Summary
Her beskriver vi et optimeret retinal organoid induktionssystem, som er velegnet til forskellige menneskelige pluripotente stamcellelinjer til at generere retinale væv med høj reproducerbarhed og effektivitet.
Abstract
Retinal degenerative sygdomme er hovedårsagerne til irreversibel blindhed uden effektiv behandling. Pluripotente stamceller, der har potentiale til at differentiere sig til alle typer af retinale celler, selv mini-retinal væv, holde store løfter for patienter med disse sygdomme og mange muligheder i sygdom modellering og lægemiddelscreening. Induktionsprocessen fra hPSCs til retinale celler er imidlertid kompliceret og tidskrævende. Her beskriver vi en optimeret retinal induktionsprotokol til generering af retinale væv med høj reproducerbarhed og effektivitet, der passer til forskellige menneskelige pluripotente stamceller. Denne protokol udføres uden tilsætning af retinosyre, hvilket gavner berigelsen af kegle fotoreceptorer. Fordelen ved denne protokol er kvantificeringen af EB størrelse og plating tæthed til væsentligt at øge effektiviteten og repeterbarheden af retinal induktion. Med denne metode, alle større retinale celler sekventielt vises og rekapitulere de vigtigste trin i retinal udvikling. Det vil lette downstream applikationer, såsom sygdom modellering og celleterapi.
Introduction
Retinal degenerative sygdomme (RDs), såsom aldersrelaterede makuladegeneration (AMD) og retinitis pigmentosa (RP), er karakteriseret ved dysfunktion og død fotoreceptor celler og typisk føre til irreversibel synstab uden effektive måder at helbrede1. Mekanismen bag disse sygdomme er stort set ukendt delvist på grund af mangel på menneskelige sygdomsmodeller2. I løbet af de sidste årtier er der sket betydelige fremskridt inden for regenerativ medicin gennem stamcelleteknologi. Mange forskere, herunder os selv, har vist, at humane pluripotente stamceller (hPSCs), herunder menneskelige embryonale stamceller (hESC' er) og menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC'er), kan differentiere sig til alle typer retinale celler, selv mini-retinale væv gennem forskellige differentieringsmetoder3,4,5,6,7,8,9,10, 11, giver enorme potentiale i sygdom modellering og celleterapi12,13,14.
Induktionsprocessen fra hPSCs til retinale celler er imidlertid meget kompliceret og tidskrævende med lav repeterbarhed, hvilket kræver forskere med rig erfaring og høje færdigheder. Under den komplekse og dynamiske induktionsproces vil en række faktorer påvirke udbyttet af retinal væv15,16,17. Forskellige induktionsmetoder varierer også ofte betydeligt i timing og robust udtryk for retinale markører, hvilket kan forvirre prøveindsamlingen og datafortolkningen3. Derfor ville en enkel protokol med retinal differentiering fra hPSC'er med trinvis vejledning være efterspurgt.
Her, baseret på vores offentliggjorte undersøgelser18,19,20,21, en optimeret retinal induktion protokol til at generere retinale organoider (ROs) med rige kegle fotoreceptorer fra hPSCs er beskrevet, som ikke kræver tilskud af retinosyre (RA). Denne protokol fokuserer på beskrivelsen af multi-trins metode til at generere neural nethinden og RPE. EB-dannelse er den væsentlige del af den tidlige induktionsfase. Både størrelse og plating tæthed af EBs er kvantitativt optimeret, hvilket videnskabeligt forbedrer udbyttet af retinale væv og fremmer repeterbarhed. I anden del af induktionen organiserer optiske vesikler (OVs) sig selv i klæbekulturen og ROs form i suspensionskulturen; tidskurserne og effektiviteten af denne del varierer betydeligt i forskellige hPSC-linjer. Modningen og specifikationen af retinale celler i ROs forekommer hovedsageligt i den midterste og sene fase af induktion. Uden tilsætning af RA kan modne fotoreceptorer med både rige kegler og stænger produceres.
Formålet med denne protokol er kvantitativt at beskrive og detaljer hvert trin for uerfarne forskere at gentage. Forskellige hPSC linjer er blevet med succes induceret i ROs af denne protokol med et robust udbytte af kegle-rige retinale væv og høj repeterbarhed. HPSCs-afledte ROs med denne protokol kan generobre de vigtigste trin i retinal udvikling in vivo, og overleve langsigtede, hvilket letter downstream applikationer, såsom sygdom modellering, lægemiddelscreening, og celleterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kultur og udvidelse af hPSC'er
- HPSC-kultur
- Coat to brønde af en 6-brønds plade med ekstracellulær matrix (ECM, hESC-kvalificeret matrix). Klargør 50 mL af en ECM-opløsning, der indeholder 8-12 μg/mL ECM i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM). I 49 mL DMEM tilsættes 1 mL af den optøede ECM-lageropløsning (50x). Tilsættes 1 mL af ECM-opløsningen til hver brønd af en 6-brønds plade. Inkuberes i 1 time i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2.
- Forbered hPSC-vedligeholdelsesmedium (MM) i overensstemmelse med producentens instruktion.
- Forvarm MM ved stuetemperatur (RT) i 30 min.
- Optø et kryogent hætteglas af hPSC'er (hiPSC'er eller hESC'er) (ca. 1 x 106)fra en flydende nitrogentank ved inkubation i et vandbad ved 37 °C i 30 s.
- Tag hætteglasset ud, og desinficer det forsigtigt med en 75% desinfektionsalkoholspray. Læg den i et biosikkerhedskab.
- Overfør celleaffjedringen fra hætteglasset til et 15 mL-rør, tilsæt 5 mmL forvarmet MM dråbe for dråbe til røret ved hjælp af en 5 mL pipette. I mellemtiden forsigtigt ryste røret til at blande hPSCs .
- Centrifuge røret ved 170 x g i 5 min. Fjern det meste af supernatanten ved hjælp af en 1 mL pipette forsigtigt og efterlad omkring 50 μL supernatant for at undgå at miste cellerne.
- Tilsæt 1 MM MM til røret, og genbrug pellet ved forsigtigt pipetter op og ned en eller to gange med en 1 mL pipette.
BEMÆRK: Overlevelsen af enkelte celler i hPSCs er lav. Små celleklumper med 3-5 celler foretrækkes at holde hPSCs vokser i kolonier. - Fjern ECM fra de forbelagte brønde (trin 1.1.1), tilsæt 1,5 mm MM til hver brønd, og fordel derefter 0,5 mL celleaffjedring pr. Brønd.
- Ryst forsigtigt pladen for at fordele hPSC'erne ensartet, og læg pladen i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2. Bevæg ikke pladen i mindst 24 timer for at fremme celleoverensstemmelse.
- Skift MM hver anden dag og passage hPSCs når sammenløbet har nået omkring 80%.
- Adgang til hPSC'er
BEMÆRK: Vedligeholdelsen af den udifferentierede tilstand i hPSCs er ret kritisk for yderligere applikationer. Under overholdelsesbetingelserne vokser hPSC'er i kolonier med en veldefineret grænse. Cellerne skal passages, når sammenløbet af hPSCs når omkring 80%.- Overhold cellerne under et mikroskop. Marker og fjern mekanisk de tydeligt synlige differentierede celler (<5%), før du passerer.
- Ecm-coated plade forberedes som beskrevet i trin 1.1.1.
- Forvarm MM og 1x fosfatbuffer saltvand (PBS) uden Ca2+ og Mg2+ hos RT.
- Forvarm opløsningen på 0,5 mM EDTA (i 1x PBS) i et vandbad ved 37 °C.
- Fjern mediet fra kulturpladen ved hjælp af et vakuum-aspirationssystem, tilsæt 1 mL 1x PBS i hver brønd for at vaske cellerne ved hjælp af en 1 mL pipette og gentag to gange.
- Der tilsættes 1 mL EDTA-opløsning pr. brønd for at adskille hPSC'erne i en cellekulturinkubator ved 37 °C og 5% CO2 i 5 min. Overskrider ikke den anbefalede inkubationstid for at undgå dissociation til enkelte celler.
- Tag pladen ud og kontroller, om cellerne tages ud under et mikroskop. De sammenflyttede hPSCs løsne op og hver celle kant kan ses, men cellerne kan ikke let komme ud ved forsigtigt at ryste cellepladen.
- Fjern EDTA-opløsningen med en 1 mmL pipette, og tilsæt 1 mm MM for at stoppe dissociationen. Rør forsigtigt hPSC'erne en eller to gange med en 1 mL pipette for at genbruge cellerne. Der er ingen grund til at centrifugere for at indsamle cellerne.
BEMÆRK: Hvis de fleste celler kommer ud af pladen efter inkubation med EDTA, kan cellerne opsamles med centrifuge. - Ecm fjernes fra de forlagte brønde (trin 1.2.2), og der tilsættes 1,5 mm MM pr. brønd.
- Overfør 150-200 μL celleklumper til hver brønd. Generelt kan hPSCs passeres i et forhold på 1:6. For eksempel kan celler fra en brønd af en 6-brønds plade fordeles til seks nye brønde.
- Ryst forsigtigt pladen for at fordele hPSC'erne ensartet og dyrke hPSC'erne i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 i mindst 24 timer uden at røre pladen.
- Skift MM hver anden dag som beskrevet i trin 1.1.
2. Retinal differentiering fra hPSCs
BEMÆRK: Når kolonierne når ~80% sammenløb (Figur 1B), kan de styres til at differentiere sig til retinale organoider efter protokollen sketiseret i figur 1A. For at sikre, at hPSC'erne har høj kvalitet og godt udbytte, evalueres pluripotency med molekylære markører som OCT4 eller NANOG ved hjælp af IFC eller QPCR. HPSC'er bør kasseres, hvis differentierede celler tegner sig for mere end 5 % af de samlede celler. Kontroller for mycoplasma forurening med en mycoplasma detektion kit i henhold til producentens anvisninger. Brug kun mycoplasma-fri hPSCs som mycoplasma kan ændre differentiering kapacitet hPSCs.
- Forberede medier og reagenser
- Tilbered neural induktionsmedium (NIM) ved at blande følgende: 500 mL af Dulbeccos modificerede eagle medium/næringsstofblanding F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 mL af 1% N2-tillæg, 0,5 mL på 0,1% heparin (2 mg/mL i 1x PBS) og 5 mL på 1% MEM Ikke-essentielle aminosyrer (NEAA).
- Forbered retinal differentiering medium (RDM), der indeholder 300 mL AF DMEM/F-12, 200 mL af DMEM grundlæggende, 10 mL af 2% B27 supplement, 5 mL af 1% antimykotisk, og 5 mL af 1% MEM NEAA.
BEMÆRK: Både NIM og RDM filtreres ikke, men der udføres en sterilitetstest. Tag 1 mL medium og tilsæt det i en 35 mm skål, og kultur i 3-7 dage i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2. Mediet kan opbevares ved 4 °C og bør anvendes inden for 2 uger for at sikre komponenternes aktivitet. - Forbered 10 mM Blebbistatin (1.000x) i DMSO. Der tilsættes 1.710 μL DMSO for at opløse 5 mg Blebbistatin for at opnå 10 mM lageropløsning (1.000x), aliquot ved 10 μL/tube og opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK: Alle medier og reagenser skal opvarmes på RT i 30 minutter før brug, medmindre andet er nævnt.
- Embryoid krop (EB) dannelse
- På dag 0 (D0) påbegyndes differentiering. Tag en brønd af hPSCs fra en 6-brønd plade, som er vokset til ~ 80% sammenløb. Cellerne opsamles med EDTA-dissociationsopløsning som beskrevet i trin 1.2.1 til 1.2.6.
- Fjern EDTA-opløsningen, tilsæt 1 ml MM, der indeholder 10 μM Blebbistatin for at stoppe celle dissociation, og indsamle cellerne med en 1 ml pipette. Størrelsen af celleklumper er en af de vigtigste faktorer, der påvirker udbyttet af EBs. Ca. fem celler pr. klump foretrækkes frem for at producere den rigtige størrelse af EBs på D5 til D7.
BEMÆRK: Dette er et vigtigt trin. Rør ikke cellerne for mange gange, da EB-lignende aggregater er svære at danne fra enkelte celler i hPSCs. - Overfør celleaffjedringen (ca. 2 x 106 celler) til en 100 mm ultralav fastgørelses petriskål og tilsæt 9 ml MM indeholdende 10 μM Blebbistatin til fadet.
- Ryst forsigtigt fadet to gange for at fordele cellerne ensartet, og læg fadet i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2.
- På D1, efter at cellerne er kultiveret i mindst 24 timer, skal du tage skålen ud og observere den under mikroskopet. Et stort antal af de små celle aggregater vil blive spontant dannet på dette tidspunkt (Figur 1C).
- Der fremstilles 12 mL blanding med MM og NIM i et 3:1-forhold (9 mL MM og 3 mL NIM) i et 15 mL rør.
- Overfør cellekulturerne til et 15 mL centrifugerør med en 10 mL pipette vinkelret, og tilsæt 10 mL af den forvarmede blanding til skålen.
- Centrifugere røret ved 60 x g i 3 min for at indsamle aggregaterne, fjerne supernatanten ved hjælp af en 5 mL pipette og efterlade omkring 500 μL for at undgå at miste celler.
- Blandingen tilsættes 2 mL til røret, og suspensionen overføres til samme ret (trin 2.2.7).
- Ryst forsigtigt fadet for at fordele celleaggregaterne ensartet, og læg skålen tilbage i inkubatoren.
- På D2 skal der fremstilles 12 mL ny blanding med MM og NIM i et 1:1-forhold (6 mL MM og 6 mL NIM) i et 15 mL rør. Cellemediet skiftes med den friske tilberedte blanding ved at gentage trinnene fra 2.2.5 til 2.2.10.
- På D3 skal du skifte cellemedium med 15 mL NIM som beskrevet ovenfor. Kultur cellerne i mindst 5 dage under suspensionsbetingelserne.
BEMÆRK: Under D1 til D3 skal mediet ændres hver dag, hvilket giver tilstrækkelig ernæring. Siden D3 kan NIM ændres hver anden dag. Også, EBs kan opdeles i flere retter til at give rigelig ernæring.
- Frø EBs
BEMÆRK: På D5 til D7 skal du vælge et passende tidspunkt for at plade EBs på ECM-coatede retter i henhold til størrelsen af EBs. EBs med en omtrentlig diameter på 200 μm er egnet til nethindedifferentiering. Generelt kan en brønd af hPSCs i en 6-brønds plade producere omkring 300 til 1.000 EBs. Variationen i EB-udbyttet varieres efter hPSC-linjerne.- På D4 skal du forberede ECM-coatede retter til EBs klæbekultur. Tilsæt 5 mL ECM til hver 100 mm vævskulturskål (overfladebehandlet), og læg dem i inkubatoren natten over.
- På D5 skal du fjerne ECM fra de forbelagte retter og tilføje 10 mL forvarmet NIM til hver skål.
- Tag fadet med EBs ud. Kontroller kvaliteten af EBs under mikroskopet og sørg for, at de er ret lyse og runde i form. Størrelsen af EBs er omtrentlige 200 μm i diameter. Saml alle EBs i et 15 ML rør. Overfør EBs fra opvasken til et 15 mL rør med en 5 mL pipette. Lad EBs slå sig ned i 5 min. Fjern det meste af supernatanten og efterlad ca. 2 mL medium.
- Fordel EB'erne i de coatede retter, der indeholder 10 mL NIM dråbe for dråbe med en 1 mL pipette. Frø EBs ved en densitet på ca. 2-3 EBs pr. cm2. For eksempel tilsættes ca. 120-180 EBs i en 100 mm skål. For groft at bedømme EB-nummeret skal du placere en dråbe EB-suspension på en coverlip og tælle antallet af EBs under mikroskopet.
BEMÆRK: Belægningsgraden af EBs er en af de vigtigste faktorer, der påvirker effektiviteten af retinal induktion. Tætheden kan også justeres af hver hPSC-linje. - Ryst forsigtigt opvasken for at fordele EBs ensartet. Sæt dem i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2.
BEMÆRK: Opvasken må ikke flyttes i mindst 24 timer for at øge tilslutningen af EBs.
- Induktion af optiske vesikler (OVs) og retinal pigment epitel (RPE) under klæbende forhold
BEMÆRK: Efter at EBs er seedet på ECM-coated overflade, kan hPSC'er udvikle OV-lignende strukturer, som kan observeres allerede D20 efter differentiering. I denne protokol, specifikke vækstfaktorer eller signalering molekyler er ikke forpligtet til at guide hPSCs i retinal skæbne undtagen tilføjelsen af N2 og B27 kosttilskud i medierne.- På D8-D9 skal du fjerne opvasken og observere EBs under mikroskopet. Alle EBs vil blive fastgjort og spredt ud på opvasken (Figur 1D). Tilsæt 10 mL frisk NIM til hver 100 mm skål indeholdende 10 mL gammelt medium. Læg dem tilbage i kuvøsen.
BEMÆRK: Fjern ikke det gamle medie. - På D12 skal halvdelen af mediet skiftes med NIM ved hjælp af en 10 mL pipette. Hold kulturen i inkubatoren.
- På D16 skal du fjerne alle NIM fra opvasken ved hjælp af et vakuum-aspirationssystem. Tilsæt 20 mL RDM til hver skål. Hold dyrkning i RDM og ændre halvdelen af mediet hver anden dag.
- Under D10-D30 observerer cellernes morfologiske ændringer to gange om ugen under et mikroskop og evaluere effektiviteten af retinal differentiering.
BEMÆRK: Siden D10 er øjenfeltdomæner (EF) selvorganiseret i de perifere zoner af klæbende EBs. De OV-lignende strukturer vises mellem D20 til D25, gradvist stikker ud fra fadet, og selv-form en optisk kop, som er omgivet af pigmenteret RPE (Figur 1E). OVs kan let genkendes med den lyse, brydningsdygtige og tykke NR-ring.
- På D8-D9 skal du fjerne opvasken og observere EBs under mikroskopet. Alle EBs vil blive fastgjort og spredt ud på opvasken (Figur 1D). Tilsæt 10 mL frisk NIM til hver 100 mm skål indeholdende 10 mL gammelt medium. Læg dem tilbage i kuvøsen.
- Løsriv og kultur-OVs og RPE i suspension for at opnå retinale organoider (ROs)
- På D28-D35 vises de fleste OVs i opvasken. Brug en wolframnål eller en nål med 1 mL sprøjte til mekanisk at løsne de morfologisk identificerbare OVs sammen med den tilstødende RPE. Kultur dem i suspension.
BEMÆRK: OVs og RPE's udseende og udbytte varierer meget i forskellige hPSC-linjer. Således er tidspunktet for afmontering af OV og RPE fleksibelt. Indlysende OVs med den tilstødende RPE kan løsnes, og derefter flyttes til en lav vedhæftet fil kultur skål, der indeholder RDM. Bliv ved med at dyrke resten af cellerne, indtil alle OVs og RPG'er er løftet op. - Sæt 50-60 OVs i hver 100 mm lav fastgørelseskulturskål, der indeholder 15 mL RDM til ROs-dannelsen (Figur 1F).
- Skift RDM hver 2-3 dage indtil D42, når ROs er godt runde-formet.
- På D28-D35 vises de fleste OVs i opvasken. Brug en wolframnål eller en nål med 1 mL sprøjte til mekanisk at løsne de morfologisk identificerbare OVs sammen med den tilstødende RPE. Kultur dem i suspension.
3. Retinal udvikling og modning
BEMÆRK: I denne protokol kræves serum for at holde ROs vokse og modnes til langsigtet kultur.
-
Retinal laminering og specifikation i ROs
- Klargør 10 mL 100 mM taurin (1.000x) i 1x PBS. Veje 125 mg taurin, og opløses i 10 mL af 1x PBS. Opløsningen filtreres med et sprøjtefilter på 0,22 μm. Aliquot ved 500 μL/tube, og opbevares ved -20 °C.
- Forbered retinal kultur medium 1 (RC1). Bland følgende komponenter: 250 mL DMEM/F-12, 175 mL DMEM basic, 50 mL føtalt kvægserum, 10 mL 2% B27-tillæg, 5 mL 1% antimykotisk antimykotisk antibiotika, 5 mL 1% MEM NEAA, 0,5 mL af 100 μM taurin og 5 mL af 2 mM L-alanyl-L-glutamin.
- Tilbered nethindekulturmedium 2 (RC2), der indeholder 450 mL DMEM/F-12, 50 mL fosterkvægserum, 5 mL 1% N2-tilskud, 5 mL 1% antimykotisk antibiotika, 0,5 mL af 100 μM taurin, 5 mL på 1% MEM NEAA og 5 mL af 2 mM L-alnyl-L-glutamin.
BEMÆRK: RC1 og RC2 er ikke filtreret, men gennemgår en sterilitetstest. Tag 1 mL medium, tilsæt det til en 35 mm skål, og kultur i 3-7 dage i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2, for at sikre sterilitet før brug. Mediet kan opbevares ved 4 °C og bør anvendes inden for 2 uger for at sikre komponenternes aktivitet. Alle medier og reagenser skal forvarmes på RT i 30 minutter før brug. - På D42 skal du skifte kulturmediet fra RDM til RC1.
- Vip opvasken på omkring 30 ° og lad ROs slå sig ned i 30 s. Fjern den gamle RDM med en 10 mL pipette efterlader omkring 1 mL medium for at undgå at miste ROs. Tilsæt 15 mL frisk RC1 til hver skål.
- Ryst forsigtigt opvasken for at fordele ROs ensartet. Sæt opvasken tilbage i inkubatoren. Skift hele mediet to gange om ugen derefter.
- Under D50-D90 skal du vælge høj kvalitet af ROs til langsigtet kultur, som er rundformet med en tyk og lys NR. Placer 30-40 ROs i en 100 mm lav fastgørelsesret med 20 mL RC1, og skift hele mediet to gange om ugen.
- For den langsigtede suspension kultur ROs, pipette ROs at undgå RO-RO reattaching ved hjælp af en pipette. Overfør ROs til nye kulturretter en gang om måneden for at undgå, at ROs klæber til opvaskens overflade.
BEMÆRK: Under suspensionskulturforholdene er ROs rundeformede, med en lys og tyk NR-ring fastgjort med mere eller mindre RPE i den ene side. Lamineret neural nethinde udvikle og retinale celle undertyper sekventielt vises med retinale ganglion celler først genereret, efterfulgt af fotoreceptor celler, amakrine celler, og bipolare celler.
-
Human fotoreceptor modning med berigelse af kegler i ROs
- Efter D90 skal du skifte medium fra RC1 til RC2, som er egnet til fotoreceptormodning.
- Ændre mediet som beskrevet i trin 3.1.7-3.1.8.
BEMÆRK: Under denne kulturtilstand kan RO'er vokse langsigtet (Figur 1G), op til D300-testet. Retinale celler i ROs bliver modne, og alle celleundertyper af neural nethinde, herunder muller glialceller, stænger og kegler er også erhvervet. Uden nogen tilføjelse af RA er kegle fotoreceptorer også rige på ROs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den retinale induktion proces i denne protokol efterligner udviklingen af menneskelige foster nethinden. For at indlede nethindedifferentiering blev hPSC'er adskilt i små klumper og kultiveret i suspension for at fremkalde dannelsen af EBs. På D1 dannes de uniformerede celleaggregater eller EBs (figur 1C). Kulturmediet blev gradvist skiftet til NIM. På D5 blev EBs forgyldt på de ECM-coatede kulturretter. Cellerne migrerede gradvist ud af EB'erne (figur 1D). Fra D10, øjenfelter selvorganiseret i den perifere zone af klæbende EBs. På D16 blev induktionsmediet erstattet af RDM. Derefter dannede NR-domænerne gradvist, stak ud fra skålen og selvdannede OV-lignende strukturer omgivet af RPE-cellerne (Figur 1E). Under D28-D35 blev OVs sammen med den tilstødende RPE løftet op med en skarp nål og kultiveret i suspension. Under suspension kultur betingelser, ROs selvdannet bestående neural nethinden (NR) fastgjort med mere eller mindre RPE kugle på den ene side (Figur 1F) og kunne overleve og modne overarbejde, så længe FBS blev tilføjet til mediet.
Som retinal differentiering og specifikation skred frem, hPSCs produceret alle større retinale celle undertyper sekventielt. Undertyperne af neural nethinden gradvist linet op i lag, efterligne arkitektur funktioner indfødte menneskelige nethinde (Figur 2A-G). Retinal ganglion celler (RGCs) blev først genereret fra retinale forfædre og akkumuleret i den basale side af NRs. Photoreceptor celler placeret i den apikale side, mens amakrine celler, vandrette celler, bipolare celler, og muller glial celler alle placeret i det mellemliggende lag af NRs.
Med denne protokol udviklede ROs sig til de meget modne fotoreceptorer med både stænger og kegler (Figur 2G-I). Fotoreceptorer steg hurtigt i det udviklende atomlag (Figur 2G) efter uge 8 og modnedes gradvist fra uge 17 og fremefter. Fra uge 21 kan alle undertyper af fotoreceptorer, herunder stænger, rød/ grønne kegler og blå kegler, detekteres i ROs. Både rige stænger og kegler kan fås i denne induktion protokol uden nogen tilføjelse af RA hele differentiering proces.
Figur 1: Induktion og morfologiske træk ved retinale organoider fra hPSC'er. (A) Skemaer af retinal induktion fra hPSC'er. (B) En typisk koloni af hPSC'er (10x). (C) EBs på D1 (4x). (D) På D7 blev belagt EBs fastgjort og spredt ud på opvasken (4x). (E) På D25 dannedes og stak den optiske vesikellignende strukturer (OVs) ud af fadet (angivet af den røde cirkel), omgivet af pigmenteret RPE (4x). (F) Retinal organoider selvformede efter OVs blev løftet op og dyrkes i suspension betingelser (pilene pegede NR og RPE (4x). (G) En retinal organoid bestående af NR (rød pil) og RPE (sort pil) på D180 (4x). Skalalinjer = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Undertyper af retinale celler blev sekventielt opdaget i tredimensionelt retinalvæv. Eksempel billeder af store retinale celletyper, der udtrykker specifikke markører ved immunfluorescent farvning. (A-B) Retinal stamfader celler udtrykt Ki67 (A) og VSX2 (B). (C) Islet1 positive retinale ganglion celler placeret i den basale side af neural nethinden. (D) Amakrine celler positive for AP2α. (E) Muller gliaceller positive for SOX9. (F) PKCα positive bipolare celler. (G) Recoverin positive fotoreceptor celler. (H) Rhodopsin positive stang fotoreceptorer. (I) L/M-opsin positive kegle fotoreceptorer. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne multi-trins retinale induktion protokol, hPSCs blev guidet trin for trin for at få retinal skæbne, og selvorganiseret i retinale organoider, der indeholder lamineret NR og RPE. Under differentiering, hPSCs rekapituleret alle større trin i den menneskelige retinale udvikling in vivo, fra EF, OV, og RPE, til retinal laminering, generere alle undertyper af retinale celler, herunder retinale ganglion celler, amakrine celler, bipolare celler, stang, og kegle fotoreceptorer, og muller glial celler i en rumlig og tidsmæssig rækkefølge. Recapitulation af retinal udvikling ville gavne downstream applikationer, såsom retinal sygdom modellering.
Et par protokoller er blevet etableret for at generere retinale organoider fra hPSCs3,4,5,6,7,8,9,10,13,14,15,16,17,18,19,20 . Ifølge kulturbetingelserne kan protokollerne klassificeres i 2D, 3D og kombinationen af 2D- og 3D-tilgange9,13. 2D nærmer sig6,10,22 betyder, at al induktionsprocessen forekommer i de klæbende kulturforhold og genererer retinale celler uden arkitektur fra hPSCs. I modsætning hertil 3D nærmersig 7,11,23 betyder alle induktion proces er under suspension kultur betingelser, der giver organiseret retinal væv. For eksempel rapporterede Sasai, Y. et al.7,24 en SFEBq-metode (serumfri flydende kultur af embryonale kropslignende aggregater med hurtig reaggregation) for at guide EFC'er til at differentiere sig til optiske kopper i suspensionskultur. Ved hjælp af multi-trins 3D-tilgange8,11,18,20,25 inklusive denne protokol er hPSCs blevet induceret mod retinale skæbner og organoider under både overholdelses- og suspensionskulturforhold.
For at fremkalde hPSCs til neural retinal skæbne, en række udefrakommende faktorer er blevet tilføjet til medierne i mange protokoller. For eksempel tilføjede Lamba, et al.26 en kombination af noggin (en hæmmer af BMP-stien) og Dickkopf-1 (dkk1, en antagonist af Wnt/β-catenin signaleringsvejen) og insulinlignende vækstfaktor-1 (IGF-1) for at lede EFC'er til en forreste neural skæbne. Osakada et al.6 tilføjede DAPT (en Hak signalering veje hæmmer) og venstre-højre bestemmelse faktor A (en WNT signalering veje hæmmer) for at opnå stang og kegle fotoreceptor prækursorer. Kuwahara et al.27 og Capowski et al.3 tilføjede BMP4 for kort, tidlig eksponering af hPSCs kultur for at forbedre OV-produktionen. I modsætning hertil, denne optimerede retinal induktion protokol er enkel og billig uden at kræve extrinsic signalering modulatorer undtagen den grundlæggende supplement af N2 og B27.
Retinosyre (RA) spiller en vigtig rolle i retinal udvikling og fotoreceptor bestemmelse28,29,30. De fleste protokoller blev udviklet med tillægget af RA (0,5-1 μM) i visse perioder. Vores undersøgelser har vist , at for høj koncentration af RA eller for lang periode med RA-behandling resulterer i stangrige fotoreceptorer, men hæmmer kegledifferentiering8,18. Men i denne optimerede protokol, RA er ikke føjet til kulturmedierne i hele differentieringsprocessen18, fremme produktionen af kegle fotoreceptorer, som er ansvarlig for den menneskelige dag-tid vision og farve vision og kræves for celle udskiftning af RD behandling. Selv om nogle undersøgelser afslører skjoldbruskkirtlen hormon signalering leder kegle undertyper i mus og human nethinde31,32, regulatoren for kegle engagement er stadig uklart33. I disse undersøgelser fra Kim et al.34 og Lowe et al.35, den langsigtede kultur også uden nogen udefrakommende retinsyre genereret kegle-rige retinale organoider, som er i overensstemmelse med denne optimerede protokol.
De vigtigste punkter i denne protokol er at gøre EBs af høj kvalitet og at så EBs korrekt. Celler vokser hurtigt under tidlig EB suspension kultur. Mediet skal ændres hver dag og være nok til at give rigelig ernæring. Størrelsen af EBs, omtrentlige 200 μm i diameter, er egnet til retinal differentiering. Belægningsgraden af EBs ved 2-3 EBs pr. cm2 er velegnet til de fleste hPSC-linjer. Den bedste fordel ved denne optimerede protokol er kvantificeringen af EB størrelse og plating tæthed til væsentligt at øge effektiviteten og repeterbarheden af retinal induktion. Vi har klart beskrevet alle trinene i detaljer, hvilket i høj grad hjælper de uerfarne forskere med at lære og gentage den retinale induktion.
Derudover afhænger nethindeindsugningseffektiviteten i høj grad af kvaliteten og differentieringsstyrken af hPSCs36,37. Forskellige hPSC'er har forskellige effektivitetsgevinster. Nogle hPSC linjer faktisk har dårlig effektivitet, hvilket kan skyldes omprogrammering metoder, somatiske celler, og så videre. Denne protokol er blevet bekræftet at være egnet til forskellige hPSCs at opnå 3D retinale organoider og RPE, herunder forskellige hESCs og hiPSCs omprogrammeret fra fibroblaster, blod og urinceller18,20,21. Generelt, med denne protokol beskrevet ovenfor, en brønd af hPSCs (ca. 80% sammenløb) i en 6-brønd plade kan generere omkring 1.000 EBs, hvilket giver omkring 200 ROs. Derfor er denne protokol med høj effektivitet velegnet til storskala produktion af retinale organoider og fordele downstream applikationer, herunder grundlæggende og translationel undersøgelse.
Sammenfattende er den optimerede retinale induktionsprotokol enkel og billig med høj repeterbarhed og effektivitet, tilbyder lovende personlige modeller af retinale sygdomme og giver rigelig cellekilde til celleterapi, lægemiddelscreening og genterapitest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Xiufeng Zhong er patent opfinder relateret til dannelsen af retinale celler fra menneskelige pluripotente stamceller.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af National Key R &D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), Science &Technology Project of Guangdong Province (2017B020230003), Natural Science Foundation (NSF) i Kina (81570874, 81970842), Hundred talentprogram for Sun Yat-sen University (PT1001010) og de grundlæggende forskningsfonde i statens nøglelaboratorium for oftalmologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
References
- Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).
- Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
- Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
- Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).
- Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
- Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
- Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).
- Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286 (2015).
- da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
- Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).
- Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
- Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
- Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
- Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
- Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
- DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).
