendo questa procedura su più temperature (Figura 6b) si evicina che Cm diminuisce di quasi il 50% a temperature superiori a TM, confermando un aumento dello spessore idrofobico della membrana dovuto all'assorbimento esadecano indotto dal riscaldamento (vedi figura S5 per i dati completi C rispetto a A). A temperature più elevate, il solvente aggiuntivo nella membrana riduce anche l'area di contatto massima tra le goccioline e quindi la massima capacità nominale. La riduzione della temperatura inverte questi effetti. L'immagine DIB nella figura 6c mostra che quando la temperatura (25 °C) è ben al di sotto di TM, la membrana può adottare stabilmente uno stato altamente adesivo anche sotto la tensione di goccioline allungate causate da elettrodi ben separati. Questo è il risultato della completa esclusione dell'esadecano dal bistrato, che aumenta l'energia di adesione delle goccioline. In questo stato, l'area del bistrato non può essere modificata in modo affidabile attraverso la manipolazione degli elettrodi e ostacola la capacità di misurare con precisione la capacità specifica (vedi figura S5 per maggiori dettagli).

Infine, i dati rappresentativi della figura 7 mostrano come le variazioni di temperatura possono influenzare i comportamenti delle specie che formano pori che creano canali conduttori di ioni attraverso un DIB. Monazomicina (Mz), un antibiotico caricato positivamente che forma canali selettivi di catione attraverso il bistrato a sufficienti potenziali transmembrana37,44, è stato scelto per dimostrare questa relazione. Queste misurazioni sono state effettuate su un DIB a base di BTLE (concentrazione finale di 2 mg/mL in entrambe le goccioline) con Mz (concentrazione finale di 1 μg/mL in entrambe le goccioline). Le tracce di corrente rispetto alla tensione mostrate nella figura 7a sono state ottenute applicando tensioni di membrana sinusoidale e misurando la corrente indotta a due temperature diverse; le frecce e i numeri successivi nella figura 7a aiutano a visualizzare i trimestri successivi della tensione sinusoidale rispetto al tempo. Questo tipo di misurazione viene spesso eseguita per esaminare la dipendenza dalla tensione della corrente attraverso i canali ionici. I dati qui mostrano che l'aumento della temperatura del DIB da 27 °C a 45 °C fa salire la soglia per la formazione del canale da ~ |100 mV| a ~|110 mV|. Questo cambiamento, probabilmente guidato dal maggiore spessore della membrana a causa dell'olio assorbito, mostra che la barriera energetica per l'inserimento è aumentata. L'isteresi in queste curve- che significa resistenza alla memoria - può essere causata da cambiamenti indotti dalla tensione nell'area bistrato o dalla cinetica della formazione e inattivazione del canale Mz44.

Per aiutare a separare questi fattori nei DIB, le variazioni transitori della corrente ionici possono essere misurate in risposta a una tensione del passo CC. La figura 7b mostra la densità di corrente misurata per la stessa membrana BTLE drogata da Mz allo stesso livello di tensione (+90 mV) e due temperature diverse (27 °C e 45 °C). I dati mostrano chiaramente che la cinetica delle risposte del canale è molto diversa. In particolare, a 27 °C, la membrana mostra un aumento più veloce e più grande della corrente che viene poi seguito da un decadimento transitorio (quest'ultimo è il risultato della traslocazione dei canali Mz attraverso il bistrato in uno stato inattivo44). La risposta è molto più teneta a 45 °C, dove l'aumentodi corrente a forma di S non viene proceduto da una goccia successiva. Differenze come queste sono utili per valutare la cinetica delle risposte del canale e capire come queste potrebbero contribuire alla resistenza dinamica totale della membrana.

Figure 4
Figura 4: Riscaldamento ad anello aperto rispetto a quello a circuito chiuso. Il pannello (a) confronta le risposte di tempo per il sistema a circuito chiuso misurato e simulato (vedi SI) con un passo di temperatura di +20 °C con la risposta di riscaldamento a circuito aperto con potenza applicata fissa. Pannello (b) visualizza la potenza dissipata da ciascun sistema. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Capacità di misura e temperatura variabile. La tipica risposta di corrente della forma d'onda quadrata ad un ingresso di forma d'onda triangolare a 10 mV e 10 Hz su una membrana lipidica BTLE sottoposta a transizione di fase è mostrata in (a). La transizione di fase dei lipidi può essere vista anche nei dati di misurazione dell'area visualizzati sopra il pannello (a). La capacità normalizzata dalla capacità iniziale a 27 °C è mostrata nel pannello (b) tracciato in funzione della temperatura per un ciclo di riscaldamento e raffreddamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Misure specifiche di capacità Il gruppo di esperti (a) mostra la capacità nominale rispetto all'area bistrato ottenuta in aree di contatto successive per due temperature diverse. Le regressioni lineari a ciascun insieme vengono utilizzate per determinare i rispettivi valori di CM. Il pannello (b) traccia CM contro T, mentre il pannello ( c )mostrala forma d'onda di corrente capacitiva stabile (a sinistra) e l'area di contatto (a destra) sotto tentata separazione delle goccioline a 25 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Resistenza della membrana dipendente dalla tensione e cinetica del canale ionica Mz rispetto alla temperatura. Il pannello (a)   mostra come cambia la relazione corrente-tensione con la temperatura per i DIB BTLE formati tra goccioline contenenti 1 μg/ml di Mz. Le frecce e i numeri rappresentano le porzioni successive dell'onda sine applicata. Le differenze in queste tracce illustrano come la temperatura sposta la soglia di tensione per l'inserimento di Mz, che è identificata come la grandezza della tensione in cui la corrente indotta aumenta bruscamente. Allo stesso modo,il pannello ( b) mostra la temperatura di impatto sulla risposta di corrente transitoria indotta da una tensione del passo CC di 90 mV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura S1: Apparecchio in alluminio. Questo disegno mostra le dimensioni e le caratteristiche necessarie per la fabbricazione dell'apparecchio in alluminio che è la base dello stadio riscaldato. Le macchie piatte da 25,2 mm X 26 mm adiacenti al pozzo dell'olio sono state progettate per consentire una quantità massima di contatto superficie-area tra l'apparecchio e gli elementi riscaldanti per la conduzione del calore. Allo stesso modo, l'alluminio è stato scelto per il materiale dell'apparecchio di base a causa della sua elevata conduttività termica. Il foro a vite M3 X da 0,5 mm chiamato nella stampa viene utilizzato per fissare e posizionare la termocopia nel pozzo dell'olio. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S2: Substrato acrilico. Il substrato acrilico è un pezzo relativamente semplice da fabbricare, senza caratteristiche critiche eccezionali, ad eccezione del profilo. Il profilo esterno è stato progettato tenendo presente il giogo Poka in modo che il substrato acrilico possa essere orientato solo nell'apparecchio in modo tale da lasciare ampio spazio alla termocopia per adattarsi al pozzo dell'olio. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S3: Assemblaggio riscaldato dello stadio. È stata fornita una vista esplosa dello stadio riscaldato assemblato per aiutare lo sperimentatore durante la configurazione iniziale. Inoltre, prendi nota dell'area evidenziata dal cerchio tratteggiato, in quanto questa è la posizione ideale per riempire l'apparecchio in alluminio con olio durante la fase di protocollo 1.8. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S4: Dati a ciclo aperto e pannello di modellazione Simulink. (a) mostra le risposte di temperatura a circuito aperto a diversi livelli di potenza cc utilizzati per valutare il tempo di ritardo, td, la costante di tempo, τe il guadagno di riscaldamento ad anello aperto, α, del sistema. Il tempo di ritardo rappresenta il ritardo prima che la temperatura inizi a salire (~20 s). Ogni valore di τ (marcato da *, ~125 s) è definito come il tempo necessario per il 63,2% dell'aumento totale della temperatura. Il pannello (b) mostra la variazione dello stato stazionario della temperatura (∆T) rispetto alla potenza applicata. La pendenza dei dati tracciati in (b) è stata utilizzata per calcolare il α, che rappresenta il rapporto tra variazione di temperatura per potenza fornita. Questi parametri sono stati utilizzati nel modello mostrato nel pannello (c) e forniti come file supplementare per ottimizzare il controller PI per ottenere una risposta di controllo della temperatura a circuito chiuso desiderata. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S5: Dati di capacità specifici aggiuntivi. I grafici riportati nella figura 6a,b sono stati compilati da questo set di dati C M. Questo grafico mostra anche l'incapacità di misurare con precisione la capacità a temperature di 25 °C e inferiori, quindi questa misurazione è stata esclusa dal set di dati. Le modifiche di area necessarie per una misurazione accurata di Cm richiedono l'applicazione di una forza eccessiva alle goccioline dei micromanipolatori, che causa distorsione del sever della forma delle goccioline e dell'area di contatto. Clicca qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementari. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Il protocollo qui descritto fornisce istruzioni per assemblare e far funzionare un sistema sperimentale per controllare la temperatura dell'olio e delle goccioline utilizzate per formare DIB. È particolarmente utile per consentire la formazione di DIB utilizzando lipidi che hanno temperature di fusione superiori a RT. Inoltre, variando con precisione la temperatura del serbatoio dell'olio, la temperatura del bistrato può essere manipolata per studiare gli effetti di temperature elevate su varie proprietà e caratteristiche della membrana, tra cui capacità, area, spessore, cambiamenti di fase termotropica indotti, cinetica delle specie attive della membrana e le energetiche di adesione dell'interfaccia bistrato37,38.

Il protocollo è costituito da tre parti prima dell'uso in uno studio DIB: 1) preparazione e montaggio dell'apparecchio a stadio riscaldato; 2) collegare i vari strumenti; e 3) confermando adeguate prestazioni di controllo della temperatura con i guadagni di controllo proporzionali e integrali scelti. Più importante nella parte 2, l'utente deve assicurarsi di evitare percorsi di conduzione condivisi tra l'uscita dell'amplificatore di potenza (correnti >mA) e il test d'aestamento del morsetto patch (correnti pA-nA). Un corto involontario potrebbe causare danni permanenti al headstage. Inoltre, garantire che il PC e tutti gli strumenti siano collegati a un comune terreno di alimentazione CA e l'uso di una gabbia faraday messa a terra vicino agli elettrodi headstage e droplet aiuta a ridurre al minimo il rumore nelle misurazioni della corrente bistrato. Una volta completata l'installazione nella parte 2, l'utilizzatore deve prima valutare la risposta di riscaldamento a circuito aperto del serbatoio dell'olio applicando una tensione fissa agli elementi riscaldanti e registrando il successivo aumento della temperatura (come mostrato nella figura 4a). Questo tipo di risposta esponenziale può essere utilizzato per definire e simulare un modello semplice del sistema a circuito chiuso per variare i valori dei guadagni di controllo (vedere la figura S4 per i dettagli). I guadagni di controllo riportati nel presente documento consentono al sistema di riscaldarsi rapidamente a un livello di temperatura desiderato (~ 2 minuti) e con poco superamento e mantenere con precisione il valore del set point. Ma i guadagni specifici richiesti dipenderanno dal livello di potenza degli elementi riscaldanti e dalla geometria dell'apparecchio che supporta il serbatoio dell'olio. Una volta determinati i valori adatti dei guadagni di controllo e il sistema di controllo del feedback funziona come desiderato, l'utente può quindi iniziare a assemblare e caratterizzare un DIB.

Il protocollo non modifica il processo di formazione o caratterizzazione di DIB, tuttavia ci sono limitazioni e considerazioni. L'aumento della temperatura dell'olio può influenzare il modo in cui le goccioline pendono sugli elettrodi, a causa della riduzione della tensione monostrato e della densità dell'olio che aumentano il rilassamento delle goccioline e le correnti convettive nell'olio che possono spostare le goccioline. Quindi, il protocollo suggerisce di abbassare le punte degli elettrodi verso la superficie inferiore del substrato in modo tale che le goccioline siano supportate e tenute fermi dal serbatoio acrilico. L'utente deve valutare quanto il substrato può distorcere le goccioline (se abbassate troppo) e considerare questa distorsione quando si calcola l'area del bistrato dalle immagini dei DIB come discusso altrove22.

Mentre il sistema descritto è limitato al riscaldamento del bagno d'olio, un dispositivo di raffreddamento Peltier potrebbe essere utilizzato al posto degli elementi riscaldanti resistivi se è necessario testare a temperature inferiori a RT. In questo caso, tuttavia, l'utente dovrà considerare il punto di congelamento della fase dell'olio. Molti alcani congelano a temperature superiori a 0 °C; esadecano descritto nel presente documento si congela a 18 °C. Se l'olio si congela, le goccioline non saranno più spostabili e un bistrato tra goccioline potrebbe diventare instabile o rompersi.

Per una composizione lipidica precedentemente non testata, le incognite chiave sono il tempo di incubazione e la temperatura necessari per consentire un sufficiente assemblaggio monostrato sulle superfici delle goccioline. La regola generale è quella di riscaldare l'olio a una temperatura superiore a TM, dove la mobilità lipidica è migliorata consentendo una diffusione laterale più rapida e un imballaggio più stretto all'interfacciaolio-acqua 45, e attendere abbastanza a lungo in modo tale che l'imballaggio monostrato all'interfaccia olio-acqua sia elevato. L'utente può rivedere la letteratura pubblicata o prendere in considerazione le proprie misurazioni complementari per determinare i valori di tempo e temperatura adatti: le misurazioni della tensione interfacciale su un goniometro a goccia pendente possono essere utilizzate per valutare il tempo necessario per l'assemblaggio monostrato46 e la calorimetria a scansione differenziale viene spesso utilizzata per identificare le transizioni termotropiche dei lipidi38. Oppure un approccio iterativo può essere perseguito per identificare il tempo e la temperatura adatti in cui la formazione di due strato è coerente, la membrana è stabile per più di pochi minuti e la resistenza del bistrato è di >1 GΩ. In recenti studi con estratto lipidico totale E. coli (ETLE)37 e BTLE38,47 una temperatura iniziale >50 °C porta costantemente alla formazione stabile di due livelli. Allo stesso modo, la temperatura minima stabile dopo DIB per un dato tipo di lipide può anche variare tra le selezioni lipidiche. Ad esempio, i DIB ETLE possono essere raffreddati a 25 °C37, mentre i DIB DPPC a singolo componente si univano sempre al di sotto di TM~40 °C38. L'osservazione ha dimostrato che BTLE DIBS mostra che 27 °C è una temperatura minima sicura per mantenere un bistrato stabile.

I nostri risultati rappresentativi mostrano che le variazioni di temperatura possono influire notevolmente sulle proprietà del DIB risultante. I dati della figura 5 mostrano che la capacità nominale della membrana diminuisce con l'aumentare della temperatura. Poiché la capacità, C , èdirettamente proporzionale all'area bistrato, Ae inversamente proporzionale allo spessore, d, come indicato da

Equation 1, (1)

una diminuzione di C può manifestarsi con una diminuzione di A, un aumento di do entrambi (assumendo una permittività dielettrica fissa, ε). Queste relazioni motivano l'uso di misurazioni di capacità e immagini DIB per valutare i cambiamenti in C, Ae Cm rispetto alla temperatura per determinare quali effetti sono significativi. I dati inclusi nella figura 5 e nella figura 6 per i DIB BTLE mostrano che sia C che Cm (che rappresenta il rapporto ε/d)diminuiscono di quasi il 50% con l'aumento della temperatura da 30 C a 60 C. Insieme, questi indicano che una temperatura più elevata ispessisce il bistrato, a causa di una maggiore solubilità delle catene acili dei lipidi nell'esadecano48. L'olio aggiuntivo nella membrana può anche influenzare la tensione interfacciale del bistrato e l'angolo dicontatto tra goccioline 22,38. Questi effetti possono essere quantificati analizzando le immagini di un DIB a intervalli di tempo specificati dall'utente per monitorare l'area del bistrato e l'angolo di contatto durante il riscaldamento e il raffreddamento.

La favoribilità della temperatura dell'olio nella membrana può anche essere utilizzata per valutare le temperature di fusione termotropica dei lipidi e influenzare la cinetica del canale ionica. La temperatura di fusione per una miscela lipidica può essere definita individuando i cambiamenti nonmononici nelle relazioni C rispetto a T come nella figura 6. Le misurazioni di corrente nella figura 7 rivelano inoltre che le variazioni di fase (cioè fluidità) e spessore indotte dalla temperatura possono influire sulla tensione di soglia per l'inserimento di ionofori come Mz. Queste associazioni fisiche sono importanti per comprendere i comportamenti dei canali ionici nelle membrane modello, specialmente in scenari volti a replicare gli ambienti di temperatura corporea. Tuttavia, possono anche essere utili per sintonizzare la conducibilità del bistrato in applicazioni come dispositivi di calcolo neuromorfico47 Ad esempio, l'aumento della cinetica del canale è una caratteristica desiderabile quando si fabbricano dispositivi che mostrano resistenza alla memoria che devono imitare la velocità, la funzionalità e la plasticità a breve termine del cervello.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interessi.

Acknowledgments

Il sostegno finanziario è stato fornito dalla National Science Foundation Grant CBET-1752197 e dall'Air Force Office of Scientific Research Grant FA9550-19-1-0213.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).

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