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Immunology and Infection

Analyse des réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et identification des épitopes des lymphocytes T CD4 restreints par HLA-DR sur la base d’une matrice peptidique

Published: October 20, 2021 doi: 10.3791/62387
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medial University), 2Chongqing Key Laboratory for Research of Infectious Diseases

Summary

Sur la base d’une matrice peptidique dérivée du virus de l’hépatite B (VHB), les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB ont pu être évaluées parallèlement à l’identification des épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB.

Abstract

Les lymphocytes T CD4 jouent un rôle important dans la pathogenèse de l’hépatite B chronique. En tant que population cellulaire polyvalente, les lymphocytes T CD4 ont été classés comme des sous-ensembles fonctionnels distincts en fonction des cytokines qu’ils ont sécrétées : par exemple, IFN-γ pour les lymphocytes T helper 1 CD4, IL-4 et IL-13 pour les cellules CD4 T helper 2, IL-21 pour les cellules folliculaires CD4 T helper et IL-17 pour les cellules CD4 T helper 17. L’analyse des lymphocytes T CD4 spécifiques du virus de l’hépatite B (VHB) basée sur la sécrétion de cytokines après la stimulation des peptides dérivés du VHB pourrait fournir des informations non seulement sur l’ampleur de la réponse des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB, mais également sur les sous-ensembles fonctionnels des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB. De nouvelles approches, telles que la transcriptomique et l’analyse métabolomique, pourraient fournir des informations fonctionnelles plus détaillées sur les lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB. Ces approches nécessitent généralement l’isolement de lymphocytes T CD4 viables spécifiques du VHB à partir de multimères du complexe d’histocompatibilité majeur du peptide II, alors qu’actuellement les informations sur les épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB sont limitées. Sur la base d’une matrice peptidique dérivée du VHB, une méthode a été mise au point pour évaluer les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB et identifier simultanément les épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB à l’aide d’échantillons de cellules mononucléaires du sang périphérique provenant de patients atteints d’une infection chronique par le VHB.

Introduction

Actuellement, il existe 3 approches principales pour analyser les lymphocytes T spécifiques de l’antigène. La première approche est basée sur l’interaction entre le récepteur des lymphocytes T et le peptide (épitope). Les lymphocytes T spécifiques de l’antigène pourraient être directement colorés avec des multimères du complexe d’histocompatibilité peptide-majeur (CMH). L’avantage de cette méthode est qu’elle pourrait obtenir des lymphocytes T viables spécifiques à l’antigène, adaptés à l’analyse transcriptomique/métabolomique en aval. Une limitation de cette méthode est qu’elle ne pourrait pas fournir d’informations sur l’ensemble de la réponse des lymphocytes T à un antigène spécifique, car elle nécessite des peptides d’épitope validés alors que le nombre d’épitopes identifiés pour un antigène spécifique est limité pour l’instant. Par rapport aux épitopes des lymphocytes T CD8 spécifiques du virus de l’hépatite B (VHB), moins d’épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB ont été identifiés1,2, ce qui rend cette méthode moins applicable à l’analyse des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB actuellement.

La seconde approche est basée sur la régulation à la hausse d’une série de marqueurs induits par l’activation après stimulation peptidique antigénique3. Les marqueurs couramment utilisés comprennent CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Cette méthode a maintenant été utilisée pour analyser les réponses des lymphocytes T spécifiques à l’antigène chez les personnes vaccinées5,6,les patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine7et les patients infectés par le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère2 8,9. Contrairement au test basé sur les multimères peptide-CMH, cette méthode n’est pas limitée par des épitopes validés et pourrait obtenir des cellules viables pour l’analyse en aval. Une limitation de cette méthode est qu’elle ne pouvait pas fournir d’informations sur le profil des cytokines des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. En outre, l’expression de ces marqueurs induits par l’activation par certaines cellules non spécifiques de l’antigène activé pourrait contribuer aux signaux de fond dans l’analyse, ce qui pourrait être un problème, en particulier lorsque les cellules T spécifiques de l’antigène cible sont rares. Actuellement, l’application de cette méthode sur les lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB 4 estlimité. La question de savoir si cette méthode pourrait être utilisée pour analyser de manière fiable les lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB doit faire l’objet d’une étude plus approfondie.

La troisième approche est basée sur la sécrétion de cytokines après stimulation peptidique de l’antigène. Comme l’analyse basée sur des marqueurs induits par l’activation, cette méthode n’est pas limitée par des épitopes validés. Cette méthode pourrait révéler directement le profil cytokine des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. La sensibilité de cette méthode est inférieure à la méthode basée sur des marqueurs induits par l’activation car elle repose sur la sécrétion de cytokines de lymphocytes T spécifiques de l’antigène et le nombre de cytokines testées est généralement limité. Actuellement, cette méthode est largement utilisée dans l’analyse des lymphocytes T spécifiques du VHB. Comme les lymphocytes T spécifiques du VHB sécrétant des cytokines, il était difficile de détecter par stimulation peptidique ex vivo directe10,11, le profil cytokine des lymphocytes T spécifiques du VHB est généralement analysé après une expansion stimulée par peptide in vitro de 10 jours12,13,14,15,16. La disposition des pools de peptides sous forme de matrice a été utilisée pour faciliter l’identification des épitopes spécifiques de l’antigène17,18. Avec la combinaison de l’analyse de la matrice peptidique et de la sécrétion de cytokines, une méthode a été développée pour évaluer simultanément les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et identifier simultanément les épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB16. Dans ce protocole, les détails de cette méthode sont décrits. L’antigène central du VHB est choisi comme exemple de démonstration dans ce protocole.

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Protocol

Le consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque patient inclus dans l’étude. Le protocole d’étude est conforme aux directives éthiques de la Déclaration d’Helsinki de 1975, telles qu’elles se reflètent dans l’approbation a priori par le comité d’éthique médicale de l’hôpital du Sud-Ouest.

1. Conception de la matrice peptidique dérivée du VHB

  1. Téléchargez les séquences d’acides aminés de l’antigène central du VHB à partir des bases de données NCBI (GenBank: AFY98989.1).
  2. Achetez des peptides dérivés de l’antigène de base du VHB (un panel de 35 peptides de 15 mer se chevauchant par 10 résidus, pureté > 90%, 4 mg / peptide) auprès d’un fournisseur de services de synthèse de peptides.
  3. Mettez en place une matrice peptidique carrée 6×6 avec chaque position dans la matrice contenant seulement 1 peptide. Il y a 12 pools de peptides: 6 pools de peptides de rangée et 6 pools de peptides de colonne, 5-6 peptides dans chaque pool16. Les pools de peptides de ligne et les pools de peptides de colonne dans la matrice représentent 2 formations distinctes d’antigène central du VHB.
  4. Pour 3/4 des peptides achetés, mélanger les peptides dans la même rangée/colonne de la matrice en 12 pools de peptides distincts en les dissolvant ensemble dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) (2 μg/μL pour chaque peptide). Conserver à -80 °C pour l’analyse des réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB.
  5. Dissoudre le reste des peptides séparément (10 μg/μL) et les conserver à -80 °C pour l’identification des épitopes.

2. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMA)

  1. Échantillonnez 5 mL de sang veineux de patients atteints d’une infection chronique par le VHB.
    REMARQUE: Le volume sanguin doit être approximativement estimé en fonction du nombre de pools de peptides plus 1 contrôle de fond et 1 contrôle positif. L’analyse de 1 pool peptidique nécessite 3 x10 5 PBMC. En moyenne, 1 x 106 PBMA ont pu être obtenus à partir de 1 mL de sang.
  2. Isoler les PBCC du sang en utilisant la centrifugation à gradient de densité Ficoll (800 × g, 20 min) et cryoconserver les PBMC isolés dans de l’azote liquide pour une utilisation ultérieure.
  3. Utilisez une pipette Pasteur pour recueillir les granulocytes entre la couche claire de Ficoll et la couche de globules rouges. Extraire l’ADN génomique des granulocytes à l’aide d’un kit de purification de l’ADN génomique selon le protocole du fabricant.
  4. Envoyez l’échantillon d’ADN aux fournisseurs de services de génotypage pour déterminer le génotype HLA-DRB1.

3. Expansion in vitro des PBMC à l’aide d’une matrice peptidique hbv

  1. Décongeler les PBCC.
    1. RPMI 1640 chaud complété par 1:10 000 benzonase (25 U/mL) à 37 °C au bain-marie.
      REMARQUE: La benzonase aide à limiter l’agglutination des cellules pendant la décongélation. Chaque échantillon nécessitera 20 mL de RPMI 1640 avec benzonase. Calculer la quantité nécessaire pour décongeler tous les échantillons et préparer une aliquote distincte de milieu (37 °C) avec 1:10 000 benzonase (25 U/mL). Décongeler pas plus de 5 échantillons à la fois.
    2. Prélever des échantillons d’azote liquide et décongeler rapidement les flacons congelés au bain-marie (37 °C).
    3. Transférer la suspension de cellule décongelée dans un tube de centrifugeuse de 15 mL. Ajouter 1 mL de benzonase RPMI 1640 (37 °C) goutte à goutte au tube. Ajouter lentement 6 mL de benzonase RPMI 1640 (37 °C) dans le tube de centrifugeuse, rincer cryovial avec 2 mL de benzonase RPMI 1640 (37 °C) pour récupérer toutes les cellules. Continuez avec le reste des échantillons le plus rapidement possible.
      REMARQUE: La dilution lente des échantillons cryoconservés est la clé pour maintenir la viabilité des cellules décongelées.
    4. Centrifuger (400 × g, 10 min), retirer le surnageant et desserrer la pastille en tapotant le tube.
    5. Remettez délicatement la pastille dans 1 mL de benzonase RPMI 1640 chaude. Mélangez doucement et filtrez les cellules à travers une passoire cellulaire de 70 μm si nécessaire (c.-à-d. s’il existe un amas visible).
    6. Aliquote une suspension de 10 μL et diluer dans la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco, ajouter du bleu de trypan (0,04%), charge sur un hémocytomètre, attendre 1 min et compter le nombre de cellules viables (cellules claires).
    7. Ajouter 9 mL de benzonase RPMI 1640 (37 °C) au tube, centrifuger (400 × g, 10 min), retirer le surnageant et desserrer la pastille en tapotant le tube.
  2. Resuspendez les PBMC dans RPMI 1640 complétés par 25 mM d’HEPES, 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 10 % de sérum AB humain (milieu de culture complet). Ajuster la densité cellulaire à 1,5 x 106 cellules/mL. Plaques PBCC en plaques de 96 puits (fond plat) à une densité de 3 x 105 cellules/puits.
  3. Ajouter des pools de peptides dérivés du VHB (2 μg/mL pour chaque peptide) à chaque puits. Pour les puits de contrôle de fond et de contrôle positif, ajouter la même quantité de solvant (DMSO, 1 μL/mL). Ajouter 10 U/mL IL-2 et 10 ng/mL IL-7. Incuber à 37 °C et 5 % de CO2.
  4. Au jour 3, supplémenter le milieu de culture avec 50 U/mL d’IL-2 et 10 ng/mL d’IL-7.
    REMARQUE: Au cours des jours 1 à 3, aucune prolifération évidente des lymphocytes T ne sera observée. Le nombre total de cellules diminuera généralement de 1/3 à 1/2, en raison de la mort des cellules non T telles que les cellules B, les cellules NK, les cellules NKT et les monocytes.
  5. Au jour 7, remplacer la moitié du milieu de culture par un milieu frais contenant des peptides (4 μg/mL), de l’IL-2 (100 U/mL) et de l’IL-7 (20 ng/mL).
    REMARQUE: Pour éviter de perturber les cellules en bas, pipettez soigneusement environ 90 μL de milieu de culture à partir du haut du milieu. Au cours des jours 3 à 7, une prolifération robuste des lymphocytes T sera observée, et les lymphocytes T proliférants s’agrègent généralement pour former des grappes.
  6. Au jour 10, pipettez doucement la culture cellulaire dans chaque puits 7 à 9 fois pour désagréger les grappes de cellules, compter le nombre de cellules viables et transférer 2× 1010 5 cellules dans chaque puits sur une plaque de 96 puits (fond rond) pour l’analyse de la réponse des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB.
  7. Continuer à cultiver le reste des cellules pour l’identification de l’épitope au jour 12, ajuster le volume du milieu de culture à 100 μL (en éliminant le milieu excessif) et compléter la culture avec 100 μL de milieu de culture complet frais contenant des peptides (4 μg / mL), IL-2 (100 U / mL) et IL-7 (20 ng / mL).
    REMARQUE: Au cours du jour 7 au jour 10, les lymphocytes T continuent de proliférer vigoureusement. Remplacez le milieu de culture comme à l’étape 3.5 si le milieu jaunit. En général, le nombre de cellules dépassera 6×105 au jour 10. Chaque puits affiche généralement un nombre de cellules similaire, comptez le nombre de cellules dans 3 puits et utilisez la valeur moyenne comme estimation du nombre de cellules pour tous les puits.

4. Analyse des réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB par cytométrie en flux intracellulaire

  1. Stimuler les PBMC avec des pools de peptides
    1. Pour les cellules transférées sur la plaque de 96 puits (fond rond), laver 3 fois dans une plaque (550 × g, 3 min). Utiliser 200 μL de milieu pour chaque lavage (RPMI 1640 pour les 2 premiers lavages, milieu de culture complet pour le dernier lavage). Jetez les surnageants.
      REMARQUE: L’élimination des cytokines résiduelles dans la culture par lavage répété pourrait réduire efficacement le fond dans l’analyse de cytométrie en flux intracellulaire.
    2. Pour chaque puits de cellules stimulées avec un pool peptidique spécifique, ajouter 200 μL de milieu de culture complet complété par les mêmes pools peptidiques (2 μg/mL pour chaque peptide). Pour le puits de contrôle de fond, ajouter un milieu de culture complet complété par 1 μL/mL de DMSO. Pour le puits de contrôle positif, ajouter un milieu de culture complet complété par 1 μL/mL de DMSO, 150 ng/mL de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et 1 μmol/L d’ionomycine.
      REMARQUE: Une forte dose de DMSO bloquera la sécrétion de cytokines des lymphocytes T (plus important pour le TNF-α). Une dose de DMSO supérieure à 5 μL/mL n’est pas recommandée. Généralement, la dose de DMSO dans notre expérience ne dépasse pas 1 μL / mL.
    3. Incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 6 h.
    4. Après 1 h d’incubation, ajouter Monensin (1,37 μg/mL) à la culture.
  2. Cytométrie en flux
    1. Après 6 h d’incubation. Retirer le surnageant après centrifugation (550 × g, 3 min), laver les cellules une fois avec 200 μL de DPBS (550 × g, 3 min), les marqueurs de surface de coloration (CD3, CD4 et CD8) et le marqueur de viabilité (à l’aide d’un colorant de viabilité fixable) dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 30 min.
    2. Laver une fois avec 200 μL de DPBS (550 × g, 3 min). Fixer et perméabiliser les cellules, et colorer les cytokines intracellulaires (TNF-α et IFN-γ) dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 45 min.
    3. Après le lavage final dans la coloration intracellulaire, resuspendez les cellules dans 150 μL de tampon de cytométrie en flux (DPBS + 0,5% BSA).
    4. Acquérir des données de cytométrie en flux sur un cytomètre en flux.
  3. Analyse des résultats de la cytométrie en flux
    1. Définition du puits positif : considérer un puits comme positif s’il a une fréquence de cytokines sécrétant des lymphocytes T au moins deux fois du puits de contrôle de fond (Figure 1).
    2. Selon la formule suivante, calculer le taux de réponse pour chaque cytokine analysée(Figure 2):
      Equation 1
      REMARQUE: Le pool de peptides de ligne et les pools de peptides de colonne dans la matrice représentent 2 formations distinctes d’antigène de base du VHB, de sorte que le taux de réponse finale doit être divisé par 2.

5. Identification des épitopes de lymphocytes T CD4 restreints HLA-DR spécifiques du VHB

  1. Décongeler et maintenir les lignées cellulaires lymphoblastoïdes B allogéniques (MLCA) dans une fiole T-75 (5-20 ×106 cellules, 20 mL de milieu de culture complet).
    REMARQUE: Pour garantir le bon état des BLCL, cette étape doit être initiée 2 semaines avant la décongélation des PBMC des patients. Les BLCL doivent être homozygotes dans l’allèle HLA-DRB1. Selon le résultat du génotypage, les patients doivent partager le même allèle HLA-DRB1 que les MLCC.
  2. Criblage des peptides candidats pour identification (Figure 3)
    1. Selon les résultats du taux de réponse des lymphocytes T au jour 10, filtrez 2 pools de peptides avec le taux de réponse le plus élevé (1 pool de peptides de ligne et 1 pool de peptides de colonne).
    2. Définissez le peptide dans ces 2 pools comme peptide candidat si l’autre pool peptidique contenant ce peptide montre également un résultat positif dans l’analyse de la réponse des lymphocytes T. Utilisez les PBMCs étendus avec l’autre pool de peptides pour l’identification de l’épitope plus tard.
  3. Pulsation de MLLC avec peptide
    1. Au jour 12, comptez le nombre de MLCC viables, transférez les cellules dans des tubes centrifuges de 15 mL, centrifugez (350 × g, 10 min) et retirez le surnageant. Resuspendez la pastille cellulaire dans un milieu de culture complet et aliquotez les MLLC dans une plaque de 96 puits (fond rond) à 4×104 cellules/puits dans un milieu de culture complet de 80 μL.
    2. Ajouter un seul peptide (10 μg/mL), incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 2 h. Set 2 contrôle de fond: pulsation peptidique avec blocage HLA-DR (prétraitement avec anti-HLA-DR (10 μg / mL) pendant 1 h); Pulsation de DMSO (1 μL/mL). Le volume final du milieu de culture complet dans chaque puits est de 100 μL.
    3. Ajouter la mitomycine C (100 μg/mL), incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 1 h.
    4. Laver 3 fois avec 200 μL de RPMI 1640 (550 × g, 3 min) dans une plaque pour éliminer le peptide non pulsé et la mitomycine C. Pour le premier lavage, complétez la culture d’incubation avec 100 μL de RPMI 1640.
    5. Resuspendez les cellules dans 120 μL de milieu de culture complet.
  4. Stimuler les PBMC avec des BLCL pulsés peptidiques.
    1. Au jour 12, transférez les PBCC sur une plaque de 96 puits (fond rond).
    2. Retirer le surnageant après centrifugation (550 × g, 3 min) dans une plaque, laver deux fois avec 200 μL de RPMI 1640 (550 × g, 3 min) dans une plaque.
      REMARQUE: L’élimination des cytokines et des peptides résiduels dans la culture par lavage répété est l’étape clé pour diminuer le fond dans l’analyse de cytométrie en flux intracellulaire. Surtout pour les peptides résiduels, il se liera aux MLLC et augmentera considérablement le fond.
    3. Resuspendez les PBCC à chaque puits avec 210 μL de milieu de culture complet.
    4. Pour le puits des PBMC choisis pour l’identification des épitopes, mélanger l’aliquote (70 μL chacune) avec des BLCL pulsés peptidiques (3 puits, dont 2 témoins de fond).
      REMARQUE: Au jour 12, le nombre de pbMC élargis de pools de peptides atteindra généralement plus de 5-7×105 par puits, de sorte que le rapport PBMC / BLCL est d’environ 6/1 à 4/1.
    5. Incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 6 h.
    6. Après 1 h d’incubation, ajouter Monensin (1,37 μg/mL) à la culture. Le volume final du milieu de culture complet dans chaque puits est de 200 μL.
  5. Cytométrie en flux
    1. Répétez les mêmes opérations qu’à l’étape 4.2.
  6. Analyse des résultats de la cytométrie en flux
    1. Vérifier un peptide en tant qu’épitope de lymphocytes T CD4 restreint par HLA-DR si les PBMC incubés avec ce peptide PULSÉ montrent une fréquence de cytokines sécrétant des lymphocytes T CD4 au moins deux fois des PBMC incubés avec des témoins de fond (pulsation peptidique avec préblocage HLA-DR; Pulsation DMSO) (Figure 4).

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Representative Results

La fréquence de sécrétion de cytokines des lymphocytes T CD4 est calculée comme la somme des producteurs simples et des producteurs doubles. Comme le montre la figure 1,la fréquence de sécrétion de lymphocytes T CD4 par α TNF et la fréquence de sécrétion de lymphocytes T CD4 par γ d’IFN dans le contrôle de fond (DMSO) sont respectivement de 0,154 % et 0,013 %. La fréquence des lymphocytes T CD4 sécrétant des lymphocytes T CD4 α Tnf-γ sécrétant des lymphocytes T CD4 spécifiques pour le pool de peptides Core11 sont respectivement de 0,206 et 0,017, de sorte que la réponse des lymphocytes T CD4 sécrétant α Tnf et la réponse des lymphocytes T CD4 sécrétant γ l’IFN pour ce pool peptidique sont considérées comme négatives. La fréquence des lymphocytes T CD4 sécrétant des lymphocytes T CD4 α de TNF-γ sécrétant des lymphocytes T CD4 spécifiques du pool de peptides Core09 sont respectivement de 2,715 % et 0,973 %, de sorte que la réponse des lymphocytes T CD4 sécrétant α Tnf et la réponse des lymphocytes T CD4 sécrétant γ l’IFN pour ce pool peptidique sont considérées comme positives.

Comme le montre la figure 2,les puits positifs sont indiqués avec un fond gris. Lors du calcul du TNF spécifique au VHB α de la sécrétion du taux de réponse des lymphocytes T CD4, les données des pools de peptides Core01, Core02, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 et Core10 doivent être incluses. Lors du calcul du taux de réponse des lymphocytes T CD4 spécifiques γ au noyau HBV, les données des pools de peptides Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 et Core10 sont incluses.

Comme le montre la figure 3,les peptides candidats pour l’identification des épitopes sont indiqués en rouge. Core01 a le taux de réponse le plus élevé pour les lymphocytes T CD4 sécrécrant α TNF et les lymphocytes T CD4 sécrifiants par l’IFN-γ dans des pools de peptides colonne. Les peptides C1-15, C31-45, C61-75 et C91-105 de ce pool de peptides sont définis comme peptides candidats, car les pools de peptides de ligne contenant ces peptides montrent également des résultats positifs dans la réponse des cellules T. Les PBNC étendus avec les pools de peptides Core07, Core08, Core09 et Core10 sont utilisés pour l’identification des épitopes des peptides C1-15, C31-45, C61-75 et C91-105, respectivement. Core09 a le taux de réponse le plus élevé pour les lymphocytes T4 Sécrifiant des lymphocytes T CD4 α sécrant des lymphocytes T CD4 sécrèsant des IFN-γ dans des pools de peptides en ligne. Les peptides C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 et C86-100 de ce pool peptidique sont définis comme peptides candidats, car les pools de peptides colonne contenant ces peptides montrent également un résultat positif dans la réponse des lymphocytes T. Les PBNC étendus avec les pools de peptides Core01, Core02, Core03, Core04, Core05 et Core06 sont utilisés pour l’identification des épitopes des peptides C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 et C86-100, respectivement.

Comme démontré à la figure 4, pour les PBMC expansés Core08 du pool de peptides, après stimulation avec des BLCL pulsés peptidiques C31-45, la fréquence des lymphocytes T CD4 sécrétant des lymphocytes T CD4 α la sécrétion de l’IFN-γ sont respectivement de 0,995% et 0,131%, ce qui est plus de 2 fois plus élevé que les témoins de fond (peptide C31-45 BLCL pulsé avec pré-blocage HLA-DR, BLCL pulsés DMSO). Ainsi, le peptide C31-45 est vérifié comme un épitope de lymphocytes T CD4 restreint par HLA-DR. Pour les PBMC élargis Core10 du pool de peptides, après stimulation avec des BLCL pulsés peptide C91-105, la fréquence des lymphocytes T CD4 sécrétant des lymphocytes T CD4 α de l’IFN-γ sécrétant respectivement de 0,221% et 0,000%, qui ne dépassent pas les 2 fois les contrôles de fond (peptide C91-45 BLLC pulsé avec pré-blocage HLA-DR, BLCL pulsé DMSO), de sorte que le peptide C91-105 n’est pas vérifié comme épitope de lymphocytes T CD4 restreint par HLA-DR.

Figure 1
Figure 1: Démonstration par cytométrie en flux de TNF-α/IFN-γ sécrécrant des lymphocytes T CD4 dans des pools de peptides élargis pbMA après stimulation avec leurs pools de peptides respectifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Démonstration de l’analyse TNF-α/IFN-γ spécifiques du noyau HBV sécrant des lymphocytes T CD4. Le TNF/DMSO et l’IFN-Ƴ/DMSO indiquent les rapports des fréquences des lymphocytes TNF-α/IFN-γ sécrécrant des lymphocytes T CD4 dans chaque puits de PBMC stimulés par un pool peptidique divisés par la fréquence des TNF-α/IFN-γ sécrécrant des lymphocytes T4 dans le puits de contrôle du DMSO. Le fond gris indique les puits avec une réponse positive des lymphocytes T CD4 jugée par comparaison avec le contrôle de fond. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Démonstration du criblage des peptides candidats pour l’identification des épitopes. Le TNF/DMSO et l’IFN-Ƴ/DMSO indiquent les rapports des fréquences des lymphocytes TNF-α/IFN-γ sécrécrant des lymphocytes T CD4 dans chaque puits de PBMC stimulés par un pool peptidique divisés par la fréquence des TNF-α/IFN-γ sécrécrant des lymphocytes T4 dans le puits de contrôle du DMSO. Le fond gris indique les puits avec une réponse positive des lymphocytes T CD4 jugée par comparaison avec le contrôle de fond. Les peptides en rouge indiquent les peptides candidats selon les critères de dépistage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Démonstration par cytométrie en flux des résultats d’identification des épitopes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

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Discussion

Les étapes les plus critiques de ce protocole sont énumérées comme suit : 1) suffisamment de PBCC de haute viabilité pour démarrer l’expansion des PBMC ; 2) un environnement approprié pour l’expansion des PBMC; et 3) l’élimination complète des pools de peptides résiduels dans la culture de PBMC avant l’identification de l’épitope.

Toutes les analyses de ce protocole dépendent de la prolifération robuste des lymphocytes T CD4. En général, le nombre de PBCC après une expansion de 10 jours sera de 2 à 3 fois supérieur au nombre initial. Le nombre de cellules et la viabilité des PBMC sont 2 facteurs clés dans l’expansion des PBMC. Si le but est uniquement d’analyser les lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB sans identification de l’épitope, il est raisonnable de réduire le nombre initial de PBMA, surtout lorsque le volume de l’échantillon de sang est limité. Alors que, d’après notre expérience, une expansion réussie des PBMC pourrait à peine être obtenue si le nombre de PBCC de départ est inférieur à 1,5×105 cellules / puits. Lors de l’utilisation de PBCC frais pour l’expansion, la viabilité cellulaire ne sera pas un problème. Lors de l’utilisation de PBCC cryoconservés pour l’expansion, la cryoconservation et la décongélation des PBMC doivent être effectuées très soigneusement pour maintenir la viabilité des PBMC.

Dans l’analyse fonctionnelle des lymphocytes T spécifiques du VHB, l’IL-12 est habituellement utilisée dans l’expansion des PBCC pour améliorer la fonction des lymphocytes T CD8. Comme l’IL-12 pourrait induire une différenciation des lymphocytes T CD4 vers les lymphocytes folliculaires CD4 T, cette cytokine doit être évitée dans l’analyse fonctionnelle des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB. Dans notre protocole, seules l’IL-2 (pour l’expansion des lymphocytes T) et l’IL-7 (pour la survie des lymphocytes T) sont complétées pour maintenir le profil fonctionnel des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB pendant l’expansion aussi intact que possible. Nous avons testé 5 cytokines pour l’analyse fonctionnelle des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB : TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-17 et IL-21. Dans nos échantillons analysés, les α TNF et les γ SONT 2 cytokines majeures sécrétées par les lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB16. Lors de l’analyse du profil fonctionnel des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB, il est recommandé de tester autant de cytokines que possible pour obtenir les informations détaillées sur le profil fonctionnel. Lors de l’identification des épitopes, il est recommandé d’analyser uniquement le TNF-α et l’IFN-γ, pour des raisons économiques.

Un nombre suffisant de lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB sont essentiels à la réussite de l’identification de l’épitope, de sorte que l’identification de l’épitope doit être envisagée chez les patients présentant une réponse élevée aux lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB, tels que les patients atteints d’une poussée d’hépatite B (forte réponse Tnf spécifique α du VHB sécrétant une réponse aux lymphocytes T CD4) et les patients présentant une clairance virale (forte réponse ifN-γ CD4 T spécifique du VHB)16 . Il est très important d’éliminer les peptides résiduels dans le pool de peptides élargis PBMC par lavage répété avant d’incuber ces cellules avec des MLB pour l’identification des épitopes. Les peptides résiduels se lient aux MLLC pulsés DMSO, activent les lymphocytes T CD4 spécifiques aux peptides, ce qui augmente le fond dans une large mesure.

Certains antigènes du VHB ont des séquences variables dans différents génotypes du VHB (p. ex. antigène de surface du VHB). Une solution consiste à prédétiser les génotypes spécifiques du VHB chez les patients et à concevoir des pools de peptides spécifiques au génotype du VHB pour les patients ayant différents génotypes du VHB. Bien que le génotype du VHB ne soit pas mesurable chez les patients ayant une faible charge virale en VHB (par exemple, les patients HBeAg négatifs avec un traitement antiviral régulier), dans ce scénario, la solution consiste à mélanger des peptides de différents génotypes de VHB dans les mêmes pools de peptides, comme nous l’avons fait dans une étude précédente16. Un inconvénient de cette stratégie de mélange est que l’épitope peut être identifié comme une paire peptidique mais pas un seul peptide, car certaines positions dans la matrice des peptides contiennent une paire de peptides dans le même fragment de l’antigène.

Un inconvénient majeur de cette méthode est l’expansion fastidieuse des PBCC de 10 jours. Actuellement, l’analyse ex vivo de la sécrétion de cytokines n’a pas pu détecter de manière fiable les lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB. L’utilisation de MLLC allogéniques pulsés peptidiques comme stimulateurs a généralement détecté plus de lymphocytes T CD4 spécifiques aux peptides dans les PBMC expansés par peptides, par rapport à la simple stimulation avec des peptides16. Il vaut la peine d’étudier si l’utilisation de cellules B autologues pulsées peptidiques comme cellules de présentation d’antigènes pourrait aider à détecter de manière fiable les cellules T CD4 spécifiques du VHB ex vivo.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81930061), la Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) et Chinese Key
Projet spécialisé dans les maladies infectieuses (2018ZX10723203).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin Bovine V (BSA) Beyotime ST023
APC-conjugated Anti-human TNF-α eBioscience 17-7349-82 Keep protected from light
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Limit cell clumping
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09126 HLA-DRB1*0803 homozygote
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09121 HLA-DRB1*1202 homozygote
Cell Culture Flask (T75) Corning 430641
Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) Corning 3599 Flat bottom
Cell Culture Plate (96-well, round bottom) Corning 3799 Round bottom
Cell Strainer Corning CLS431751 Pore size 70 μm, white, sterile
Centrifuge Tube (15 mL) KIRGEN KG2611 Sterile
Centrifuge Tube (50 mL) Corning 430829 Sterile
Centrifuge, Refrigerated Eppendorf 5804R
Centrifuge, Refrigerated Thermo ST16R
Centrifuge, Refrigerated Thermo Legend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) BD Biosciences 562574 Prepare solution before use
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 Keep at room temperature to prevent crystallization
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160  mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave.
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-03
Filter Tips (0.5-10) Kirgen KG5131 Sterile
Filter Tips (100-1000) Kirgen KG5333 Sterile
Filter Tips (1-200) Kirgen KG5233 Sterile
FITC-conjugated Anti-human CD4 BioLegend 300506 Keep protected from light
Fixable Viability Dye eFluor780 eBioscience 65-0865-14 Keep protected from light
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) BD Biosciences 554724 Protein Transport Inhibitor
Haemocytometer Brand 718620
HBV Core Antigen Derived Peptides ChinaPeptides
HEPES Gibco 15630080 100 ml
Human Serum AB Gemini Bio-Products 100-51 100 ml
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
KCl Sangon Biotech A100395-0500
KH2PO4 Sangon Biotech A100781-0500
LSRFortessa Flow Cytometer BD
L-glutamine Gibco 25030081 100 ml
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Corning MCT-150-C Autoclaved sterilization before using
Microplate Shakers Scientific Industries MicroPlate Genie
Mitomycin C Roche 10107409001
Na2HPO4.7H2O Sangon Biotech A100348-0500
NaCl Sangon Biotech A100241-0500
PCR Tubes (0.2 mL) Kirgen KG2331
PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 BioLegend 300914 Keep protected from light
PE-conjugated Anti-human IFN-γ eBioscience 12-7319-42 Keep protected from light
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122 100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 eBioscience 45-0037-42 Keep protected from light
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P1585
Recombinant Human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant Human IL-7 PeproTech 200-07
RPMI Medium 1640 Gibco C11875500BT 500 ml
Sodium pyruvate,100mM Gibco 15360070
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR BioLegend 307648
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1125

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References

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Immunologie et infection numéro 176 virus de l’hépatite B CD4 réponse des lymphocytes T épitope
Analyse des réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et identification des épitopes des lymphocytes T CD4 restreints par HLA-DR sur la base d’une matrice peptidique
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Xiao, J., Wan, X., Wang, H., Deng, G. Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix. J. Vis. Exp. (176), e62387, doi:10.3791/62387 (2021).

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