Análisis de las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificación de epítopos de células T CD4 restringidas por HLA-DR basadas en una matriz peptídica

En una infección crónica por VHB, las células T CD4 desempeñan un papel importante tanto en el aclaramiento viral como en los retornadores. Este método nos permite evaluar las respuestas específicas de las células T CD4 del VHB e identificar epítopos de células T CD4 específicas del VHB, simultáneamente. Demostrando el procedimiento estará Jianmei Xiao, un asistente de investigación.

Y Xing Wan, un técnico de Bilao. Para comenzar, aísle las células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, de la sangre, utilizando la centrifugación por gradiente de densidad de Ficoll a 800 veces G durante 20 minutos. Luego, recoja los granulocitos entre la capa de glóbulos rojos y la capa de glóbulos rojos, utilizando una pipeta pasteur.

Transfiera la suspensión de la celda descongelada a un tubo centrífugo de 15 mililitros, agregue un mililitro de la Benzonasa RPMI 1640 precalentada, suelte sabiamente, luego agregue lentamente otros seis mililitros. Enjuague el vial criollo con dos mililitros de Benzonase RPMI 1640 para recuperar las células restantes. Luego centrifuge el tubo a 400 veces G durante 10 minutos.

Retire el sobrenadante y afloje el gránulo golpeando el tubo. Vuelva a suspender suavemente el pellet en un mililitro de Bensenase NACE RPMI 1640 caliente. Mezcle las células suavemente y filtre a través de un colador de células de 70 micrómetros, si hay grupos celulares visibles.

Cuente las células viables usando azul tripano y un hemocitómetro. Vuelva a suspender los PBMC y el medio de cultivo completo, que contiene 10 unidades por mililitro il2 y 10 nanogramos por mililitro IL7. Ajuste la densidad celular a 1.5x10 a las 6 celdas por mililitro.

Luego, plate las células en placas de fondo plano de 96 pozos a una densidad de 3x10 a la quinta celda por pozo. Agregue el virus de la hepatitis B o las agrupaciones de péptidos derivados del VHB a cada pozo. Para los pozos de fondo y control positivo, agregue la misma cantidad de disolvente.

Incubar las placas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. En el tercer día, complemente el medio de cultivo con 50 unidades por mililitro de IL2 y 10 nanogramos por mililitro de IL7. En el séptimo día, reemplace la mitad del medio de cultivo con un medio fresco que contenga: cuatro microgramos por mililitro de péptidos, 100 unidades por mililitro de IL2 y 20 nanogramos por mililitro de IL7.

El día 10, pipetee suavemente las células en cada pozo de siete a nueve veces para desagregó grupos celulares. Cuente el número de células viables y transfiera 2x10 a la quinta célula en cada pozo de una placa inferior redonda de 96 pozos para el análisis de la respuesta de células T CD4 específicas del VPH. Para las células residuales en la placa de fondo plano de 96 pozos, ajuste el volumen del medio de cultivo a 100 microlitros descartando el medio excesivo.

Luego, complemente el cultivo con 100 microlitros de medio de cultivo fresco y completo, que contenga: cuatro microgramos por mililitro de péptidos, 100 unidades por mililitro de IL2, y 20 nanogramos por mililitro de IL7. Continúe cultivando las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono para la identificación del epítopo el día 12. Lave las células en la placa inferior redonda de 96 pozos agregando 200 microlitros de RPMI 1640, centrifugando la placa a 550 veces G durante tres minutos y desechando el sobrenadante.

Repita el lavado dos veces con un medio de cultivo completo para el último lavado. Por cada pozo de células estimuladas con un grupo de péptidos específico, agregue 200 microlitros de medio de cultivo completo suplementado con el mismo grupo de péptidos. Para el pozo de control de fondo, agregue un medio de cultivo completo, complementado con un microlitro por mililitro de DMSO.

Para el pozo de control positivo, agregue un medio de cultivo completo complementado con un microlitro por mililitro DMSO, 150 nanogramos por mililitro PMA y un micromol por litro de ionomicina. Incubar la placa a 37 grados centígrados en 5% de dióxido de carbono durante seis horas. Después de una hora de incubación, agregue 1.37 microgramos por mililitro de monensina al cultivo.

Después de que se complete la incubación de seis horas, centrífuga la placa a 550 veces G durante tres minutos. Retire el sobrenadante y lave las células una vez con 200 microlitros de DPP, como se demostró anteriormente. Tinción para marcadores de superficie CD3, CD4 y CD8, y un marcador de viabilidad.

Después de suspender las celdas con vibrador, refrigere la placa a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Después de lavar la placa una vez con 200 microlitros de DPBS, fije y permeabilice las células, tiñe las citoquinas intracelulares, TNF Alfa e Interferón-gamma, y refrigere la placa a cuatro grados Celsius durante 45 minutos. Lave las células una vez más y vuelva a suspenderlas en 150 microlitros de tampón de citometría de flujo.

Luego, adquiera los datos de citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo. Mantenga líneas celulares alergénicas de linfocitos B, o BLCL, en un matraz T-75. En el día 12 de la expansión de PBMC, cuente el número de BVPL viables y transfiéralos a tubos de centrífuga de 15 mililitros.

Centrifugar las células a 350 veces G durante 10 minutos y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular y el medio de cultivo completo. Luego alícuota los VLCL a una placa inferior redonda de 96 pozos a 4x10 a la cuarta célula por pozo, y 80 microlitros de medio de cultivo completo.

Agregue 10 microgramos por mililitro de un solo péptido y establezca dos controles de fondo. Pulsación de péptidos con bloqueo de HLADR y pulsación de DMSO. Incubar las placas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, durante dos horas.

Agregue 100 microgramos por mililitro de mitomicina C e incube la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante una hora. Lave la placa tres veces con 200 microlitros de RPMI 1640 para eliminar el péptido nopulsado y la mitomicina C, luego vuelva a suspender las células en 120 microlitros de medio de cultivo completo, utilizando vibrador. En el día 12 de la expansión de PBMC, transfiera los PBMC a una placa inferior redonda de 96 pozos.

Centrifugar las células en la placa, quitar el sobrenadante y lavarlas dos veces con 200 microlitros de RPMI 1640, como se demostró anteriormente. Vuelva a suspender los PBMC en cada pozo con 210 microlitros de medio de cultivo completo. Para los pozos PBMC elegidos para la identificación del epítopo, alícuota 70 microlitros de la suspensión celular y mézcleos con péptidos pulsados en tres pozos, incluidos dos controles de fondo.

Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante seis horas. Después de una hora de incubación, agregue 1.37 microgramos por mililitro de monensina al cultivo y lleve el volumen final en cada pozo a 200 microlitros con medio de cultivo completo. En este ejemplo representativo, las respuestas de las células T CD4 secretoras de TNF alfa e interferón-gamma para el grupo de péptidos Core11 son inferiores a dos veces los valores de fondo, por lo tanto, se consideran negativas.

Mientras tanto, las respuestas para el grupo de péptidos Core09 son más altas que dos veces el fondo, y se consideran positivas. El fondo gris indica que Wells con una respuesta positiva de células T CD4 y los péptidos candidatos para la identificación de epítopos están indicados en rojo, Core01 tiene la tasa de respuesta más alta, a juzgar por las células CD4T secretoras de TNF Alfa e Interferón-gamma en grupos de péptidos de columna. Los péptidos C1 a 15, C31 a 45, C61 a 75 y C91 a 105 en este grupo de péptidos, se establecen como péptidos candidatos, ya que la fila de grupos de péptidos que contienen esos péptidos también muestra resultados positivos.

Los PBMC expandidos con grupos de péptidos Core07, 08, 09 y 10, se utilizan para la identificación de epítopos de estos péptidos. Del mismo modo, Core09 tiene la tasa de respuesta más alta en grupos de péptidos de fila. Todos los péptidos de este grupo se establecen como péptidos candidatos y PBMC expandidos con grupos de péptidos: Core01, 02, 03, 04, 05 y 06 se utilizan para la identificación de epítopos de estos péptidos.

Para los PBMC expandidos de la piscina peptídica Core08, después de la estimulación con péptido C31 a 45 BLCL pulsados, las frecuencias de las células T CD4 secretoras de TNF Alfa e Interferón-gamma son dos veces más altas que los controles de fondo. Por lo tanto, el péptido C31 a 45 es un epítopo verificado de células T CD4 restringidas por HLADR. Estaba allí, restantes PBMC expandidos adicionales después de la identificación del epítopo.

El marcado fino de los epítopos identificados se puede realizar utilizando un panel de péptidos acortados.