Name: Análisis de las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificación de epítopos de células T CD4 restringidas por HLA-DR basadas en una matriz peptídica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Aprende a evaluar respuestas de células T CD4 específicas del VHB e identificar epítopos usando PBMCs de pacientes con hepatitis B crónica mediante citometría de flujo.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81930061), la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) y Chinese Key Proyecto Especializado en Enfermedades Infecciosas (2018ZX10723203).

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente incluido en el estudio. El protocolo del estudio se ajusta a las directrices éticas de la Declaración de Helsinki de 1975 reflejadas en la aprobación a priori del comité de ética médica del Southwest Hospital.
1. Diseño de la matriz peptídica derivada del VHB
<ol><li>Descargue secuencias de aminoácidos del antígeno central del VHB de las bases de datos del NCBI (GenBank: AFY98989.1).</li>
	<li>Compre péptidos derivados del antígeno central del VHB (un panel de 35 péptidos 15-mer superpuestos por 10 residuos, pureza &gt; 90%, 4 mg / péptido) de un proveedor de servicios de síntesis de péptidos.</li>
	<li>Establezca una matriz peptídica cuadrada 6×6 con cada posición en la matriz que contenga solo 1 péptido. Hay 12 grupos de péptidos: 6 grupos de péptidos de fila y 6 grupos de péptidos de columna, 5-6 péptidos en cada grupo16. Las agrupaciones de péptidos de fila y las piscinas de péptidos de columna en la matriz representan 2 formaciones separadas de antígeno central del VHB.</li>
	<li>Para 3/4 de los péptidos comprados, mezcle péptidos en la misma fila / columna de la matriz en 12 grupos de péptidos separados disolviéndolos juntos en dimetilsulfóxido (DMSO) (2 μg / μL para cada péptido). Conservar a -80 °C para el análisis de las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB.</li>
	<li>Disolver el resto de los péptidos por separado (10 μg/μL) y almacenar a -80 °C para la identificación del epítopo.</li>
</ol>2. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
<ol><li>Muestra de 5 ml de sangre venosa de pacientes con infección crónica por VHB. NOTA: El volumen de sangre debe estimarse aproximadamente de acuerdo con el número de grupos de péptidos más 1 control de fondo y 1 control positivo. El análisis de 1 grupo de péptidos necesita 3 x10 5 PBMCs. En promedio, se pudo obtener 1 x10 6 PBMCs a partir de 1 mL de sangre.</li>
	<li>Aislar PBMCs de la sangre usando centrifugación por gradiente de densidad Ficoll (800 × g, 20 min) y criopreservar PBMCs aislados en nitrógeno líquido para su uso posterior.</li>
	<li>Use una pipeta Pasteur para recolectar granulocitos entre la capa transparente de Ficoll y la capa de glóbulos rojos. Extraiga ADN genómico de granulocitos utilizando un kit de purificación de ADN genómico de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Envíe la muestra de ADN a los proveedores de servicios de genotipado para determinar el genotipo HLA-DRB1.</li>
</ol>3. Expansión in vitro de PBMC utilizando una matriz peptídica del VHB
<ol><li>Descongelar pbMCs.<ol>
<li>RPMI 1640 caliente suplementado con 1:10.000 benzonasa (25 U/mL) a 37 °C en un baño de agua. NOTA: La benzonasa ayuda a limitar la aglomeración celular durante la descongelación. Cada muestra requerirá 20 ml de RPMI 1640 con benzonasa. Calcule la cantidad necesaria para descongelar todas las muestras y prepare una alícuota separada de medios (37 °C) con 1:10.000 benzonasa (25 U/mL). Descongele no más de 5 muestras a la vez.</li>
		<li>Retire las muestras de nitrógeno líquido y descongele rápidamente los viales congelados en un baño de agua (37 °C).</li>
		<li>Transfiera la suspensión de la célula descongelada a un tubo centrífugo de 15 ml. Añadir 1 ml de benzonasa RPMI 1640 (37 °C) gota a gota al tubo. Agregue lentamente 6 ml de Benzonasa RPMI 1640 (37 ° C) al tubo de la centrífuga, enjuague criovial con otros 2 ml de Benzonasa RPMI 1640 (37 ° C) para recuperar todas las células. Continuar con el resto de las muestras lo más rápido posible. NOTA: La dilución lenta de las muestras criopreservadas es la clave para mantener la viabilidad de las células descongeladas.</li>
		<li>Centrifugar (400 × g, 10 min), retire el sobrenadante y afloje el pellet golpeando el tubo.</li>
		<li>Resuspenda suavemente el pellet en 1 ml de Benzonase RPMI 1640 caliente. Mezcle suavemente y filtre las células a través de un colador de células de 70 μm si es necesario (es decir, si existe algún grupo visible).</li>
		<li>Alícuota una suspensión de 10 μL y diluya en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco, agregue azul de tripano (0.04%), cargue en un hemocitómetro, espere 1 min y cuente el número de células viables (células claras).</li>
		<li>Agregue 9 ml de benzonasa RPMI 1640 (37 ° C) al tubo, centrífuga (400 × g, 10 min), retire el sobrenadante y afloje el pellet golpeando el tubo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBMCs de resuspend en RPMI 1640 suplementados con 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 10% de suero AB humano (medio de cultivo completo). Ajuste la densidad celular a 1.5 x 106 celdas/ml. Placa PBMCs en placas de 96 pozos (fondo plano) a una densidad de 3 x 105 celdas/pozo.</li>
	<li>Agregue grupos de péptidos derivados del VHB (2 μg/ml por cada péptido individual) a cada polo. Para pozos de control de fondo y control positivo, agregue la misma cantidad de disolvente (DMSO, 1 μL/mL). Añadir 10 U/mL IL-2 y 10 ng/mL IL-7. Incubar a 37 °C y 5% CO2.</li>
	<li>En el día 3, suplementar el medio de cultivo con 50 U/mL de IL-2 y 10 ng/mL de IL-7. NOTA: Durante el día 1 al día 3, no se observará una proliferación obvia de células T. El número total de células generalmente disminuirá de 1/3 a 1/2, debido a la muerte de células no T como las células B, las células NK, las células NKT y los monocitos.</li>
	<li>En el día 7, reemplace la mitad del medio de cultivo con medio fresco que contenga péptidos (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) e IL-7 (20 ng/mL). NOTA: Para evitar perturbar las células en la parte inferior, pipetee cuidadosamente unos 90 μL de medio de cultivo desde la parte superior del medio. Durante el día 3 al día 7, se observará una proliferación robusta de células T, y las células T que proliferan generalmente se agregan para formar grupos.</li>
	<li>En el día 10, pipetee suavemente el cultivo celular en cada pozo 7-9 veces para desagregar los grupos celulares, contar el número de células viables y transferir 2×105 células en cada pozo a una placa de 96 pozos (fondo redondo) para el análisis de la respuesta de células T CD4 específicas del VHB.</li>
	<li>Continúe cultivando el resto de células para la identificación del epítopo en el día 12, ajuste el volumen del medio de cultivo a 100 μL (descartando el medio excesivo) y complemente el cultivo con 100 μL de medio de cultivo completo fresco que contenga péptidos (4 μg / ml), IL-2 (100 U / ml) e IL-7 (20 ng / ml). NOTA: Durante el día 7 al día 10, las células T continúan proliferando vigorosamente. Reemplace el medio de cultivo como en el paso 3.5 si el medio se vuelve amarillo. En general, el número de celdas superará el 6×105 al día 10. Cada pozo generalmente muestra un número de celda similar, cuenta el número de celda en 3 pozos y usa el valor promedio como una estimación del número de celdas para todos los pozos.</li>
</ol>4. Análisis de las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB mediante citometría de flujo intracelular
<ol><li>Estimulando PBMCs con grupos de péptidos<ol>
<li>Para las células transferidas a la placa de 96 pozos (fondo redondo), lavar 3 veces en una placa (550 × g, 3 min). Utilice 200 μL de medio para cada lavado (RPMI 1640 para los primeros 2 lavados, medio de cultivo completo para el último lavado). Descarta los sobrenadantes. NOTA: La eliminación de citoquinas residuales en el cultivo mediante lavado repetido podría disminuir efectivamente el fondo en el análisis de citometría de flujo intracelular.</li>
		<li>Para cada poto de células estimuladas con un grupo de péptidos específico, agregue 200 μL de medio de cultivo completo suplementado con los mismos grupos de péptidos (2 μg / ml para cada péptido individual). Para el pozo de control de fondo, agregue un medio de cultivo completo complementado con 1 μL / ml de DMSO. Para el pozo de control positivo, agregue un medio de cultivo completo suplementado con 1 μL / ml de DMSO, 150 ng / ml de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y 1 μmol / L de ionomicina. NOTA: Una dosis alta de DMSO bloqueará la secreción de citoquinas de las células T (más importante para el TNF-α). No se recomienda una dosis de DMSO superior a 5 μL/ml. Generalmente, la dosis de DMSO en nuestro experimento no supera 1 μL/mL.</li>
		<li>Incubar a 37 °C y 5% CO2 durante 6 h.</li>
		<li>Después de 1 h de incubación, añadir Monensin (1,37 μg/ml) al cultivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Citometría de flujo<ol>
<li>Después de 6 h de incubación. Retire el sobrenadante después de la centrifugación (550 × g, 3 min), lave las células una vez con 200 μL de DPBS (550 × g, 3 min), manche los marcadores de superficie (CD3, CD4 y CD8) y el marcador de viabilidad (utilizando un tinte de viabilidad fijable) en un refrigerador de 4 °C durante 30 min.</li>
		<li>Lavar una vez con 200 μL de DPBS (550 × g, 3 min). Fijar y permeabilizar células, y teñir citoquinas intracelulares (TNF-α e IFN-γ) en un refrigerador de 4 °C durante 45 min.</li>
		<li>Después del lavado final en tinción intracelular, resuspend las células en 150 μL de tampón de citometría de flujo (DPBS + 0,5% BSA).</li>
		<li>Adquirir datos de citometría de flujo en un citómetro de flujo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis de los resultados de la citometría de flujo<ol>
<li>Definición de pozo positivo: considere un pozo como positivo si tiene una frecuencia de células T secretoras de citoquinas al menos dos veces del fondo de control del pozo (Figura 1).</li>
		<li>De acuerdo con la siguiente fórmula, calcule la tasa de respuesta para cada citoquina analizada (Figura 2): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62387/62387eq01.jpg"> NOTA: El grupo de péptidos de fila y los grupos de péptidos de columna en la matriz representan 2 formaciones distintas de antígeno central del VHB, por lo que la tasa de respuesta final debe dividirse por 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Identificación de epítopos de células T CD4 restringidas HLA-DR específicas del VHB
<ol><li>Descongelar y mantener líneas celulares linfoblastoides Alogénicas B (BLCLs) en matraz T-75 (5-20 ×106 células, 20 mL de medio de cultivo completo). NOTA: Para garantizar el buen estado de los BLCL, este paso debe iniciarse 2 semanas antes de la descongelación de los PBMC de los pacientes. Los BLCL deben ser homocigotos en el alelo HLA-DRB1. De acuerdo con el resultado del genotipado, los pacientes deben compartir el mismo alelo HLA-DRB1 que los BLCL.</li>
	<li>Cribado de péptidos candidatos para su identificación (Figura 3)<ol>
<li>De acuerdo con los resultados de la tasa de respuesta de las células T en el día 10, evalúe 2 grupos de péptidos con la tasa de respuesta más alta (1 grupo de péptidos de fila y 1 grupo de péptidos de columna).</li>
		<li>Establezca el péptido en esos 2 grupos como un péptido candidato si el otro grupo de péptidos que contiene este péptido también muestra un resultado positivo en el análisis de respuesta de las células T. Utilice los PBMC expandidos con el otro grupo de péptidos para la identificación del epítopo más adelante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BLCL pulsantes con péptido<ol>
<li>En el día 12, cuente el número de VLCL viables, transfiera las células a 15 ml de tubos de centrífuga, centrífuga (350 × g, 10 min) y retire el sobrenadante. Resuspónda el pellet celular en medio de cultivo completo y Alícuota BLCLs a una placa de 96 pozos (fondo redondo) a 4×104 células/pozo en medio de cultivo completo de 80 μL.</li>
		<li>Añadir un solo péptido (10 μg/mL), incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 2 h. Set 2 control de fondo: pulsación peptídica con bloqueo HLA-DR (pretratamiento con anti-HLA-DR (10 μg/mL) durante 1 h); DMSO (1 μL/mL) pulsante. El volumen final del medio de cultivo completo en cada pozo es de 100 μL.</li>
		<li>Añadir mitomicina C (100 μg/mL), incubar a 37 °C y 5% DECO 2 durante 1 h.</li>
		<li>Lavar 3 veces con 200 μL de RPMI 1640 (550 × g, 3 min) en una placa para eliminar el péptido no pulsado y la mitomicina C. Para el primer lavado, complemente el cultivo de incubación con 100 μL de RPMI 1640.</li>
		<li>Resuspend células en 120 μL de medio de cultivo completo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estimulantes de PBMC con BLCL pulsados peptídicos.<ol>
<li>En el día 12, transfiera PBMC a una placa de 96 pozos (fondo redondo).</li>
		<li>Retire el sobrenadante después de la centrifugación (550 × g, 3 min) en un plato, un lavado dos veces con 200 μL de RPMI 1640 (550 × g, 3 min) en un plato. NOTA: La eliminación de citoquinas y péptidos residuales en el cultivo mediante lavado repetido es el paso clave para disminuir el fondo en el análisis de citometría de flujo intracelular. Especialmente para los péptidos residuales, se unirá a los BLCL y aumentará significativamente el fondo.</li>
		<li>Resuspend PBMCs en cada pozo con 210 μL de medio de cultivo completo.</li>
		<li>Para el pozo de PBMC elegido para la identificación del epítopo, mezcle la alícuota (70 μL cada uno) con PÉptidos pulsados BLCL (3 pozos, incluidos 2 controles de fondo). NOTA: En el día 12, el número de grupos de péptidos de PBMC expandidos generalmente alcanzará por encima de 5-7×105 por pozo, por lo que la proporción de PBMC / BLCL es de aproximadamente 6/1 a 4/1.</li>
		<li>Incubar a 37 °C y 5% CO2 durante 6 h.</li>
		<li>Después de 1 h de incubación, añadir Monensin (1,37 μg/ml) al cultivo. El volumen final del medio de cultivo completo en cada pozo es de 200 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Citometría de flujo<ol>
<li>Repita las mismas operaciones que en el paso 4.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis de los resultados de la citometría de flujo<ol>
<li>Verificar un péptido como un epítopo de células T CD4 restringidas por HLA-DR si los PBMC incubados con este péptido pulsado BLCL muestran una frecuencia de citoquinas secretando células T CD4 al menos dos veces de los PBMC incubados con controles de fondo (péptido pulsando con prebloqueo HLA-DR; DMSO pulsante) (Figura 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos más críticos en este protocolo se enumeran a continuación: 1) suficientes PBMC de alta viabilidad para iniciar la expansión de PBMCs; 2) entorno apropiado para la expansión de pbMC; y 3) eliminación completa de grupos de péptidos residuales en cultivo de PBMC antes de la identificación del epítopo.
Todo el análisis en este protocolo depende de la proliferación robusta de células T CD4. En general, el número de PBMC después de la expansión de 10 días será de 2 a 3 veces el número inic...

Actualmente, hay 3 enfoques principales para analizar las células T específicas del antígeno. El primer enfoque se basa en la interacción entre el receptor de células T y el péptido (epítopo). Las células T específicas del antígeno podrían teñirse directamente con multómeros del complejo de histocompatibilidad peptídico mayor (MHC). La ventaja de este método es que podría obtener células T viables específicas de antígenos, adecuadas para el análisis transcriptómico / metabolómico posterior. Una limitación de este método es que no pudo proporcionar información sobre toda la respuesta de las células T a un antígeno específico, ya que requiere péptidos de epítopo validados, mientras que el número de epítopos identificados para un antígeno específico es limitado por ahora. En comparación con los epítopos de células T CD8 específicos del virus de la hepatitis B (VHB), se han identificado menos epítopos de células T CD4 específicos del VHB1,2, lo que hizo que este método fuera menos aplicable para el análisis de células T CD4 específicas del VHB actualmente.
El segundo enfoque se basa en la regulación al alza de una serie de marcadores inducidos por activación después de la estimulación peptídica del antígeno3. Los marcadores comúnmente utilizados incluyen CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Este método se ha utilizado ahora para analizar las respuestas de células T específicas de antígenos en individuos vacunados5,6,pacientes con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana7y pacientes con infección por coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo8,9. A diferencia del ensayo basado en multómeros péptidos-MHC, este método no está restringido por epítopos validados y podría obtener células viables para el análisis posterior. Una limitación de este método es que no pudo proporcionar información sobre el perfil de citoquinas de las células T específicas del antígeno. Además, la expresión de estos marcadores inducidos por la activación por algunas células no específicas de antígeno activado podría contribuir a las señales de fondo en el análisis, lo que podría ser un problema, especialmente cuando las células T específicas del antígeno objetivo son raras. Actualmente, existe una aplicación limitada de este método en las células T CD4 específicas delVHB 4. Si este método podría utilizarse para analizar las células T CD4 específicas del VHB de una manera confiable necesita más investigación.
El tercer enfoque se basa en la secreción de citoquinas después de la estimulación del péptido antígeno. Al igual que el análisis basado en marcadores inducidos por activación, este método no está restringido por epítopos validados. Este método podría revelar directamente el perfil de citoquinas de las células T específicas del antígeno. La sensibilidad de este método es menor que el método basado en marcadores inducidos por activación, ya que se basa en la secreción de citoquinas de células T específicas de antígenos y el número de citoquinas analizadas suele ser limitado. Actualmente, este método es ampliamente utilizado en el análisis de células T específicas del VHB. Como las células T específicas del VHB secretas de citoquinas difícilmente podrían detectarse mediante la estimulación directa del péptido ex vivo10,11, el perfil de citoquinas de las células T específicas del VHB generalmente se analiza después de 10 días de expansión estimulada por péptidos in vitro12,13,14,15,16. La disposición de grupos de péptidos en forma de matriz se ha utilizado para facilitar la identificación de epítopos específicos de antígenos17,18. Con la combinación de la matriz peptídica y el análisis de secreción de citoquinas, se ha desarrollado un método para evaluar las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificar los epítopos de células T CD4 específicas del VHB simultáneamente16. En este protocolo, se describen los detalles de este método. El antígeno central del VHB se elige como ejemplo de demostración en este protocolo.

<table><tbody><tr><td>Albúmina Bovina V (BSA)</td><td>Beyotime</td><td>ST023</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugado Anti-humano TNF-&alpha;</td><td>eBioscience</td><td>17-7349-82</td><td>Manténgase protegido de la luz</td></tr><tr><td>Benzonase nucleasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Límite de aglomeración de células</td></tr><tr><td>B líneas celulares linfoblastoides B (BLCL)</td><td>CENTRO DE INVESTIGACIÓN DEL CÁNCER FRED HUTCHINSON</td><td></td> IHW09126 <td>HLA-DRB1*0803 homocigoto</td></tr><tr><td>Líneas celulares linfoblastoides B (BLCL)</td><td>CENTRO DE INVESTIGACIÓN DEL CÁNCER FRED HUTCHINSON</td><td></td> IHW09121 <td>HLA-DRB1*1202 homocigoto</td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular (T75)</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular (96 pocillos, fondo plano)</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de fondo plano (96 pocillos, fondo redondo)</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Colador</td></tr> de células de fondo redondo <tr><td></td><td>Corning</td><td>CLS431751</td><td>tamaño de poro 70&nbsp; &mu; m, blanco, estéril</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga (15 mL)</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td>Tubo</td></tr> de <tr><td>centrífuga estéril (50 mL)</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>Centrífuga estéril</td></tr><tr><td>, refrigerada</td><td>Centrífuga Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>, centrífuga</td><td>refrigerada Thermo</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>, refrigerada</td><td>Thermo Legend</td><td>Micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>Kit Cytofix/Cytoperm (Conjunto de tampones de factores de transcripción)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>562574 Prepare la solución antes de usar</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Mantener a temperatura ambiente para evitar la cristalización</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Preparado de solución salina</td><td></td><td></td> tamponada con fosfato <td>ddH2O (1000 ml) que contiene NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg) y Na2HPO4.7H2O (2160&nbsp; mg). Ajuste el PH a 7.4. Esterilizar en autoclave.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de filtro (0.5-10)</td><td>Kirgen</td><td>KG5131</td><td>Puntas de filtro estériles</td></tr><tr><td>(100-1000)</td><td>Kirgen</td><td>KG5333</td><td>Puntas de filtro estériles</td></tr><tr><td>(1-200)</td><td>Kirgen</td><td>KG5233</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>conjugado con FITC Anti-humano CD4</td><td>BioLegend</td><td>300506</td><td>Manténgalo protegido de la luz</td></tr><tr><td>Colorante de viabilidad fijable eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>Manténgalo protegido de la luz</td></tr><tr><td>GolgiStop Inhibidor del transporte de proteínas (que contiene monensina)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td>Inhibidor del transporte de proteínas</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Marca</td><td>718620</td><td></td></tr><tr><td>Péptidos derivados del antígeno central del VHB</td><td>ChinaPéptidos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Suero Humano AB</td><td>Gemini Bio-Productos</td><td>100-51</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100395-0500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100781-0500</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Citómetro de Flujo</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td> Tubo de microcentrífuga de <td>100 ml</td></tr><tr><td>(1,5 ml)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td>Esterilización en autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>Agitadores de microplacas Scientific</td><td></td><td>Industries MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100348-0500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241-0500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR (0,2 mL)</td><td>Kirgen</td><td>KG2331</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-conjugado Anti-humano CD8</td><td>BioLegend</td><td>300914</td><td>Mantener protegido de la luz</td></tr><tr><td>Conjugado PE-PE-Anti-humano IFN-&gamma;</td><td>eBioscience</td><td>12-7319-42</td><td>Mantener protegido de la luz</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5-conjugado Anti-humano CD3</td><td>eBioscience</td><td>45-0037-42</td><td>Mantener protegido de la luz</td></tr><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humano recombinante</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Humano recombinante IL-7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medio 1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio,100mM</td><td>Gibco</td><td>15360070</td><td></td></tr><tr><td>Tinte azul de tripán (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purificado Anti-humano HLA-DR</td><td>BioLegend</td><td>307648</td><td></td></tr><tr><td>Wizard ADN genómico Kit de purificación</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de las respuestas de las células t cd4 específicas del vhb e identificación de epítopos de células t cd4 restringidas por hla-dr basadas en una matriz peptídica

Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix

Las células T CD4 juegan un papel importante en la patogénesis de la hepatitis B crónica. Como población celular versátil, las células T CD4 se han clasificado como subconjuntos funcionales distintos en función de las citoquinas que secretaron: por ejemplo, IFN-γ para las células CD4 T helper 1, IL-4 e IL-13 para las células CD4 T helper 2, IL-21 para las células auxiliares foliculares CD4 T y LA IL-17 para las células CD4 T helper 17. El análisis de las células T CD4 específicas del virus de la hepatitis B (VHB) basadas en la secreción de citoquinas después de la estimulación de péptidos derivados del VHB podría proporcionar información no solo sobre la magnitud de la respuesta de las células T CD4 específicas del VHB, sino también sobre los subconjuntos funcionales de las células T CD4 específicas del VHB. Los enfoques novedosos, como la transcriptómica y el análisis metabolómico, podrían proporcionar información funcional más detallada sobre las células T CD4 específicas del VHB. Estos enfoques generalmente requieren el aislamiento de células T CD4 viables específicas del VHB basadas en multómeros del complejo II de histocompatibilidad mayor peptídico, mientras que actualmente la información sobre los epítopos de células T CD4 específicas del VHB es limitada. Sobre la base de una matriz peptídica derivada del VHB, se ha desarrollado un método para evaluar las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificar epítopos de células T CD4 específicas del VHB simultáneamente utilizando muestras de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con infección crónica por VHB.

La frecuencia de las células T CD4 secretoras de citoquinas se calcula como la suma de productores simples y productores dobles. Como se demuestra en la Figura 1,la frecuencia de las células T CD4 secretoras de α TNF-y la frecuencia de las células T CD4 secretoras de IFN-γ en el control de fondo (DMSO) son del 0,154% y 0,013% respectivamente. La frecuencia de TNF-α secretando células T CD4 y la frecuencia de IFN-γ secretando células T CD4 específicas para el grupo de péptidos Core11 son 0.20...

Sobre la base de una matriz peptídica derivada del virus de la hepatitis B (VHB), las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB podrían evaluarse en paralelo con la identificación de epítopos de células T CD4 específicas del VHB.

Análisis de las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificación de epítopos de células T CD4 restringidas por HLA-DR basadas en una matriz peptídica

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct ...

En una infección crónica por VHB, las células T CD4 desempeñan un papel importante tanto en el aclaramiento viral como en los retornadores. Este método nos permite evaluar las respuestas específicas de las células T CD4 del VHB e identificar epítopos de células T CD4 específicas del VHB, simultáneamente. Demostrando el procedimiento estará Jianmei Xiao, un asistente de investigación.Y Xing Wan, un técnico de Bilao. Para comenzar, aísle las células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, de la sangre, utilizando la centrifugación por gradiente de densidad de Ficoll a 800 veces G durante 20 minutos. Luego, recoja los granulocitos entre la capa de glóbulos rojos y la capa de glóbulos rojos, utilizando una pipeta pasteur.Transfiera la suspensión de la celda descongelada a un tubo centrífugo de 15 mililitros, agregue un mililitro de la Benzonasa RPMI 1640 precalentada, suelte sabiamente, luego agregue lentamente otros seis mililitros. Enjuague el vial criollo con dos mililitros de Benzonase RPMI 1640 para recuperar las células restantes. Luego centrifuge el tubo a 400 veces G durante 10 minutos.Retire el sobrenadante y afloje el gránulo golpeando el tubo. Vuelva a suspender suavemente el pellet en un mililitro de Bensenase NACE RPMI 1640 caliente. Mezcle las células suavemente y filtre a través de un colador de células de 70 micrómetros, si hay grupos celulares visibles.Cuente las células viables usando azul tripano y un hemocitómetro. Vuelva a suspender los PBMC y el medio de cultivo completo, que contiene 10 unidades por mililitro il2 y 10 nanogramos por mililitro IL7. Ajuste la densidad celular a 1.5x10 a las 6 celdas por mililitro.Luego, plate las células en placas de fondo plano de 96 pozos a una densidad de 3x10 a la quinta celda por pozo. Agregue el virus de la hepatitis B o las agrupaciones de péptidos derivados del VHB a cada pozo. Para los pozos de fondo y control positivo, agregue la misma cantidad de disolvente.Incubar las placas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. En el tercer día, complemente el medio de cultivo con 50 unidades por mililitro de IL2 y 10 nanogramos por mililitro de IL7. En el séptimo día, reemplace la mitad del medio de cultivo con un medio fresco que contenga: cuatro microgramos por mililitro de péptidos, 100 unidades por mililitro de IL2 y 20 nanogramos por mililitro de IL7.El día 10, pipetee suavemente las células en cada pozo de siete a nueve veces para desagregó grupos celulares. Cuente el número de células viables y transfiera 2x10 a la quinta célula en cada pozo de una placa inferior redonda de 96 pozos para el análisis de la respuesta de células T CD4 específicas del VPH. Para las células residuales en la placa de fondo plano de 96 pozos, ajuste el volumen del medio de cultivo a 100 microlitros descartando el medio excesivo.Luego, complemente el cultivo con 100 microlitros de medio de cultivo fresco y completo, que contenga: cuatro microgramos por mililitro de péptidos, 100 unidades por mililitro de IL2, y 20 nanogramos por mililitro de IL7. Continúe cultivando las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono para la identificación del epítopo el día 12. Lave las células en la placa inferior redonda de 96 pozos agregando 200 microlitros de RPMI 1640, centrifugando la placa a 550 veces G durante tres minutos y desechando el sobrenadante.Repita el lavado dos veces con un medio de cultivo completo para el último lavado. Por cada pozo de células estimuladas con un grupo de péptidos específico, agregue 200 microlitros de medio de cultivo completo suplementado con el mismo grupo de péptidos. Para el pozo de control de fondo, agregue un medio de cultivo completo, complementado con un microlitro por mililitro de DMSO.Para el pozo de control positivo, agregue un medio de cultivo completo complementado con un microlitro por mililitro DMSO, 150 nanogramos por mililitro PMA y un micromol por litro de ionomicina. Incubar la placa a 37 grados centígrados en 5% de dióxido de carbono durante seis horas. Después de una hora de incubación, agregue 1.37 microgramos por mililitro de monensina al cultivo.Después de que se complete la incubación de seis horas, centrífuga la placa a 550 veces G durante tres minutos. Retire el sobrenadante y lave las células una vez con 200 microlitros de DPP, como se demostró anteriormente. Tinción para marcadores de superficie CD3, CD4 y CD8, y un marcador de viabilidad.Después de suspender las celdas con vibrador, refrigere la placa a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Después de lavar la placa una vez con 200 microlitros de DPBS, fije y permeabilice las células, tiñe las citoquinas intracelulares, TNF Alfa e Interferón-gamma, y refrigere la placa a cuatro grados Celsius durante 45 minutos. Lave las células una vez más y vuelva a suspenderlas en 150 microlitros de tampón de citometría de flujo.Luego, adquiera los datos de citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo. Mantenga líneas celulares alergénicas de linfocitos B, o BLCL, en un matraz T-75. En el día 12 de la expansión de PBMC, cuente el número de BVPL viables y transfiéralos a tubos de centrífuga de 15 mililitros.Centrifugar las células a 350 veces G durante 10 minutos y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular y el medio de cultivo completo. Luego alícuota los VLCL a una placa inferior redonda de 96 pozos a 4x10 a la cuarta célula por pozo, y 80 microlitros de medio de cultivo completo.Agregue 10 microgramos por mililitro de un solo péptido y establezca dos controles de fondo. Pulsación de péptidos con bloqueo de HLADR y pulsación de DMSO. Incubar las placas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, durante dos horas.Agregue 100 microgramos por mililitro de mitomicina C e incube la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante una hora. Lave la placa tres veces con 200 microlitros de RPMI 1640 para eliminar el péptido nopulsado y la mitomicina C, luego vuelva a suspender las células en 120 microlitros de medio de cultivo completo, utilizando vibrador. En el día 12 de la expansión de PBMC, transfiera los PBMC a una placa inferior redonda de 96 pozos.Centrifugar las células en la placa, quitar el sobrenadante y lavarlas dos veces con 200 microlitros de RPMI 1640, como se demostró anteriormente. Vuelva a suspender los PBMC en cada pozo con 210 microlitros de medio de cultivo completo. Para los pozos PBMC elegidos para la identificación del epítopo, alícuota 70 microlitros de la suspensión celular y mézcleos con péptidos pulsados en tres pozos, incluidos dos controles de fondo.Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante seis horas. Después de una hora de incubación, agregue 1.37 microgramos por mililitro de monensina al cultivo y lleve el volumen final en cada pozo a 200 microlitros con medio de cultivo completo. En este ejemplo representativo, las respuestas de las células T CD4 secretoras de TNF alfa e interferón-gamma para el grupo de péptidos Core11 son inferiores a dos veces los valores de fondo, por lo tanto, se consideran negativas.Mientras tanto, las respuestas para el grupo de péptidos Core09 son más altas que dos veces el fondo, y se consideran positivas. El fondo gris indica que Wells con una respuesta positiva de células T CD4 y los péptidos candidatos para la identificación de epítopos están indicados en rojo, Core01 tiene la tasa de respuesta más alta, a juzgar por las células CD4T secretoras de TNF Alfa e Interferón-gamma en grupos de péptidos de columna. Los péptidos C1 a 15, C31 a 45, C61 a 75 y C91 a 105 en este grupo de péptidos, se establecen como péptidos candidatos, ya que la fila de grupos de péptidos que contienen esos péptidos también muestra resultados positivos.Los PBMC expandidos con grupos de péptidos Core07, 08, 09 y 10, se utilizan para la identificación de epítopos de estos péptidos. Del mismo modo, Core09 tiene la tasa de respuesta más alta en grupos de péptidos de fila. Todos los péptidos de este grupo se establecen como péptidos candidatos y PBMC expandidos con grupos de péptidos: Core01, 02, 03, 04, 05 y 06 se utilizan para la identificación de epítopos de estos péptidos.Para los PBMC expandidos de la piscina peptídica Core08, después de la estimulación con péptido C31 a 45 BLCL pulsados, las frecuencias de las células T CD4 secretoras de TNF Alfa e Interferón-gamma son dos veces más altas que los controles de fondo. Por lo tanto, el péptido C31 a 45 es un epítopo verificado de células T CD4 restringidas por HLADR. Estaba allí, restantes PBMC expandidos adicionales después de la identificación del epítopo.El marcado fino de los epítopos identificados se puede realizar utilizando un panel de péptidos acortados.

analysis-hbv-specific-cd4-t-cell-responses-identification-hla-dr

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Análisis de las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificación de epítopos de células T CD4 restringidas por HLA-DR basadas en una matriz peptídica (Video) | JoVE Journal

Análisis de las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificación de epítopos de células T CD4 restringidas por HLA-DR basadas en una matriz peptídica

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