Summary
Bakterielle vesikler spiller viktige roller i patogenese og har lovende bioteknologiske anvendelser. Heterogeneiteten til vesicles kompliserer analyse og bruk; Derfor er det nødvendig med en enkel, reproduserbar metode for å skille forskjellige størrelser av vesicles. Her demonstrerer vi bruken av størrelseseksklusjonskromatografi for å skille heterogene vesicles produsert av Aggregatibacter actinomycetemcomitans.
Abstract
Celleveggen til Gram-negative bakterier består av et indre (cytoplasmatisk) og ytre membran (OM), skilt av et tynt peptidoglykanlag. Gjennom vekst kan den ytre membranen bleb for å danne sfæriske ytre membran vesikler (OMVs). Disse OMV-ene er involvert i en rekke cellulære funksjoner, inkludert lastlevering for å være vert for celler og kommunikasjon med bakterieceller. Nylig har det terapeutiske potensialet til OMVs begynt å bli utforsket, inkludert deres bruk som vaksiner og narkotikaleveringskjøretøy. Selv om OMVs er avledet fra OM, har det lenge vært verdsatt at lipid- og proteinlasten til OMV er forskjellig, ofte betydelig, fra OM. Mer nylig har det blitt oppdaget bevis på at bakterier kan frigjøre flere typer OMVs, og det finnes bevis på at størrelse kan påvirke mekanismen for deres opptak av vertsceller. Studier på dette området er imidlertid begrenset av vanskeligheter med effektivt å skille de heterogene OMVene. Tetthet gradient sentrifugering (DGC) har tradisjonelt blitt brukt til dette formålet; Denne teknikken er imidlertid tidkrevende og vanskelig å skalere opp. Størrelseseksklusjonskromatografi (SEC), derimot, er mindre tungvint og gir seg til den nødvendige fremtidige oppskaleringen for terapeutisk bruk av OMVs. Her beskriver vi en SEC-tilnærming som muliggjør reproduserbar separasjon av heterogene vesikler, ved hjelp av som testtilfelle, OMVs produsert av Aggregatibacter actinomycetemcomitans, som varierer i diameter fra mindre enn 150 nm til større enn 350 nm. Vi demonstrerer separasjon av "store" (350 nm) OMVer og "små" (<150 nm) OMVer, verifisert ved dynamisk lysspredning (DLS). Vi anbefaler SEC-baserte teknikker over DGC-baserte teknikker for separasjon av heterogene vesicles på grunn av brukervennlighet, reproduserbarhet (inkludert bruker-til-bruker) og mulighet for oppskalering.
Introduction
Gram-negative bakterier frigjør vesikler avledet fra deres ytre membran, såkalte ytre membran vesicles (OMVs), gjennom vekst. Disse OMVene spiller viktige roller i celle-til-celle-kommunikasjon, både mellom bakterier og verter, så vel som mellom bakterieceller, ved å bære en rekke viktige biomolekyler, inkludert DNA / RNA, proteiner, lipider og peptidoglykaner1,2. Spesielt har OMVs rolle i bakteriell patogenese blitt grundig studert på grunn av deres berikelse i visse virulensfaktorer og toksiner3,4,5,6,7,8,9,10,11.
OMVs har blitt rapportert å variere i størrelse fra 20 til 450 nm, avhengig av foreldrebakteriene og vekststadiet, med flere typer bakterier som frigjør heterogene størrelse OMVs8,12,13,14, som også varierer i proteinsammensetning og mekanisme for vertscelleoppføring12. H. pylori utgitt OMVs som spenner i diameter fra 20 til 450 nm, med mindre OMVs som inneholder en mer homogen proteinsammensetning enn de større OMVs. Det er viktig at de to populasjonene av OMVer ble observert å bli internalisert av vertsceller via forskjellige mekanismer12. I tillegg har vi demonstrert at Aggregatibacter actinomycetemcomitans frigjør en befolkning på små (<150 nm) OMVer sammen med en populasjon av store (>350 nm) OMVer, med OMVs som inneholder en betydelig mengde utskilt proteintoksin, leukotoxin (LtxA)15. Mens OMV-heterogenitetens rolle i cellulære prosesser er helt klart viktig, har tekniske vanskeligheter med å skille og analysere distinkte populasjoner av vesicles begrenset disse studiene.
I tillegg til deres betydning i bakteriell patogenese, har OMVs blitt foreslått for bruk i en rekke bioteknologiske applikasjoner, inkludert som vaksiner og legemiddelleveringskjøretøy16,17,18,19,20. For deres translasjonelle bruk i slike tilnærminger er det nødvendig med et rent og monodispersisk preparat av vesicles. Dermed er effektive og effektive metoder for separasjon nødvendig.
Vanligvis brukes tetthet gradient sentrifugering (DGC) til å skille heterogene størrelse vesiclepopulasjoner fra cellulært rusk, inkludert flagellae og utskilte proteiner21; metoden er også rapportert som en tilnærming til separate heterogene OMV-delpopulasjoner12,13,14. DGC er imidlertid tidkrevende, ineffektiv og svært variabel bruker-til-bruker22 og er derfor ikke ideell for oppskalering. Størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) representerer derimot en skalerbar, effektiv og konsekvent tilnærming for å rense OMVs21,23,24. Vi har funnet ut at en lang (50 cm), tyngdekraftstrøm, SEC-kolonne, fylt med gelfiltreringsmedium, er tilstrekkelig for effektiv rensing og separering av subpopulasjoner av OMVs. Spesielt brukte vi denne tilnærmingen til å skille A. actinomycetemcomitans OMVs i "store" og "små" underbefolkninger, samt å fjerne protein- og DNA-forurensning. Rensing ble fullført i mindre enn 4 timer, og fullstendig separasjon av OMV-subpopulasjonene og fjerning av rusk ble oppnådd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av buffere
- For å forberede ELISA-vaskebufferen, tilsett 3,94 g Tris-base, 8,77 g NaCl og 1 g bovint serumalbumin (BSA) til 1 L deionisert (DI) vann. Tilsett 500 μL polysorbat-20. Juster pH til 7.2 ved hjelp av HCl eller NaOH.
- For å klargjøre blokkeringsbufferen legger du til 3,94 g Tris-base, 8,77 g NaCl og 10 g BSA. Tilsett 500 μL polysorbat-20 til 1 liter DI-vann. Juster pH til 7.2 ved hjelp av HCl eller NaOH.
- For å klargjøre elutionbufferen (PBS), tilsett 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 g Na2HPO4og 0,24 g KH2PO4 til 1 L DI-vann. Juster pH til 7.4 ved hjelp av HCl eller NaOH.
MERK: En 10x løsning av denne bufferen kan gjøres og fortynnes med DI-vann etter behov.
2. Utarbeidelse av OMV-prøve
- Vokse A. actinomycetemcomitans celler til sen eksponentiell fase (optisk tetthet ved 600 nm av 0,7). Pellet cellene ved sentrifugering to ganger ved 10.000 x g ved 4 °C i 10 min. Filtrer supernatanten gjennom et filter på 0,45 μm.
- Konsentrer det bakteriefrie supernatantet ved hjelp av 50 kDa-molekylvekts avskjæringsfiltre. Ultracentrifuge den konsentrerte løsningen ved 105.000 x g ved 4 °C i 30 min.
- Resuspend pellets i PBS og ultracentrifuge igjen (105,000 x g ved 4 °C i 30 min.) Resuspend pellet i 2 ml PBS.
3. Pakking av S-1000-kolonnen
- Bland lagerflasken med gelfiltreringsmedium med en glassrørestang og hell ut i en glassflaske volumet som er nødvendig for å fylle kolonnen, pluss ca. 50% overskudd (ca. 135 ml). La disse perlene sitte til de har avgjort, og deretter dekantere overflødig væske. Resuspend perlene i elution buffer, slik at den endelige løsningen er ca 70% (etter volum) gel, 30% buffer. Degas løsningen under vakuum.
- Monter glasssøylen vertikalt ved hjelp av et ringstativ og fyll med elutionbuffer for å fukte veggene i kolonnen. Tøm bufferen til det bare er ca. 1 cm buffer igjen i kolonnen.
- Uten å lage bobler, rør forsiktig perler inn i kolonnen, fyll kolonnen til toppen. Fortsett å tømme overflødig buffer gjennom hele denne prosessen. Pass på at du ikke lar perlene slå seg helt ned før du legger til flere perler øverst i kolonnen. Kolonnen skal pakkes til en høyde på ca 2 cm under bunnen av kolonnereservoaret.
4. Lasting av prøven og innsamling av brøker
- Degas elutionbufferen under vakuum. Vask kolonnen med to kolonnevolumer (180 ml) elutionbuffer.
- Tillat at den gjenværende bufferen kommer helt inn i kolonnen. Når bufferen har nådd toppen av gellaget, rør forsiktig en 2 ml prøve som inneholder OMVs (ved en lipidkonsentrasjon på ca. 100 - 200 nmol / l) på overflaten av perlene, vær forsiktig så du ikke forstyrrer noen av perlene øverst i kolonnen. La prøven komme helt inn i gelen, det vilt når ingen væske forblir over gellaget.
- Legg forsiktig og sakte til elutionbuffer på toppen av gelkolonnen. Ikke forstyrr det øverste laget av gelen, da dette vil føre til prøvefortynning.
- Plasser et enkelt 50 ml rør under kolonnen og åpne kolonnen. Samle de første 20 ml av eluent. Legg til ekstra elutionbuffer øverst i kolonnen, forsiktig, etter behov for å sikre at kolonnen aldri er tørr.
- Plasser en serie på 1,5 ml rør under kolonnen. Start kolonnen og samle en serie med 1 ml prøver i hvert rør. Etter hvert som prøvene samles inn, fortsetter du å legge til elutionbuffer øverst i kolonnen etter behov. Gjenta til 96 brøker er samlet inn. Stopp kolonnen.
MERK: Prøvene bør oppbevares ved -20 °C for langtidslagring eller 4 °C for korttidslagring inntil videre analyse. - Hvis du vil rengjøre kolonnen, kjører du ett kolonnevolum (90 ml) på 0,1 M NaOH gjennom kolonnen. Kjør to kolonnevolumer (180 ml) elutionbuffer gjennom kolonnen.
5. Prøveanalyse
- For å måle lipidkonsentrasjonen i hver brøkdel, pipette 50 μL av hver brøkdel i en enkelt brønn av en 96-brønns plate. Til hver brønn legger du til 2,5 μL lipofil fargestoff. Inkuber i 15 s. Mål fluorescensintensiteten på en plateleser med en eksitasjonsbølgelengde på 515 nm og en utslippsbølgelengde på 640 nm. For å beregne brøkdelen av all lipid i hver prøve, summer alle utslippsintensitetene og del hver enkelt intensitet med totalen.
- For å måle konsentrasjonen av et bestemt protein, pipette 100 μL av hver brøkdel i en enkelt brønn av en ELISA immuno-plate. Inkuber ved 25 °C i 3 timer.
- Dekanter prøvene. Tilsett 200 μL ELISA vaskebuffer til hver brønn og dekanter. Gjenta fire ganger for totalt fem vasker.
- Tilsett 200 μL blokkeringsbuffer til hver brønn og inkuber i 1 time ved 25 °C. Dekantering.
- Inkuber plater med 100 μL blokkeringsbuffer pluss primært antistoff (1:10,000 for renset antistoff; 1:10 for uoppgjort antistoff) over natten ved 4 °C. Dekantering.
- Tilsett 200 μL ELISA vaskebuffer til hver brønn og dekanter. Gjenta fire ganger for totalt fem vasker.
- Tilsett 100 μL ELISA vaskebuffer pluss sekundært antistoff (1:30,000) til hver brønn. Inkuber i 1 time ved 25 °C.
- Tilsett 200 μL ELISA vaskebuffer til hver brønn og dekanter. Gjenta fire ganger for totalt fem vasker.
- Tilsett 100 μL av 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) ett-trinns løsning og inkuber i 15-30 min eller til en blå farge utvikler seg. Stopp TMB-reaksjonen med 50 μL av stoppløsningen.
- På en plateleser, les absorbansen av hver brønn ved en bølgelengde på 450 nm.
- For å måle den totale proteinkonsentrasjonen, registrer absorbansen ved en bølgelengde på 280 nm (A280) av hver brøkdel, ved hjelp av et UV-vis spektrofotometer.
Et skjema av protokollen vises i figur 1.
Figur 1: Skjematisk for SEC-prosedyre. Kolonnen er pakket med avgasset gelfiltreringsmedium nøye for å unngå bobler og diskontinuiteter, deretter vasket med to kolonnevolumer av elutionbuffer. Deretter pipetteres prøven forsiktig på toppen av gelen, uten å forstyrre gelpakkingen. Kolonnen åpnes og kjøres til prøven helt kommer inn i gelen. På dette tidspunktet plasseres bufferen på toppen av kolonnen, og de første 20 ml eluate samles inn. Deretter samles en serie på 1 ml fraksjoner. Disse fraksjonene plasseres deretter i en 96-brønns plate eller 96-brønns immunplate for analyse av lipid- og proteininnhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser representative resultater fra denne metoden. OMVs produsert av A. actinomycetemcomitans stamme JP2 ble først renset fra kulturen supernatant ved hjelp av ultracentrifugation15. Vi har tidligere funnet ut at denne stammen produserer to populasjoner av OMVs, en med diametre på ca 300 nm og en med diameter på ca 100 nm15. For å skille disse OMV-populasjonene renset vi utvalget ved hjelp av SEC-protokollen beskrevet ovenfor. Hver brøkdel ble analysert for lipidinnhold ved hjelp av lipofilt fargestoff og for toksininnhold (LtxA) ved hjelp av enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) eller en immunoblot. Lipid- og toksinkonsentrasjonene rapporteres som prosenter, der "%lipid" indikerer hvilken prosentandel av det totale lipidinnholdet i prøven som er i hver brøkdel, og "%toksin" indikerer hvilken prosentandel av det totale toksininnholdet i prøven som er i hver brøkdel.
Figur 2A viser gjennomsnittlige lipofile fargestoffresultater med standardavvik fra tre separate rensinger, hver utført av en annen bruker, som demonstrerer reproduserbarheten av denne teknikken. To distinkte lipidtopper observeres, tilsvarende "store" OMVer (brøk nummer 13) og "små" OMVer (brøk nummer 25). Vi bekreftet størrelsen på OMVene i disse toppene ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS) og fant gjennomsnittsdiameterne til OMVene i fraksjonene 13 og 25 for å være henholdsvis 296,6 nm og 142,6 nm, som vist i Fig. 2A. Til sammenligning ble gjennomsnittlig diameter på OMV-prøven etter ultracentrifugation, men før SEC-rensing tidligere funnet å være 161,0 nm15.
I figur 2Bvises mengden LtxA i hver brøkdel, oppnådd ved hjelp av ELISA med et monoklonalt antistoff mot LtxA25, overlagt på lipidkonsentrasjonen fra panel A. Denne teknikken viser at toksinet hovedsakelig er forbundet med en subpopulasjon av OMVer. Figur 2C viser mengden LtxA i hver brøkdel, målt ved hjelp av en immunoblot teknikk med samme anti-LtxA monoklonale antistoff25, lagt på lipidkonsentrasjonen fra panel A. Mens den generelle trenden ligner på det som observeres i figur 2B, er immunoblottilnærmingen mye mindre følsom enn ELISA-teknikken, noe som resulterer i støyende profiler. Figur 2D viser prosentandelen av den totale proteinkonsentrasjonen i hver brøkdel, målt ved hjelp av A280, lagt på lipidkonsentrasjonsprofilen. Dette panelet viser at SEC er i stand til å fjerne betydelige mengder frie proteiner fra OMV-preparatene, som det fremgår av de høye A280-verdiene i fraksjoner større enn 60. (Faktisk finnes det meste av proteinet i disse fraksjonene, som ikke inneholder OMVs, noe som viser at en stor mengde protein ko-renser med OMVs.) I tillegg viser dette resultatet at den totale proteinkonsentrasjonen ikke nødvendigvis korrelerer med konsentrasjonen av spesifikke proteiner. Når det gjelder A. actinomycetemcomtians OMVs, forbinder LtxA hovedsakelig med befolkningen i større OMVs, mens mer av det totale proteinet forbinder med de mindre OMVene.
Sammen viser disse representative resultatene en rekke viktige funksjoner i SEC-protokollen for OMV-rensing. For det første er teknikken svært reproduserbar, selv mellom brukere. For det andre er bruken av et lipofilt fargestoff for å oppdage OMVs i hver brøkdel en enkel og pålitelig metode. For det tredje, for å oppdage spesifikke proteinkonsentrasjoner, er ELISA mer robust enn en immunoblot. For det fjerde er SEC i stand til å fjerne store mengder urenheter, inkludert proteiner og nukleinsyrer.
Figur 2: Representative resultater. A. actinomycetemcomitans JP2 OMVs ble kjørt gjennom SEC-kolonnen, og hver brøkdel ble analysert for lipidinnhold ved hjelp av et lipofilt fargestoff og toksin (LtxA) innhold ved hjelp av et monoklonalt antistoff. (A) Gjennomsnittlig lipidinnhold for hver brøk som rapporteres som en prosentandel av det totale lipidinnholdet, fra tre forsøk. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet ± standardavvik. (B) LtxA-innholdet i hver brøk, rapportert som en prosentandel av det totale LtxA-innholdet, målt ved ELISA med et monoklonalt anti-LtxA-antistoff. (C) LtxA-innholdet i hver brøkdel, rapportert som en prosentandel av det totale LtxA-innholdet, målt ved en immunoblot med monoklonalt anti-LtxA-antistoff. (D) Det totale proteininnholdet i hver brøkdel, rapportert som en prosentandel av det totale proteininnholdet, målt ved A280. Noen av dataene er gjengitt fra Chang et al.26 med tillatelse fra John Wiley og Sons Ltd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi gitt en protokoll for enkel, rask og reproduserbar separasjon av bakterielle OMV-subpopulasjoner. Selv om teknikken er relativt rett frem, er det noen trinn som må utføres ekstremt nøye for å sikre at effektiv separasjon oppstår i kolonnen. For det første er det viktig at gelen lastes inn i kolonnen forsiktig og sakte for å unngå luftbobler. Vi har observert at å forlate gelen ved romtemperatur i flere timer før du laster kolonnen, gjør at gelen kan likevekte og minimerer bobledannelse i kolonnen. Når gelen pipettes inn i kolonnen, bør den forsiktig pipettes langs siden av kolonnen for å minimere turbulens. Til enhver tid under lasting bør overflødig buffer opprettholdes i kolonnen for å unngå diskontinuiteter i den avgjorte gelen. Hvis det skulle oppstå en disjunksjon, tilsett mer buffer og pipette opp og ned for å resuspendere gelen.
På samme måte er det kritisk viktig å laste inn kolonnen med prøve. Fordi prøven blir fortynnet når den passerer gjennom kolonnen, bør den lastede prøven være tilstrekkelig konsentrert før separasjon av SEC. For A. actinomycetemcomitans OMVs har vi funnet ut at en 1 ml prøve som inneholder ca. 100-200 nmol / l lipider er ideell. Etter at prøven er lastet forsiktig øverst i kolonnen uten å forstyrre gellaget, bør kolonnen kjøres bare til prøven helt kommer inn i gelkolonnen. På dette tidspunktet bør kolonnen stoppes slik at et lag med buffer kan legges forsiktig til toppen av gelen. Det er nyttig å laste bare et lite volum (~ 1 ml) buffer, og sikre at gellaget ikke blir forstyrret. Når prøven er kjørt videre inn i gelen, kan bufferen legges til i større mengder, og bekymringen for å forstyrre gellaget er mindre problematisk. Kolonnen kan brukes på nytt flere ganger, så lenge den vedlikeholdes i en fullstendig hydrert tilstand og rengjøres godt (trinn 4.6) mellom kjøringer.
Alle OMV-renselsesprosedyrer følger de samme innledende trinnene som inkluderer bakterievekst, fjerning av bakterieceller og OMV-isolasjon27. Selv om dette "rå" preparatet ofte har blitt brukt i OMV-studier28, blir det stadig tydeligere at et etterfølgende rensetrinn er nødvendig for å fjerne co-utfellende proteiner og andre forurensninger, samt å skille OMV-subpopulasjoner. I OMV-studier fullføres dette rensetrinnet vanligvis ved hjelp av tetthet gradient sentrifugering. I det eukaryote ekstracellulære vesiclefeltet øker bruken av SEC for å skille vesikulære populasjoner og for å fjerne forurensninger i betydning, da det er enklere, raskere og billigere enn DGC29. I tillegg har SEC fordelen av å være mulig å automatisere, i motsetning til DGC29. Således, mens DGC forblir "gullstandarden" for vesicleisolasjon i det bakterielle OMV-feltet, foreslår vi at de mange fordelene med SEC gjør det til en ekstremt nyttig, om ikke bedre, metode for OMV-rensing enn DGC. I dette arbeidet har vi vist at en 1,5 x 50 cm kolonne sephacryl S-1000 er i stand til å skille to subpopulasjoner av OMVs. Vi har også observert at tilnærmingen er i stand til å fjerne nukleinsyrer og frie proteiner fra OMV-løsningen. Tidligere rapporter har funnet SEC å kunne fjerne gratis LPS fra OMV forberedelser, samt28.
Til slutt foreslår vi at SEC holder mye løfte i rensing av bakterielle vesikler. Mens vi har demonstrert teknikkens evne til å skille subpopulasjoner av OMVer produsert av en bestemt bakterie (A. actinomycetemcomitans), forventer vi at teknikken vil bli funnet å være ekstremt verdifull i å analysere andre bakterielle vesicleprøver, da den ser ytterligere bruk. Spesielt etter hvert som de bioteknologiske anvendelsene av OMVs øker, vil behovet for konsistente og rene vesiclepreparater også øke; SEC er en lovende metode for disse applikasjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å rapportere.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Science Foundation (1554417) og National Institutes of Health (DE027769).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | |
| Amicon 50 kDa filters | Millipore Sigma | UFC905024 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9704-100 | |
| ELISA Immuno Plates | Thermo Scientific | 442404 | |
| FM 4-64 | Thermo Scientific | T13320 | 1.5 x 50 cm |
| Glass Econo-Column | BioRad | 7371552 | |
| Infinite 200 Pro Plate Reader | Tecan | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Amresco (VWR) | 0395-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | Amresco (VWR) | 0781-500G | |
| Sephacryl S-1000 Superfine | GE Healthcare | 17-0476-01 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Amresco (VWR) | 0404-500G | |
| Tris Base | VWR | 0497-1KG | |
| Tween(R) 20 | Acros Organics | 23336-2500 |
References
- Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).
- Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
- Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
- Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).
- Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).
- Wai, S. N., et al. Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin. Cell. 115, 25-35 (2003).
- Balsalobre, C., et al. Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli. Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).
- Donato, G. M., et al. Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles. FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).
- Kim, Y. R., et al. Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).
- Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells. Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).
- Turner, L., et al. Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content. Frontiers in Immunology. 9, 1466 (2018).
- Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
- Rompikuntal, P. K., et al. Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).
- Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
- Stevenson, T. C., et al. Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).
- Gujrati, V., et al. Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy. ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).
- Huang, W., et al. Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism. Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).
- Chen, D. J., et al. Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).
- Chen, L., et al. Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).
- Singorenko, P. D., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Science Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
- Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).
- Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane. Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).
- Klimentová, J., Stulík, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).
