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Biology

Schnelle antimikrobielle Empfindlichkeitstests durch stimulierte Raman-Streubildgebung des Deuteriumeinbaus in ein einzelnes Bakterium

Published: February 14, 2022 doi: 10.3791/62398
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,4,5
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

Summary

Dieses Protokoll stellt einen schnellen Test auf antimikrobielle Empfindlichkeit (AST) innerhalb von 2,5 h durch einzelzellstimulierte Raman-Streubildgebung desD2O-Metabolismusdar. Diese Methode gilt für Bakterien im Urin oder Vollblut, was für eine schnelle einzellige phänotypische AST in der Klinik transformativ ist.

Abstract

Um die Ausbreitung antimikrobiell resistenter Infektionen zu verlangsamen und zu verhindern, ist es dringend erforderlich, die antimikrobiellen Wirkungen auf Krankheitserreger quantitativ zu bestimmen. Es dauert in der Regel Tage, um die AST mit herkömmlichen Methoden abzuschließen, die auf der Langzeitkultur basieren, und sie funktionieren nicht direkt für klinische Proben. Hier berichten wir über eine schnelle AST-Methode, die durch stimulierte Raman-Streuung (SRS) -Bildgebung der Deuteriumoxid (D2O) metabolischen Inkorporation ermöglicht wird. Der metabolische Einbau vonD2Oin Biomasse und die Hemmung der Stoffwechselaktivität bei Exposition gegenüber Antibiotika auf Einzelbakterienebene werden durch SRS-Bildgebung überwacht. Die Einzelzellstoffwechsel-Inaktivierungskonzentration (SC-MIC) von Bakterien bei Exposition gegenüber Antibiotika kann nach insgesamt 2,5 Stunden Probenvorbereitung und -nachweis ermittelt werden. Darüber hinaus ist diese schnelle AST-Methode direkt auf Bakterienproben in komplexen biologischen Umgebungen wie Urin oder Vollblut anwendbar. Die SRS-metabolische Bildgebung der Deuteriuminkorporation ist transformativ für eine schnelle einzellige phänotypische AST in der Klinik.

Introduction

Antimikrobielle Resistenz (AMR) ist eine wachsende globale Bedrohung für die wirksame Behandlung von Infektionskrankheiten1. Es wird prognostiziert, dass AMR bis 2050 zusätzliche 10 Millionen Todesfälle pro Jahr und einen globalen BIP-Verlust von 100 Billionen US-Dollar verursachen wird, wenn keine Maßnahmen zur Bekämpfung antibiotikaresistenter Bakterien ergriffen werden 1,2. Dies unterstreicht die dringende Notwendigkeit schneller und innovativer Diagnosemethoden für Antibiotika-Empfindlichkeitstests (AST) von infektiösen Bakterien, um das Auftreten antibiotikaresistenter Bakterien zu verlangsamen und die damit verbundene Sterblichkeitsrate zu senken3. Um das bestmögliche klinische Ergebnis zu gewährleisten, ist es entscheidend, innerhalb von 24 Stunden eine wirksame Therapie einzuleiten. Die aktuelle Goldstandardmethode, wie die Scheibendiffusions- oder Brüheverdünnungsmethode, erfordert jedoch in der Regel mindestens 24 Stunden für das Vorinkubationsverfahren für klinische Proben und zusätzliche 16-24 Stunden, um die Ergebnisse der minimalen Hemmkonzentration (MIC) zu erhalten. Insgesamt sind diese Methoden zu zeitaufwendig, um eine sofortige Entscheidung für die Behandlung von Infektionskrankheiten in der Klinik zu treffen, was zur Entstehung und Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen führt4.

Genotypische AST-Methoden, wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Techniken5, wurden für den schnellen Nachweis entwickelt. Solche Techniken messen die spezifischen Resistenz-Gensequenzen, um schnelle AST-Ergebnisse zu liefern. Sie sind nicht auf zeitaufwändige Zellkulturen angewiesen; Es werden jedoch nur bestimmte bekannte genetische Sequenzen mit Resistenz getestet. Daher ist seine Anwendung auf verschiedene Bakterienarten oder unterschiedliche Resistenzmechanismen beschränkt. Sie können auch keine MIC-Ergebnisse für Therapieentscheidungen liefern 6,7. Darüber hinaus werden neuartige phänotypische Methoden für schnelle AST entwickelt, um diese Einschränkungen zu überwinden8, einschließlich mikrofluidischer Geräte 9,10,11,12,13, optischer Geräte14,15,16, phänotypischer AST zur Quantifizierung der Nukleinsäure-Kopienzahl17,18 und Raman-spektroskopischer Methoden 19. 20,21,22,23,24. Diese Methoden verkürzen die Zeit, um AST-Ergebnisse zu steuern, aber die meisten von ihnen sind nur auf Bakterienisolate anwendbar, nicht direkt auf klinische Proben, und erfordern immer noch eine lange Vorinkubation.

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur schnellen Bestimmung der Empfindlichkeit von Bakterien im Urin und Vollblut durch Überwachung der zellulären Stoffwechselaktivität mittels SRS-Bildgebung vor. Wasser (H2O) ist an der überwiegenden Mehrheit der wesentlichen biomolekularen Syntheseprozesse in lebenden Zellen beteiligt. Als Isotopologe von Wasser kann Deuterium durch enzymkatalysierte H/D-Austauschreaktion zwischen dem redoxaktiven Wasserstoffatom in NADPH und demD-Atom in D2Oin Biomasse innerhalb einer Zelle25,26 eingebaut werden. Eine deuterierte Fettsäuresynthesereaktion wird durch das mit Deuterium markierte NADPH vermittelt. DerD2O-Einbauin Reaktionen von Aminosäuren (AAs) führt zur deuterierten Proteinproduktion26 (Abbildung 1). Auf diese Weise können die neu synthetisierten C-D-Bindungs-haltigen Biomoleküle in einzelnen mikrobiellen Zellen als allgemeiner metabolischer Aktivitätsmarker verwendet werden, um nachgewiesen zu werden. Um de novo synthetisierte C-D-Bindungen auszulesen, wird die Raman-Spektroskopie, ein vielseitiges Analysewerkzeug, das spezifische und quantitative chemische Informationen über Biomoleküle liefert, häufig verwendet, um die antimikrobielle Empfindlichkeit zu bestimmen und die Testzeit auf wenige Stunden deutlich zu reduzieren27,28,29,30 . Aufgrund der inhärenten geringen Effizienz des Raman-Streuprozesses ist die spontane Raman-Spektroskopie jedoch von geringer Detektionsempfindlichkeit. Daher ist es schwierig, Echtzeit-Bildergebnisse mittels spontaner Raman-Spektroskopie zu erhalten. Die kohärente Raman-Streuung (CRS), einschließlich der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) und der stimulierten Raman-Streuung (SRS), hat aufgrund des kohärenten Lichtfeldes eine hohe Detektionsempfindlichkeit erreicht, die um Größenordnungen größer ist als die spontane Raman-Spektroskopie, wodurch eine schnelle, spezifische und quantitative chemische Bildgebung auf Einzelzellebene ermöglichtwird 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Hier, basierend auf unserer jüngsten Arbeit40, präsentieren wir ein Protokoll zur schnellen Bestimmung der metabolischen Aktivität und antimikrobiellen Suszeptibilität durch Femtosekunden-SRS-C-D-Bildgebung vonD2O-Einbauvon Bakterien in das normale Medium, Urin und Vollblutumgebung auf Einzelzellebene. Die Femtosekunden-SRS-Bildgebung ermöglicht die Überwachung der Inaktivierungskonzentration des Einzelzellstoffwechsels (SC-MIC) gegen Antibiotika auf Einzelbakteriumebene innerhalb von 2,5 h. Die SC-MIC-Ergebnisse werden durch Standard-MIC-Test mittels Brühe-Mikrodilution validiert. Unsere Methode ist anwendbar zur Bestimmung der antimikrobiellen Anfälligkeit von bakteriellen Harnwegsinfektionen (UTI) und Blutbahninfektionen (BSI) Erregern mit einer viel kürzeren Assay-Zeit im Vergleich zur konventionellen Methode, was die Möglichkeit für eine schnelle phänotypische AST in der Klinik auf Einzelzellebene eröffnet.

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Protocol

Die Verwendung von menschlichen Blutproben erfolgt in Übereinstimmung mit den Richtlinien des IRB der Boston University und der National Institutes of Health (NIH). Konkret stammen die Exemplare aus einer Bank und sind vollständig deidentifiziert. Diese Exemplare werden vom Büro des Institutional Review Board (IRB) an der Boston University nicht als menschliche Subjekte betrachtet.

1. Herstellung von Bakterien- und Antibiotika-Stammlösung

  1. Die Antibiotika-Stammlösung (Gentamicinsulfat oder Amoxicillin) wird in einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt, gelöst in steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) Lösungsmittel in 1,5 ml Mikroröhrchen. Gentamicinsulfat wird in steriler PBS-Lösung und Amoxicillin in sterilem DMSO-Lösungsmittel gelöst. Danach lagern Sie die Antibiotikalösung wie empfohlen bei 2-8 °C.
  2. Um D2O-haltige kationsangepasste Mueller-Hinton Bouillon (MHB)-Medien herzustellen, fügen Sie 220 mg MHB-Brühebase zu 10 mlD2Ohinzu, um 100%D2O-haltigesMedium herzustellen. Sterilisieren Sie die Lösung durch Filtern von 200 nm Porengröße.
    HINWEIS: Verwenden Sie dieses Protokoll immer für die Herstellung und Sterilisation von Mediumlösungen in weiteren Schritten.
  3. Um Bakterienproben für die SRS-Bildgebung vorzubereiten, geben Sie 2 ml normales MHB-Medium, das kein Deuterium enthält, in ein steriles Kulturröhrchen mit rundem Boden und erwärmen es dann bei 37 °C vor.
  4. Verwenden Sie eine sterile Schleife, um eine Bakterienkolonie (Escherichia coli BW 25113 oder Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) aus der frischen Kultur auf einer tryptischen Soja-Agar-Platte auszuwählen. Dann suspendieren Sie es in den vorgewärmten Kulturmedien und wirbeln Sie vorsichtig, um die Bakteriensuspension vorzubereiten.
  5. Bakterien bei 37 °C in einem Shaker mit 200 Umdrehungen pro Minute (U/min) inkubieren, bis sie die logarithmische Phase erreichen.

2. D2O-Inkorporationsbehandlung in Gegenwart von Antibiotika (Abbildung 2a)

  1. Überprüfen Sie die Bakterienkonzentration, indem Sie die optische Dichte (OD) mit einem Photometer bei einer Wellenlänge von 600 nm messen.
  2. Verdünnen Sie die Bakterienlösung mit dem normalen MHB-Medium, das kein Deuterium enthält, um eine endgültige Zellkonzentration von 8 x 105 KBE/ml zu erreichen. Vortex sanft, um die Bakterienzellen zu mischen.
  3. Bereiten Sie 300 μL Aliquots der Bakterienlösung in sieben 1,5 ml Mikroröhrchen und 600 μL Aliquots der Bakterienlösung in einem 1,5 ml Mikroröhrchen vor.
  4. Fügen Sie 4,8 μl Antibiotikum (Gentamicin oder Amoxicillin) Stammlösung (1 mg / ml) in das Mikroröhrchen mit 600 μL der Bakterienlösung hinzu, um die endgültige Antibiotikakonzentration auf 8 μg / ml zu erhöhen.
  5. Nehmen Sie 300 μL Lösung aus den 8 μg/ml antibiotikahaltiger Bakterienlösung und fügen Sie weitere 300 μL Bakterienlösung hinzu, um eine zweifach verdünnte antibiotische (4 μg / ml) enthaltende Bakterienlösung herzustellen.
  6. Wiederholen Sie die zweifache serielle Verdünnung der Testantibiotika, Gentamicin oder Amoxicillin, bis das Mikroröhrchen mit der niedrigsten Konzentration (0,25 μg / ml) erreicht ist, und verwerfen Sie 300 μL aus dem Röhrchen. Sowohl für Gentamicin als auch für Amoxicillin liegen die seriellen Konzentrationen zwischen 0,25 μg / ml - 8 μg / ml.
    1. Lassen Sie ein Röhrchen ohne Antibiotika zur Blankokontrolle. Dies wird die Positivkontrolle sein, um die bakterielle Stoffwechselaktivität ohne Antibiotikabehandlung, aber mitD2O-Behandlungzu überprüfen.
    2. Lassen Sie ein Röhrchen ohne Antibiotika und ohneD2Ofür die Negativkontrolle.
  7. Inkubieren Sie das bakterielle Aliquot mit dem bestimmten Antibiotikum (Gentamicin oder Amoxicillin), das MHB-Medium enthält, für 1 h.
  8. Während der Inkubation wird eine serielle Verdünnung von Antibiotika mit 100%D2O-enthaltendemMedium mit dem gleichen Konzentrationsgradienten der in Schritt 2.6 hergestellten Antibiotika hergestellt. Sowohl für Gentamicin als auch für Amoxicillin liegen die seriellen Konzentrationen zwischen 0,25 μg / ml - 8 μg / ml.
  9. Nach 1 h Antibiotikabehandlung werden 700 μL seriell verdünntes Antibiotikum und 100% D2O-enthaltendesMHB-Medium zu den 300 μL antibiotikavorbehandelten Bakterien in der gleichen Antibiotikakonzentration (hergestellt in Schritt 2.6) gegeben.
    1. Zum Beispiel fügen Sie 700 μL 100%D2O-haltigesMHB-Medium (mit 8 μg / ml Antibiotikum) zu den 300 μL 8 μg / ml Antibiotika-vorbehandelten Bakterien hinzu. Auf die gleiche Weise auf die entsprechenden Röhrchen der nächsten Konzentration übertragen und homogenisieren, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren.
    2. 700 μL antibiotikafreies 100% D2O-enthaltendesMHB-Medium zu 300 μL antibiotikafreien Bakterien (hergestellt in Schritt 2.6.1) als Blindkontrolle zugeben.
    3. Bei 37 °C in einem Inkubationsschüttler bei 200 U/min für weitere 30 min inkubieren.
      ANMERKUNG: In diesem Schritt beträgt die Endkonzentration vonD2Oim Prüfmedium 70%.
  10. Zentrifugieren Sie zuerst die 1 ml Antibiotikum und D 2O-behandelte Bakterienprobe bei 6200 x g für 5 min bei 4 °C und waschen Sie sie dann zweimal mit gereinigtem Wasser. Zum Schluss werden die Proben in 10%iger Formalinlösung fixiert und bei 4 °C gelagert.

3. Vorbereitung von Bakterien im Urin (Abbildung 2b)

  1. Um E. coli BW 25113 in der logarithmischen Phase herzustellen, folgen Sie den Schritten unter 1.4 und 1.5.
  2. Überprüfen Sie die Bakterienkonzentration, indem Sie den OD mit einem Photometer bei einer Wellenlänge von 600 nm messen.
  3. Um die klinischen UTI-Proben 14,18,41 nachzuahmen, spießen Sie die E. coli-Lösung in 10 ml deidentifizierten Urin, um eine endgültige Zellkonzentration von 10 6 KBE/ml zu erreichen.
  4. Filtern Sie den mit E. coli versetzten Urin mit einem 5-μm-Filter und teilen Sie dann die Bakterienlösung in 300 μL Aliquots in sieben 1,5-ml-Mikroröhrchen und 600 μL-Aliquots der Bakterienlösung in einem 1,5-ml-Mikroröhrchen.
  5. Führen Sie eineD2O-Inkorporationsbehandlung in Gegenwart von Antibiotika und Probenentnahme durch, wie in den vorherigen Schritten von 2.4 bis 2.10 beschrieben.

4. Vorbereitung von Bakterien in der Blutumgebung (Abbildung 2c)

  1. Um Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 in der logarithmischen Phase vorzubereiten, folgen Sie den Schritten unter 1.4 und 1.5.
  2. Um die klinischen Blutbahninfektionsproben42,43 nachzuahmen, Spike P. aeruginosa in 1 ml deidentifizierten menschlichen Blutes, um eine Konzentration von 107 KBE/ml zu erreichen.
  3. Fügen Sie 9 ml steriles gereinigtes Wasser hinzu, um das Blut zu lysieren.
  4. Filtern Sie das Stachelblut von P. aeruginosa mit einem 5-μm-Filter. Dann ernten Sie Bakterien auf 1 ml Volumen durch Zentrifugation bei 6200 x g für 5 min bei 4 °C.  Geben Sie 9 ml vorgewärmtes normales MHB in die Bakterienlösung und wirbeln Sie vorsichtig. Die Endkonzentration der Bakterien beträgt 106 KBE/ml
  5. Die mit P. aeruginosa versetzte Blutlösung in 300 μL Aliquots in sieben 1,5 ml Mikroröhrchen und 600 μL Aliquots der Bakterienlösung in einem 1,5 ml Mikroröhrchen teilen.
  6. Führen Sie eineD2O-Inkorporationsbehandlung in Gegenwart von Antibiotika und Probenentnahme durch, wie in den vorherigen Schritten von 2.4 bis 2.10 beschrieben.

5. SRS-Bildgebungdes D2O-Stoffwechseleinbaus in ein einzelnes Bakterium

  1. 1 ml fixierte Bakterienlösung mit gereinigtem Wasser waschen und dann bei 6200 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand. Die Bakterienlösung auf ca. 20 μL anreichern.
  2. Die Bakterienlösung wird auf einem mit Poly-L-Lysin beschichteten Deckglas abgeschieden. Sandwich und versiegeln Sie die Probe für die SRS-Bildgebung.
  3. Bilden Sie Bakterien bei der C-D-Schwingungsfrequenz bei 2168 cm-1 mit einem SRS-Mikroskop ab.
    1. Geben Sie die Pumpwellenlänge ein und stimmen Sie sie mit der Steuerungssoftware auf einem Computer auf 852 nm ab.
    2. Messen Sie die Laserleistung mit einem Leistungsmesser. Stellen Sie die Leistung des Pumplasers an der Probe auf ~8 mW und die Leistung des Stokes-Lasers an der Probe auf ~40 mW ein, indem Sie die Halbwellenplatte vor dem Laserausgang einstellen.
      HINWEIS: Im SRS-Mikroskop liefert ein durchstimmbarer Femtosekundenlaser mit einer Wiederholrate von 80 MHz die Anregungslaser Pump (680 bis 1300 nm) und Stokes (1045 nm).
  4. Durch Einstellen der Schrauben der Reflexionsspiegel können Sie die Pump- und Stokes-Strahlen räumlich ausrichten und die beiden Strahlen in ein aufrechtes Mikroskop lenken, das mit einem 2D-Galvo-Spiegelsystem für Laserscanning ausgestattet ist.
    1. Verwenden Sie ein 60-faches Wasserimmersionsobjektiv, um die Pumpe und die Stokes-Laser auf die Probe zu fokussieren.
    2. Verwenden Sie einen Ölkondensator, um die Signale von der Probe in Vorwärtsrichtung zu sammeln.
    3. Verwenden Sie einen Bandpassfilter, um den Stokes-Laser herauszufiltern, bevor Sie ihn in eine Fotodiode lenken.
    4. Extrahieren Sie das stimulierte Raman-Signal durch einen Lock-in-Verstärker und erkennen Sie die Signale durch die Fotodiode.
  5. Stellen Sie jedes SRS-Bild auf 200 x 200 Pixel und die Pixelverweilzeit auf 30 μs im Bedienfeld der Software ein. Die Gesamtaufnahmezeit für ein Bild beträgt ~1,2 s. Stellen Sie die Schrittweite auf 150 nm ein, so dass die Bildgröße etwa 30 x 30 μm2 beträgt. Erstellen Sie mindestens drei Sichtfelder für jedes Beispiel.

6. Bildverarbeitung und Datenanalyse ( Abbildung 3)

  1. Um die durchschnittliche C-D-Signalintensität zu erhalten, öffnen und verarbeiten Sie SRS-Bilder mit der ImageJ-Software.
  2. Konvertieren Sie zunächst SRS-Bilder in 8-Bit-Bilder mit umgekehrter Farbe, indem Sie auf Bild | Typ | 8-Bit, und dann Edit | Invertieren Sie Schaltflächen in der ImageJ-Software.
  3. Filtern Sie dann die Bilder mit Gaußscher Unschärfe, indem Sie auf Verarbeitung klicken | Filter | Gaußsche Unschärfe-Schaltflächen und setzen Sie Sigma (Radius) auf 1.
  4. Verwenden Sie die Einstellung des Bildschwellenwerts, um den Bakterienbereich auszuwählen. Klicken Sie auf Bild | Anpassen | Schwellenwert , um sicherzustellen, dass die ausgewählten Bakteriengrößen mit denen in den ursprünglichen SRS-Bildern übereinstimmen. Beseitigen Sie kleine Partikel, indem Sie den Größenschwellenwert anpassen, um die Partikel zu bestimmen. Klicken Sie auf Übernehmen.
  5. Anwenden Analyze | Partikelanalyse-Tasten zur Beschriftung und Bestimmung des Bereichs von Bakterien.
  6. Durch Klicken auf die Schaltfläche Alle anzeigen im ROI-Manager für das ursprüngliche unverarbeitete SRS-Bild, beschriften Sie denselben Bakterienbereich und bestimmen Sie die durchschnittliche Intensität jedes Datenpunkts, indem Sie im ROI-Manager auf die Schaltfläche Messen klicken.
  7. Kreisen Sie den Hintergrundbereich im ursprünglichen SRS-Bild ein und messen Sie die durchschnittliche Intensität des Hintergrunds. Die durchschnittlichen C-D-Intensitäten jedes Bakteriums werden durch Abzug der Hintergrundsignalintensität ermittelt.

7. Quantifizierung der antimikrobiellen Suszeptibilität mittels SC-MIC

ANMERKUNG: Der Cut-off-Wert bei 0,60 zur Bestimmung des SC-MIC wird gemäß der statistischen Analyse der SRS C-D-Intensitäten der metabolismusaktiven und metabolismusgehemmten Bedingungen für Bakterien bei verschiedenen Konzentrationen der Arzneimittelexposition40 festgelegt. Die C-D-Intensitäten für die antibiotikaempfindlichen und antibiotikaresistenten Gruppen wurden mit Normalverteilung ausgestattet.

  1. Zeichnen Sie die ROC-Kurve (Receiver Operating Characterality) und bewerten Sie den Cut-off-Schwellenwert bei 0,60. Basierend auf diesem Cut-off-Wert kann der SC-MIC als Indikator für die Wirksamkeit von Antibiotika definiert werden, um die metabolisch inaktive und metabolisch aktive Gruppe zu bestimmen.
  2. Um die SRS-Bildgebungsdaten quantitativ zu analysieren, zeichnen Sie die Histogramme der C-D-Signalintensitäten für jede Bakteriengruppe, die mit der seriell verdünnten Antibiotikakonzentration behandelt wurde. Die farbigen Datenpunkte stehen für unterschiedliche einzelne Bakterien.
  3. Normalisieren Sie die C-D-Intensitäten der mit Antibiotika behandelten Gruppe auf die mittlere Intensität der Kontrollgruppe ohne Antibiotikabehandlung. Bestimmen Sie die SC-MIC-Ergebnisse verschiedener Bakterien und Antibiotikakombinationen durch Quantifizierung der SRS-Signalintensitäten im C-D-Bereich im Vergleich zu verschiedenen Antibiotikakonzentrationen unter Verwendung des Cut-off-Werts bei 0,60.
  4. Validierung und Vergleich der SC-MIC-Anzeige mit dem MIC, der mit herkömmlichem Brühe-Mikrodilutionstest bestimmt wurde.
  5. Nach Angaben des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) wird die Suszeptibilitätskategorie, die auf den Ergebnissen der SRS-metabolischen Bildgebung für jeden getesteten Bakterienstamm basiert, als "anfällig", "resistent" oder "intermediär" interpretiert.

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Representative Results

Der Effekt der Inkubationszeit auf den Deuteriumeinbau wird durch spontane Raman-Mikrospektroskopie im Bereich C-D (2070 bis 2250 cm-1) und C-H (2.800 bis 3.100 cm-1) gemessen (Abbildung 4a). Die Einzelzell-Raman-Spektren von P. aeruginosa, die in 70%D2O-haltigemMedium kultiviert wurden, zeigen eine zunehmende CD/CH-Intensität über die Inkubationszeit von 0 bis 180 min. (Abbildung 4b) Die zunehmende C-D-Häufigkeit in einzelnen mikrobiellen Zellen zeigt, dassD2Oin deuterierte Biomoleküle innerhalb der Zelle eingebaut ist.

D2O-Markierung über 50% beeinflusst signifikant den bakteriellen Stoffwechsel während einer 23-stündigen Inkubationszeit27. Wir beobachteten eine bakterielle Wachstumshemmung, wenn die D2O-Markierungskonzentration während einer Inkubationszeit von 25 Stunden über 70% liegt (Abbildung S1). Wir haben MIC durch Goldstandard-Brüheverdünnung durchgeführt und SC-MIC-Ergebnisse in zwei P. aeruginosa-Stämmen (P. aeruginosa ATCC 47085 und P. aeruginosa 1133) erhalten (Tabelle S1). Unsere aktuellen Ergebnisse zeigen, dass 70%D2Odie Leistung unserer Methode bei P. aeruginosa nicht beeinflusst. Die Kategorieübereinstimmung unserer SC-MIC-Methode mit der konventionellen kulturbasierten Methode beträgt 100% für alle getesteten P. aeruginosa- und Antibiotika-Kombinationen, wie in Tabelle S1 dargestellt. Wir führen diese gute Übereinstimmung auf die minimale Toxizität von 70%D2Oauf P. aeruginosa während der 30-minütigen Inkubationszeit in SC-MIC-Bestimmung zurück.

Gemäß dem Protokoll wurde P. aeruginosa mit seriell verdünntem Gentamicin für 1 h und dann 70%D2Ofür weitere 30 min inkubiert. SRS-Stoffwechselbildgebung bei ~2168 cm-1 (Abbildung 5a) wurde durchgeführt. Die C-D-Intensitäten bei Antibiotikabehandlung werden durch den Mittelwert der Kontrollgruppe dividiert, die ohne Antibiotikabehandlung auskommt. Die quantitative statistische Analyse (Abbildung 5b) zeigte, dass die C-D-Signale von P. aeruginosa bei 2 μg/ml oder einer höheren Gentamicinkonzentration signifikant niedriger waren als die ohne Gentamicin-Behandlung (0 μg/ml). Unter Verwendung der Cut-off-Schwelle von 0,60 wurde P. aeruginosa bei 2 μg/ml und höheren Gentamicin-Konzentrationen metabolisch gehemmt. Die gestrichelte Linie zeigt den definierten Cut-off-Wert bei 0,60 in Abbildung 5b. Auf diese Weise wurde das SC-MIC für P. aeruginosa gegen Gentamicin im normalen MHB-Medium auf 2 μg/ml bestimmt. Es wird nachgewiesen, dass dieser SC-MIC-Wert innerhalb des einfachen Differenzbereichs mit dem MIC (4 μg/ml) liegt, der durch die Brühe-Mikrodilutionsmethode bestimmt wird (Abbildung 5c). Zusammengenommen ermöglicht SC-MIC, das durch unsere Technologie bestimmt wird, die Quantifizierung der antimikrobiellen Empfindlichkeit.

Um das Potenzial einer schnellen AST durch SRS-Bildgebung der Deuterium-Stoffwechselinkorporation für klinische Anwendungen, insbesondere für die häufigste UTI-Infektion, zu untersuchen, testeten wir bakteriengespickte Urinproben mit E. coli, dem häufigsten Erreger, der eine UTI-Infektion verursacht44. Um die klinischen UTI-Proben in einer relevanten bakteriellen Konzentration nachzuahmen, wird E. coli dem deidentifizierten Urin bis zu einer Endkonzentration von 106 KBE/ml zugesetzt. Nach der Probenreinigung wurden die Urinproben mit Amoxicillin undD2Oinkubiert. Der saubere Hintergrund in den SRS-Bildern zeigte, dass das Probenvorbereitungsprotokoll für die schnelle AST-Messung geeignet war (Abbildung 5d). Die SC-MIC für die E. coli-gespikte Urinprobe gegen Amoxicillin wurde mit 4 μg/ml bestimmt (Abbildung 5e), die die gleiche Empfindlichkeitsanzeige mit der MIC (8 μg/ml) durch konventionelle Brüheverdünnungsmethode für reine E. coli in normalem MHB-Medium aufweist (Abbildung 5f). Diese Ergebnisse zeigten zusammen, dass eine schnelle AST durch SRS-Bildgebung der Deuterium-Stoffwechselinkorporation ein großes Potenzial für die klinische Diagnose von infektiösen UTI-Erregern darstellt.

Im Vergleich zur UTI-Infektion ist die schnelle AST für BSI-Erreger für die In-situ-Untersuchung der bakteriellen Stoffwechselaktivität viel schwieriger, da viele Blutzellen im Blut vorhanden sind. Um die Anwendbarkeit einer schnellen AST durch SRS-Bildgebung der metabolischen D2O-Inkorporation für klinische BSI-Proben zu untersuchen, wurde P. aeruginosa in deidentifiziertem menschlichem Blut nachgewiesen. Wie in Abbildung 5g gezeigt, wurde die C-D-Intensität des SRS-Bildes bei 2168 cm-1 von bakteriellen Signalen dominiert. Da die roten Blutkörperchen keine metabolische Aktivität haben, umD2Ofür die weitere Biosynthese aufzunehmen, stammen die C-D-Signale aus dem metabolischen Deuteriumeinbau lebender Bakterien. Die Phasenmodulation oder das photothermische Signal von Trümmern oder roten Blutkörperchen trug zu den schwachen Hintergrundsignalen bei, ohne die quantitative Analyse des SC-MIC zu beeinflussen. Das SC-MIC-Ergebnis für P. aeruginosa im Blut wurde mit 2 μg/ml bestimmt (Abbildung 5h), was gut mit dem konventionellen Standard-MIC-Ergebnis für P. aeruginosa in normalem Wachstumsmedium übereinstimmte (Abbildung 5i). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass die SRS-metabolische Bildgebung der Deuterium-Stoffwechselinkorporation eine schnelle AST-Methode zur Bestimmung des SC-MIC für Bakterien bei BIS-Infektionen sein kann.

Figure 1
Abbildung 1: Schema für denD2O-Einbauin deuteriertes Lipid und Protein25,26. Deuterium kann durch enzymkatalysierte H / D-Austauschreaktion zwischen dem redoxaktiven Wasserstoffatom in NADPH und dem D-Atom inD2Oin Biomasse innerhalb einer Zelle eingebaut werden. DerD2O-Einbauin Reaktionen von Aminosäuren führt zur Produktion der deuterierten Proteine. Diese Abbildung wurde von Ref.40 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Workflow der schnellen AST durch SRS-metabolische Bildgebung der Deuteriuminkorporation. a) D2O-Einbaubehandlungin Gegenwart von Antibiotika in MHB-Medium und die folgenden SRS-Bildgebungsverfahren. (b) Vorbereitung von Bakterien in Urinumgebung. c) Herstellung von Bakterien in der Blutumgebung. Diese Abbildung wurde von Ref.40 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3. Automatisierte Bildverarbeitung und Dateninterpretation. (a) Rohes SRS-Bild. (b) Bild nach Anpassung der Intensitätsschwelle zur Bestimmung der Fläche der Bakterienzellen. (c) Datenpunkte, die nach dem Partikelanalyseschritt ausgewählt wurden. (d) Die entsprechenden Datenpunkte werden im Rohbild ausgewählt. (e) Ergebnisse der entsprechenden Datenpunkte im Rohbild. (f) Statistische Ergebnisse der durchschnittlichen Intensität der Datenpunkte nach Subtraktion des Hintergrunds. Maßstabsbalken: 10 μm. Diese Abbildung wurde von Ref.40 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4. Einfluss der Inkubationszeit auf den Deuteriumeinbau in Bakterien. (a) Zeitraffermessung im Bereich C-D (2070 bis 2250 cm-1) und C-H (2.800 bis 3.100 cm-1) mittels spontaner Raman-Mikrospektroskopie (gemittelt aus 20 Spektren). (b) Histogrammdiagramm des CD/CH-Intensitätsverhältnisdiagramms über die Inkubationszeit vonD2Ofür Bakterien in (a). Jeder farbige Punkt steht für eine Messung eines einzelnen Bakteriums. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5. SC-MIC-Bestimmung mittels SRS-Bildgebung des bakteriellen metabolischen Einbaus vonD2Ogegen Antibiotika in normalem Medium, Urin und Blutumgebung. (a) SRS-Bildgebung bei C-D-Vibration (2168 cm-1) und die entsprechenden Transmissionsbilder von P. aeruginosa in Gegenwart vonD2Ounter Zusatz von seriell verdünntem Gentamicin in normalem MHB-Medium. b) Quantitative Analyse der SRS C-D-Intensität von P. aeruginosa in (a). Die farbigen Datenpunkte im Histogramm stehen für die verschiedenen einzelnen Bakterien. Die gestrichelte Linie zeigt den Cut-off-Wert bei 0,60 an. c) Vergleich der SC-MIC-Anzeige mit der MIC-Mikrodilutionsmethode und der Suszeptibilitätskategorie für P. aeruginosa gemäß CLSI. (d) SRS-Bildgebung bei C-D-Vibration (2168 cm-1) und entsprechende Transmissionsbilder von E. coli im Urin nach Inkubation inD2Omit dem seriell verdünnten Amoxicillin. e) Quantitative Analyse der SRS C-D-Intensität in Buchstabe d). f) Der Vergleich der SC-MIC-Anzeige und der Empfindlichkeitskategorie für E. coli in normalem MHB und im Urin. (g) SRS-Bildgebung bei C-D-Vibration (2168 cm-1) und entsprechende Übertragungsbilder von P. aeruginosa im Blut nach Inkubation inD2Omit dem seriell verdünnten Gentamicin. h) Quantitative Analyse der SRS C-D-Intensität in Buchstabe g. (i) Der Vergleich der SC-MIC-Anzeige und der Suszeptibilitätskategorie für P. aeruginosa in normaler MHB und im Blut. S: sensibel. Anzahl der Zellen N ≥ 10 pro Gruppe. Fehlerbalken stellen das REM dar. Maßstabsbalken: 10 μm. Diese Abbildung wurde von Ref.40 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Problem Möglicher Grund Lösung
Geringe oder keine bakterielle Zellzahl im bildgebenden Sichtfeld Die Bakteriendichte in der Lösung ist zu gering Längere Zeit zentrifugieren, um Bakterien weiter anzureichern
Photoschädigung der Bakterienzellen während der SRS-Bildgebung Die verwendete Laserleistung ist zu hoch Einstellen der Laserleistung auf einen geeigneten Wert
Es ist kein SRS-Signal erkennbar Die räumliche und zeitliche Überlappung von Pumpe und Stokes-Strahl ist nicht optimiert Ausrichten der Pumpen- und Stokes-Strahlen mit einer Standardprobe deuteriertes Dimethylsulfoxid

Tabelle 1: Tabelle zur Fehlerbehebung.

Abbildung S1: Prüfung der D2O-Toxizität an P. aeruginosa, kultiviert in Lauria-Bertani (LB)-Medium mit unterschiedlichenD2O-Konzentrationen. Fehlerbalken zeigen Standardabweichungswerte an (Anzahl der Messungen = 5). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Tabelle S1. Vergleich von SC-MICs und MICs in normaler MHB von P. aeruginosa nach Antibiotikabehandlung. S: empfindlich; R: widerstandsfähig; I: Mittelstufe. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Eine schnelle AST kann durch die Beurteilung der Reaktion der bakteriellen Stoffwechselaktivität auf die Antibiotikabehandlung unter Verwendung von Einzelzell-SRS-Stoffwechselbildgebung innerhalb von 2,5 Stunden von der Probe bis zu SC-MIC-Ergebnissen erreicht werden. Die Reaktion der bakteriellen Stoffwechselaktivität und der antimikrobiellen Empfindlichkeit kann durch Überwachung des metabolischen Einbaus vonD2Ofür die Biomolekülsynthese unter Verwendung der SRS-Bildgebung von C-D-Bindungen nachgewiesen werden. Da Wasser in lebenden Zellen allgegenwärtig verwendet wird, bietet die SRS-Stoffwechselbildgebung eine universelle Methode für schnelle AST. Die schnelle AST-Methode ist anwendbar, um Bakterien in komplexen biologischen Umgebungen wie Urin oder Vollblut auf einer einzelnen Bakterienebene nachzuweisen. Die SC-MIC kann nach 1,5 h Bakterienkultur in Urin und Blut bestimmt werden, was als transformativ angesehen wird, um das Paradigma der UTI- und BSI-Diagnose von einem zeitaufwändigen kulturabhängigen Verfahren zu einem kulturunabhängigen In-situ-Ansatz zu verschieben. Daher bedeutet es eine enorme Verkürzung der Diagnosezeit im Vergleich zur herkömmlichen Brühe-Mikrodilutionsmethode, die den Weg zur klinischen Translation ebnet und eine rechtzeitige Identifizierung geeigneter antimikrobieller Wirkstoffe für eine präzise Behandlung ermöglicht.

Die hier beschriebenen Protokolle zur Antibiotikabehandlung folgen den Richtlinien der CLSI, in denen das vorgeschlagene MHB-Medium generell für die Kultivierung verschiedenster Mikroorganismen eingesetzt werden kann. Ein Schlüsselparameter ist, dass die bakterielle Zellzahl, die für antimikrobielle Empfindlichkeitstests verwendet wird, bei etwa 5 x 105 KBE/ml gehalten wird, wie in CLSI empfohlen. Dies ist von entscheidender Bedeutung, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. In Antibiotika-Behandlungsexperimenten wird die Bakterienkonzentration auf 8 x 105 KBE/ml festgelegt. Eine höhere Bakterienkonzentration kann zu einer Erhöhung der MIC-Ergebnisse führen. Sobald die Bakteriensuspension eingestellt ist, muss sie innerhalb von 30 Minuten verwendet werden, um Veränderungen der Bakterienzellkonzentration zu vermeiden.

Für die Empfindlichkeitsprüfung eines Antibiotikums wie Daptomycin wird empfohlen, 50 mg / L Kalzium in den Medien zu ergänzen. Das kationenadjustierte MHB-Medium enthält 20-25 mg/LCa2+. Stellen Sie daher sicher, dass das Medium weiter mit zusätzlichem Ca2+ (in Wasser löslich und Filter sterilisiert) in der Konzentration von 30 mg/L ergänzt wird.

Ein weiterer kritischer Schritt in der vorgestellten Methode ist die Inkubationszeit von Bakterien bei Antibiotikaexposition undD2O-Einbau. Da die Generationszeit des bakteriellen Lebenszyklus etwa 30 bis 60 min beträgt, ist es wichtig, die bakterielle Stoffwechselaktivität bei Antibiotikabelastung für eine bestimmte Zeit zu beeinflussen. Dieser Test wurde für eine Vielzahl von Bakterien-Antibiotika-Kombinationen gegen Antibiotika-Exposition für 1 h vor 0,5 hD2O-Behandlungausgewertet. Der erste 1 h Antibiotika-Behandlungsschritt ist essentiell, um die bakterielle Stoffwechselaktivität zu beeinflussen. Anschließend werden Bakterien für weitere 30 min mitD2O-haltigemund antibiotikahaltigem Medium inkubiert. Die endgültigen Antibiotikakonzentrationen werden auf dem gleichen Niveau gehalten, und die Endkonzentration vonD2Owird auf 70% eingestellt. Insgesamt werden nach 1 h Antibiotika-Vorkultur und nach 0,5 hD2Ound Antibiotikaeinbau die SC-MIC-Ergebnisse dann durch SRS-metabolische Bildgebung der bakteriellen Stoffwechselaktivität bestimmt. Dieses Design minimiert den Einfluss desD2O-Einflussesder antimikrobiellen Aktivität auf Bakterien und führt auch zu einem vergleichbaren Auslesen der SC-MIC-Ergebnisse mit den MICs nach der herkömmlichen Methode.

Bei den SC-MIC-Messungen bereiten wir parallel 40 Proben vor, darunter 5 verschiedene Antibiotika mit jeweils 8 Konzentrationen gleichzeitig. Da es jedoch viele manuelle Betriebsverfahren gibt, beträgt die Gesamtuntersuchungszeit für den Nachweis des AST für fünf verschiedene Bakterien-Antibiotika-Kombinationen mehr als 2,5 h. In unserer Methode wurde jedes SRS-Bild, das ~20 einzelne Bakterienzellen enthielt, innerhalb von ~1,0 s in einer einzigen Aufnahme bei 30 μs Pixelverweilzeit aufgenommen. Wir schätzen, dass die gesamte AST-Testzeit für die Untersuchung von 10 Antibiotika für einen Bakterienstamm weniger als 2,5 Stunden von der Probe bis zur SC-MIC-Auslesung betragen würde, was eine enorme Möglichkeit bietet, Hochdurchsatzmessungen durchzuführen. In zukünftigen Arbeiten wird eine automatisierte Probenvorbereitungs- und Bilddatenerfassungsmethode eingesetzt, um den Durchsatz weiter zu verbessern. Die Details zur Problembehandlung sind Tabelle 1 zu entnehmen .

Bei herkömmlichen kulturbasierten AST-Methoden ist es notwendig, klinische Proben stundenlang vorzuinkubieren, um Bakterienisolate für weitere Messungen zu erhalten. Fortschrittliche AST-Methoden für klinische UTI-Proben, wie Raman-Spektroskopie29, Nanoliter-Array6 und digitale Nukleinsäurequantifizierung18, wurden entwickelt, um die Langzeit-Vorinkubation zu beseitigen. Im Vergleich zur HWI-Infektion ist die BSI oder Sepsis viel lebensbedrohlicher18,45, wobei eine schnelle AST für eine präzise Diagnostik in der Klinik dringend erforderlich ist. Es wurde berichtet, dass ein mikroskopisches Bildgebungsverfahren zur Messung der bakteriellen Koloniebildung aus positiven Blutkulturen MIC-Ergebnisse liefert46. Es dauert jedoch mindestens 6 Stunden, um Bakterien zu züchten, um den AST-Test durchzuführen. Darüber hinaus können kommerzielle automatische Systeme47 und Massenspektrometrie48,49-Strategien AST-Auslesungen aus positiven Blutkulturen liefern. Die MIC-Ergebnisse für die klinische Entscheidung können jedoch nicht zur Verfügung gestellt werden. Die AST-Ergebnisse und die MIC-Anzeige sind signifikant, um eine übermäßige Dosierung von Antibiotika an Patienten zu vermeiden, um mögliche Nebenwirkungen in Kliniken zu verursachen, um die Ausbreitung der antimikrobiell resistenten Infektionen zu verlangsamen und zu verhindern50,51. Im Vergleich zu den bestehenden spontanen Raman-Mikroskopie-basierten AST-Methoden reduziert unsere Technologie die Datenerfassungszeit (ca. 600-mal kürzer) aufgrund der Signalverstärkung um Größenordnungen enorm. In dieser Arbeit demonstrieren wir eine schnelle AST durch SRS-Bildgebung des Deuteriumstoffwechsels in einzelnen Bakterien bei einer klinisch relevanten Bakterienkonzentration (105 ~ 106 KBE/ml) entweder im Urin oder im Vollblut. Wie in früheren Ergebnissen gezeigt, werden die MIC-Ergebnisse nach 1 h Antibiotikabehandlung und 30-minütiger Mischung ausD2Ound Antibiotika-Inkubation in Bakterien in Urin und Blut bestimmt. Unsere Methode kann MICs und Suszeptibilitätsklassifizierung für jede Stamm-Antibiotika-Kombination innerhalb von 2,5 h liefern und eröffnet somit einen neuen Weg für die klinische Translation. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Methode ohne die Notwendigkeit von Präkulturierung und Bakterienteilung ein enormes Potenzial im Bereich der schnellen und hohen Durchsatz-AST bei Infektionskrankheiten hat.

Unsere SC-MIC-Methode mittels SRS-Stoffwechselbildgebung eignet sich zum Nachweis von MICs und zur Klassifizierung der Anfälligkeit für infektiöse Krankheitserreger, wenn es um eine Vielzahl von Stamm-Antibiotika-Kombinationen für den klinischen Einsatz geht. Das SC-MIC wird nach 30-minütigemD2O-Einbauin Bakterien in Urin und Blut bestimmt, was eine enorme Verkürzung der Diagnosezeit im Vergleich zur herkömmlichen Brüheverdünnungsmethode bedeutet, die 16 bis 24 Stunden für die Vorinkubation kostet. Um Informationen zur Identifizierung von Krankheitserregern für die klinische Entscheidungsfindung zu liefern, kann die SRS-Stoffwechselbildgebungstechnologie weiter in Diagnoseplattformen integriert werden, die eine schnelle Identifizierung von Krankheitserregern ermöglichen, wie z. B. die matrixgestützte Laserdesorptions-Ionisationszeit-Flugzeit-Massenspektrometrie 49,52,53. Die Kombination von In-situ-Pathogenidentifizierung und schneller AST-Diagnose könnte ein großes Potenzial für die Translation in die Klinik darstellen, die eine rechtzeitige Identifizierung geeigneter antimikrobieller Wirkstoffe für eine präzise Behandlung ermöglicht.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeiten wurden von NIH R01AI141439 bis J.-X.C und M.S und R35GM136223 bis J.-X.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2

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Biologie Ausgabe 180
Schnelle antimikrobielle Empfindlichkeitstests durch stimulierte Raman-Streubildgebung des Deuteriumeinbaus in ein einzelnes Bakterium
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Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J.… More

Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. X. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).

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