Summary
Nous décrivons la méthode d’analyse quantitative de la distribution des conidies d’Aspergillus fumigatus (taille de 3 μm) dans les voies respiratoires de souris. La méthode peut également être utilisée pour l’analyse de la distribution des microparticules et des agglomérats de nanoparticules dans les voies respiratoires dans divers modèles d’état pathologique.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia sont des agents pathogènes en suspension dans l’air qui peuvent pénétrer dans les voies respiratoires humaines. Les personnes immunocompétentes sans allergies présentent une résistance et une tolérance immunologique, tandis que chez les patients immunodéprimés, les conidies peuvent coloniser les voies respiratoires et provoquer de graves troubles respiratoires invasifs. Diverses cellules dans différents compartiments des voies respiratoires sont impliquées dans la réponse immunitaire qui empêche l’invasion fongique; cependant, les aspects spatio-temporels de l’élimination des agents pathogènes ne sont pas encore complètement compris. L’imagerie tridimensionnelle (3D) d’organes de montage entier optiquement nettoyés, en particulier les poumons de souris expérimentales, permet de détecter des agents pathogènes marqués par fluorescence dans les voies respiratoires à différents moments après l’infection. Dans la présente étude, nous décrivons une configuration expérimentale pour effectuer une analyse quantitative de la distribution des conidies d’A. fumigatus dans les voies respiratoires. En utilisant la microscopie à balayage laser confocale fluorescente (CLSM), nous avons tracé l’emplacement des conidies étiquetées par fluorescence dans les branches bronchiques et le compartiment alvéolaire 6 heures après l’application oropharyngée sur des souris. L’approche décrite ici était précédemment utilisée pour la détection de l’emplacement précis de l’agent pathogène et l’identification des cellules interagissant avec l’agent pathogène à différentes phases de la réponse immunitaire. La configuration expérimentale peut être utilisée pour estimer la cinétique de l’élimination de l’agent pathogène dans différentes conditions pathologiques.
Introduction
Sur une base quotidienne, les gens inhalent des agents pathogènes en suspension dans l’air, y compris des spores de champignons opportunistes Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) qui peuvent pénétrer dans les voies respiratoires1. Les voies respiratoires des mammifères sont un système de voies respiratoires de différentes générations qui se caractérisent par les différentes structures des parois des voiesrespiratoires2,3,4. Les parois trachéobronchiques sont constituées de plusieurs types de cellules parmi lesquelles des cellules ciliées qui fournissent la clairance mucociliaire5. Dans les alvéoles, il n’y a pas de cellules ciliées et les agents pathogènes pénétrants de l’espace alvéolaire ne peuvent pas être éliminés par la clairance mucociliaire6. De plus, chaque génération de voies respiratoires est une niche pour de multiples populations de cellules immunitaires et des sous-ensembles de ces populations sont uniques pour certains compartiments des voies respiratoires. Ainsi, les macrophages alvéolaires résident dans les compartiments alvéolaires, tandis que la trachée et les voies respiratoires conductrices sont tapissées de cellules dendritiques intraépithéliales7,8.
La taille approximative des conidies d’A. fumigatus est de 2 à 3,5 μm9. Étant donné que le diamètre des petites voies respiratoires chez l’homme et même chez la souris dépasse 3,5 μm, il a été suggéré que les conidies peuvent pénétrer dans l’espace alvéolaire2,10,11. En fait, l’examen histologique a montré la croissance fongique dans les alvéoles des patients souffrant d’aspergillose12. Des conidies ont également été détectées dans les alvéoles de souris infectées à l’aide d’une imagerie vivante des tranches pulmonaires épaisses13. Simultanément, des conidies ont été détectées dans le côté luminal de l’épithélium bronchique de souris14.
L’imagerie tridimensionnelle (3D) des poumons de souris à monture entière optiquement dégagés permet une analyse morphométrique des voies respiratoires15. En particulier, l’analyse quantitative de la distribution du nerf pleural viscéral a été réalisée à l’aide d’échantillons pulmonaires de souris optiquement éliminés15. Récemment, Amich et al.16 ont étudié la croissance fongique après application intranasale de conidies sur des souris immunodéprimées à l’aide d’une microscopie à fluorescence à feuille de lumière d’échantillons pulmonaires de souris optiquement nettoyés. L’emplacement précis des conidies de repos dans les voies respiratoires à différents moments après l’infection est important pour identifier les populations cellulaires qui peuvent fournir une défense antifongique suffisante dans certaines phases de l’inflammation. Cependant, en raison de sa taille relativement petite, les aspects spatio-temporels de la distribution des conidies d’A. fumigatus dans les voies respiratoires sont mal caractérisés.
Nous présentons ici une configuration expérimentale pour l’analyse quantitative de la distribution des conidies d’A. fumigatus dans les voies respiratoires de souris infectées. En utilisant la microscopie confocale à balayage laser fluorescent (CLSM) des poumons optiquement nettoyés de souris qui ont reçu une application oropharyngée des conidies A. fumigatus étiquetées fluorescentes, nous obtenons des images 3D et effectuons le traitement d’image. En utilisant l’imagerie 3D du lobe pulmonaire à monture entière, nous avons précédemment montré la distribution des conidies d’A. fumigatus dans les voies respiratoires conductrices de souris 72 heures après l’application de conidies8.
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Protocol
Toutes les méthodes concernant les animaux de laboratoire décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Institut de chimie bioorganique Shemyakin et Ovchinnikov de l’Académie des sciences de Russie (numéro de protocole 226/2017).
1. Application de A. fumigatus conidia
- Pour obtenir des conidies A. fumigatus étiquetées par fluorescence, fixez 5 × 10à 8 conidies en ajoutant 1 mL de paraformaldéhyde à 3 % à la pastille de conidie. Incuber dans un tube à essai de 50 mL pendant 2 h sur un agitateur à température ambiante.
- Laver les conidies avec 20 mL de solution saline tampon phosphate (PBS) : centrifuger à 1 000 x g pendant 15 min, retirer doucement le surnageant et ajouter le PBS frais dans un volume de 20 mL. Répéter.
- Dissoudre les conidies dans 900 μL de 0,1 MNaHCO3.
- Dissoudre l’ester de succinimidyle du colorant fluorescent de 594 nm dans 100 μL de sulfoxyde de diméthyle et ajouter aux conidies.
- Incuber les conidies avec le colorant pendant 1 h sur un agitateur à 150 tr/min à température ambiante.
- Laver les conidies deux fois avec 20 mL de PBS dans la centrifugeuse à 1 000 x g pendant 15 min.
- Diluer les conidies à une concentration de 1 × 108 conidies/mL dans du PBS et conserver à 4 °C.
- Anesthésiez la souris avec 0,5-3% de vapeur d’isoflurane. Placez la souris sur le support, fixez la langue avec une pince lisse et tenez les narines. Prenez une pipette à canal unique et appliquez 50 μL de suspension de conidies sur le pharynx de la souris. Attendez que la suspension soit inhalée.
2. Préparation de l’échantillon
- Préparer le tube à essai de 50 mL et le remplir de 15 mL de paraformaldéhyde frais à 2 %. Placer les instruments médicaux (pinces à dissection dentées de 15 cm, pinces à pointe fine de 8 cm et ciseaux de 10 cm aux extrémités émoussées) dans une solution d’éthanol à 70%.
- Euthanasier la souris conformément au protocole IACUC. Ensuite, placez la souris en position dorsale et fixez les pattes de la souris avec des aiguilles.
REMARQUE: Si vous utilisez la luxation cervicale pour l’euthanasie, assurez-vous de l’intégrité de la trachée.- Traitez la souris avec de l’éthanol à 70% à l’aide d’un pulvérisateur.
- Faites une coupe longitudinale médiane dans la peau ventrale des pattes postérieures aux pattes antérieures et au menton.
- Séparez la peau du tissu sous-cutané à l’aide de pinces dentées et de ciseaux fermés. Fixez les extrémités supérieures de la peau avec des aiguilles.
- Faites une incision dans la paroi abdominale et séparez le foie du diaphragme. Choisissez soigneusement le diaphragme avec des ciseaux fermés, puis coupez le diaphragme.
- Faites une coupe médiale des tissus conjonctifs du thorax et du cou jusqu’à ce que la trachée soit visible.
- Passez un fil de soie sous la trachée et faites un nœud chirurgical à l’aide de deux pinces.
REMARQUE: Alternativement, utilisez de la soie dentaire au lieu de fil de soie.- Tirez soigneusement le fil et coupez les poumons du tissu conjonctif avec des ciseaux. Tenez les ciseaux perpendiculairement à la table.
- Mettez les poumons dans le tube à essai de 50 mL avec 2% de paraformaldéhyde. Laissez les extrémités du fil à l’extérieur du tube, placez le couvercle hermétiquement et retournez le tube pour couvrir les poumons de paraformaldéhyde. Maintenez les poumons pendant la nuit à 4 °C.
- Disséquez les lobes pulmonaires du cœur et les uns des autres avec un scalpel.
- Placez les lobes pulmonaires dans une plaque de 24 puits, chaque lobe présentant un puits séparé. Laver les lobes pulmonaires dans 1 mL de solution saline tamponnée Tris (TBS) pH 7,4, 5 fois pendant 1 h chacun sur un agitateur à 150 tr/min.
- Remplacer 1 mL de TBS par 1 mL de tampon bloquant (1 % de Triton X 100, 5 % de lait en poudre dans tbS) et laisser l’échantillon toute la nuit à température ambiante sur un agitateur.
- Remplacer le tampon bloquant par 1 mL de conjugué streptavidine-488 nm fluorchrome dilué 1:30 dans tbS. Laisser l’échantillon pendant au moins 72 h à température ambiante sur un agitateur (150 tr/min).
- Laver l’échantillon 5 fois pendant 1 h chacun dans 1 mL de TBS à température ambiante sur un agitateur (150 tr/min). Transférer l’échantillon dans les nouveaux puits et le recouvrir de 2 % de paraformaldéhyde pendant la nuit à 4 °C pour la post-fixation.
3. Clairance optique du lobe pulmonaire de la souris
- Placer l’échantillon dans la bouteille en verre de 5 mL remplie de 3 mL de solution méthanol-eau à 50 % et le mettre sur le mélangeur d’échantillons à température ambiante pendant 1 h.
- Remplacez 3 mL de méthanol à 50 % par 3 mL de méthanol à 100 % et mettez-les sur le mélangeur d’échantillons pendant 2 h. Préparer un mélange 1:2 v/v d’alcool benzylique et de benzoate de benzyle (BABB) dans un volume total de 1 mL.
- Transférer l’échantillon dans une plaque de 24 puits et recouvrir de 1 mL de mélange BABB pendant au moins 30 min. Ne laissez pas le spécimen dans BABB pendant une longue période; BABB peut endommager la plaque en plastique et rendre l’échantillon trop rigide.
- Placez l’échantillon dans la chambre à fond de verre de couverture d’imagerie cellulaire. L’échantillon est prêt pour l’imagerie.
4. Imagerie du lobe pulmonaire de souris avec CLSM
- Allumez le système de microscope. Ouvrez le logiciel du microscope. Allumez le voyant de transmission dans l’onglet Localiser. Sélectionnez l’objectif 10x.
REMARQUE: Pour une analyse plus détaillée, utilisez l’objectif 20x, mais il augmente la durée de l’expérience et la taille du fichier image. - Placez la chambre avec l’échantillon dans le porte-glissière du couvercle. Placez le support sur la scène XY au-dessus de l’objectif. Centrez l’échantillon à l’aide des commandes XY de la scène au-dessus de l’objectif. Utilisez le voyant de transmission et l’oculaire pour trouver manuellement le plan Z de l’échantillon.
- Basculez le logiciel vers l’onglet Acquisition. Sélectionnez CLSM λ-mode. Allumez les lasers 488 nm et 561 nm. Sélectionnez le miroir dichroïque 488/561 nm. Modifiez la plage spectrale du détecteur à 490-695 nm. Réglez la puissance du laser à la plage appropriée (10-50 μW). Réglez le gain du détecteur entre 750 et 900.
REMARQUE: Des paramètres de gain plus élevés ne sont pas souhaitables en raison du bruit. - Réduisez le sténopé à 1 unité aérée en cliquant sur le bouton 1 UA. Définissez la résolution des pixels sur 512 × 512 pixels.
- Activez le mode Z-stack. Démarrez Live Imaging. Sélectionnez le plan focal dans lequel les deux colorants sont visibles.
REMARQUE: Si nécessaire, ajustez la puissance du laser pour normaliser la luminosité des deux colorants fluorescents. Utilisez le mode Galerie et Le mode Monocanal pour éviter l’écrêtage et pour faire correspondre précisément l’intensité de fluorescence. - Développez le volet Z-stack qui apparaît. Utilisez la molette de mise au point et recherchez le plan le plus bas de l’échantillon. Utilisez le bouton Premier dans le volet Z-stack. Déplacez le plan focal vers le haut pour trouver la limite supérieure de l’échantillon et enregistrez la position à l’aide du bouton Dernier. Vérifiez la représentation de la profondeur de l’échantillon dans le volet Z-stack.
Remarque : Une représentation de la profondeur de l’échantillon apparaîtra dans le volet Z-stack une fois que les positions Première et Dernière positions auront été choisies. - Positionnez l’objectif à l’aide de la molette de mise au point près du bas de l’échantillon, en regardant le volet Z-stack. Il s’agit d’environ 20 μm du fond de l’échantillon.
- Désactivez le mode Z-stack et activez le mode Tile Scan. Acquérir l’image avec un nombre approprié de tuiles pour la taille de l’échantillon. 5 × 5 tuiles sont un bon point de départ.
- Ajustez le nombre de tuiles et la position XY de l’échantillon jusqu’à ce que tout le poumon rentre à l’intérieur de l’image carrelée. Revérifiez l’exactitude des positions Z-stack avec la position XY nouvellement obtenue du centre de l’échantillon.
- Activez les modes Z-stack et Tile Scan. Définissez l’étape Z (dans le volet Z-stack) sur 5 μm. Réglez la vitesse de numérisation sur 6. Activez la fonction d’enregistrement automatique. Activez l’option Enregistrement des vignettes séparées. Nommez le fichier. Appuyez sur le bouton Démarrer l’expérience.
- Vérifier que l’expérience ne dépasse pas le temps alloué au microscope; si c’est le cas , ajustez la vitesse.
REMARQUE: La taille approximative du fichier est supérieure à 10 Go; assurez-vous qu’il y a suffisamment d’espace sur le disque dur.
5. Démélange spectral et couture
- Utilisez le logiciel pour le traitement initial de l’image. Pour le démélange spectral, sélectionnez l’option Démixage. Sélectionnez deux régions correspondant à la streptavidine/voies respiratoires et aux conidies pour acquérir les spectres de l’image. Cliquez sur Démarrer le démixage.
REMARQUE: Vous pouvez également utiliser les spectres existants pour les fluorochromes de 488 et 594 nm. - Ouvrez le fichier pour le traitement de l’image et sélectionnez l’onglet Traitement. Dans la section Méthodes, sélectionnez Géométrique et couture. Dans la section Paramètre, sélectionnez La nouvelle sortie et cochez l’option Fusionner les vignettes. Utilisez le mode de référence avec le canal sélectionné correspondant à la fluorescence des voies respiratoires. Appliquez l’assemblage en cliquant sur Appliquer.
6. Traitement d’image: rendu de surface
- Ouvrez l’image en tant que vue 3D surpassée. Créez une surface des voies respiratoires à l’aide de l’option Surface pour le canal utilisé pour la visualisation des voies respiratoires. Choisissez le paramètre de lissage de 10 μm.
REMARQUE: Choisissez également la valeur de seuil automatique. - Inspectez visuellement la surface. Choisissez les seuils pour réduire le signal extérieur. Enlevez les surfaces de la plèvre et des vaisseaux.
- Créez un masque pour la surface des voies respiratoires à l’aide des options Modifier et Masquer tout. Sélectionnez le canal des voies respiratoires et réglez Voxels à l’extérieur de la surface sur 0,001.
- Enregistrez le fichier avec le masque des voies respiratoires en tant que série TIFF dans le dossier. Enregistrez le fichier avec le canal conidia en tant que série TIFF dans le dossier séparé.
7. Traitement de l’image: correction du masque
- Ouvrez le fichier avec le masque des voies respiratoires dans une plate-forme open source pour l’analyse d’imagesbiologiques 17 en tant qu’image 8 bits. Rendez l’image binaire en cliquant sur Processus | | binaire Rendre binaire.
REMARQUE: Si nécessaire, corrigez le masque: supprimez les surfaces excessives à l’aide de la sélection de polygones et de l’onglet Supprimer. Vous pouvez également utiliser l’outil de remplissage d’inondation. - Dessinez les surfaces manquantes en utilisant plusieurs fois Dilate (3D): cliquez sur Plugins | | de processus Dilater (3D). Remplissez les trous en cliquant sur Processus | | binaire Remplir les trous. Utilisez la sélection et l’interpolation du gestionnaire de retour sur investissement pour remplir manuellement les trous résiduels dans le masque. Appliquer plusieurs options Erode (3D) (Plugins | | de processus Éroder (3D)pour rééchantillonnage de l’épaisseur du masque.
REMARQUE: Créer des macros à l’aide de plugins | Options de macros pour plusieurs répétitions Dilate (3D) et Erode (3D).
Assurez-vous que le nombre d’Érodes (3D) est égal au nombre d’applications dilatées (3D). - Enregistrez le masque dans un nouveau dossier en tant que série TIFF.
8. Analyse quantitative des conidies
- Ouvrez l’application dans la plate-forme de programmation et de calcul numérique : https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
- Appuyez sur le bouton Ajouter des fichiers. Sélectionnez le dossier du masque des voies respiratoires et le dossier des conidies.
- Définissez un seuil personnalisé compris entre 0 et 1. Appuyez sur le bouton OK.
- Enregistrez la table de sortie dans le fichier .xls personnalisé.
- Analysez les données avec un logiciel d’analyse statistique.
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Representative Results
Suivant le protocole ci-dessus, l’image 3D montrant les voies respiratoires et les conidies d’A. fumigatus dans le lobe pulmonaire d’une souris a été obtenue (Figure 1A). Streptavidine (qui a été utilisé pour la visualisation des voies respiratoires) marqué bronches et bronchioles15. De plus, les gros vaisseaux, qui se distinguent facilement des voies respiratoires par leur morphologie, et la plèvre sont visualisés dans le canal des voiesrespiratoires (Figure 1A-C). La création de la surface des voies respiratoires et du masque a permis d’enlever le vaisseau et les projections de plèvre dans le canal des voies respiratoires; cependant, l’intégrité de la surface des voies respiratoires est détruite en raison du faible signal de la streptavidine dans plusieurs branches bronchiques (Figure 1B-C). Le traitement ultérieur du masque des voies respiratoires permet la réparation des fragments manquants(Figure 1D).
La distribution des conidies d’A. fumigatus dans les poumons des souris a été estimée en utilisant les lobes pulmonaires supérieurs gauche ou droit à différents moments après l’application de conidies. Pour le lobe pulmonaire supérieur droit, l’image se compose d’environ 30 tuiles et d’environ 250 piles Z. Après l’assemblage, l’image acquise avec la résolution 512 × 512 avait une taille d’image de 2360 × 2815 pixels et la taille d’un pixel est de 2,77 μm × 2,77 μm, ce qui est comparable à la taille des conidies A. fumigatus qui est de 2-3,5 μm9.
L’image agrandie de la région des voies respiratoires distales démontre que la détection de l’emplacement précis des conidies (à l’intérieur ou à l’extérieur des branches bronchiques) est assez difficile en raison de la complexité de l’image et de la petite taille des conidies par rapport à la taille des voies respiratoires (Figure 2A). Un examen précis a révélé que les conidies étaient situées à la fois à l’intérieur et à l’extérieur des branches bronchiques(Figure 2B-C).
Les paramètres de seuil du canal des conidies influencent grandement le nombre de conidies résultant(Figure 2B-C). Pour effectuer l’analyse quantitative impartiale, nous avons développé une application dans la plate-forme de programmation et de calcul numérique qui permet d’estimer le nombre de conidies à l’intérieur et à l’extérieur du masque des voies respiratoires, en évitant le réglage manuel du seuil. L’application agit en fonction de l’algorithme suivant. Tout d’abord, le canal des conidies est segmenté en une pile binaire d’images 3D en utilisant une valeur de seuil optimale. Comme décrit ci-dessus, la résolution d’imagerie choisie permet d’identifier un conidium comme un pixel. L’utilisation de la streptavidine pour le profilage des voies respiratoires permet la visualisation des bronches mais pas des alvéoles15. Par conséquent, les conidies résidant dans les bronches sont définies comme des pixels de conidies à l’intérieur du masque des voies respiratoires, tandis que les conidies résidant dans les alvéoles sont définies comme des pixels de conidies à l’extérieur du masque des voies respiratoires. Compte tenu de cela, dans l’étape suivante de l’algorithme, une opération binaire ET est effectuée pour l’image du masque des voies respiratoires et l’image des conidies afin d’extraire les pixels des conidies qui résident dans les bronches. De même, les pixels de conidies restants sont extraits pour obtenir le nombre de conidies dans les alvéoles. Le pourcentage résultant de conidies dans les bronches et les alvéoles par rapport à la quantité globale de conidies dans les poumons est présenté dans le graphique à barres et le tableau de sortie de l’interface utilisateur de l’application.
En utilisant cette approche, l’analyse quantitative de la distribution des conidies dans les voies respiratoires des souris a été effectuée pour le point temporel de 6 heures après l’application des conidies (Figure 2D). Les données suggèrent que lors de l’application oropharyngée, la majorité des conidies pénètrent dans l’espace alvéolaire et s’y trouvent au début de la réponse immunitaire inflammatoire.
Graphique 1. Le principe du traitement d’image des voies respiratoires. (A) Image 3D du lobe pulmonaire supérieur droit d’une souris, 24 heures après l’application de conidies montrant des structures riches en biotine (streptavidine, blanc) et des conidies A. fumigatus (magenta). Les grands vaisseaux positifs à la steptavidine sont indiqués par de fines flèches. (B,C) La surface (vert) et le masque (orange) pour les voies respiratoires. Les fragments de voies respiratoires manquants dans la surface et le masque sont indiqués par des flèches; les structures excessives avec des pointes de flèches. La barre d’échelle est de 1000 μm. (D) Le masque des voies respiratoires après les corrections. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Traitement d’images Conidia et analyse quantitative. (A) Image agrandie des voies respiratoires distales (Streptavidin, nuances de gris) et A. fumigatus conidia (magenta) qui sont présentées à la figure 1A. La barre d’échelle est de 300 μm B, C. L’image agrandie arbitrairement encadrée sur (A) est représentée comme une tranche Z avec un seuil élevé (B) et une valeur de seuil faible (C). Les conidies à l’intérieur des voies respiratoires sont indiquées par des flèches et à l’extérieur par des pointes de flèches. La barre d’échelle est de 150 μm. (D) Analyse quantitative des conidies dans les branches bronchiques et l’espace alvéolaire. Les données sont présentées comme la médiane et l’intervalle interquartile pour 4 souris, 6 h après avoir reçu A. fumigatus conidia. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’imagerie 3D d’organes entiers permet d’obtenir les données sans dissection de l’échantillon, ce qui est d’une grande importance pour étudier les aspects spatiaux de la distribution anatomique de l’agent pathogène dans l’organisme. Il existe plusieurs techniques et modifications du nettoyage optique tissulaire qui aident à surmonter la diffusion de la lumière laser et permettent l’imagerie d’organes entiers15,16,18,19. L’une des approches personnalisées de nettoyage des tissus consiste en une déshydratation et une délipidation des tissus à base de méthanol, suivies d’un nettoyage optique avec BABB. L’approche a été développée il y a plus de 100 ans et a été plusieurs modifications. Dans notre travail, nous utilisons la modification la plus simple qui a été décrite par Scott et al. 15 Une telle approche est optimale pour une utilisation avec des agents pathogènes marqués par fluorescence. De plus, les fluorochromes à haute photostabilité sont préférables pour une imagerie prolongée. Malheureusement, la visualisation de TdTomato A. fumigatus conidia transgénique n’est pas possible en utilisant cette méthode, en raison de la grande sensibilité de TdTomato à BABB (données non montrées). Ainsi, l’approche que nous décrivons ici permet de détecter avec succès les agents pathogènes au repos ou fixes, mais ne peut pas être utilisée pour l’imagerie des conidies ou des hyphes en croissance d’A. fumigatus. De plus, la coloration immunohistochimique de l’échantillon avec les substances liantes à haute affinité est préférable. Ainsi, nous avons également eu du mal à essayer d’appliquer les anticorps marqués par fluorescence pour visualiser les vaisseaux et les lymphatiques dans des échantillons de lobes pulmonaires à montage entier. Cependant, Scott et al. 15 fibres nerveuses visualisées en utilisant une coloration en deux étapes avec des anticorps contre PGP 9.5. Cela indique que certains anticorps peuvent être utilisés pour la coloration avec la clairière optique suivante à l’aide de BABB. Nous avons également perdu le signal fluorescent des particules de latex fluorescent de 0,1 μm après la clairière BABB, tandis que l’utilisation de la solution de nettoyage 3D améliorée (Ce3D)18 n’a pas affecté le signal fluorescent des particules.
Dans l’approche actuelle, nous utilisons la streptavidine pour étiqueter les voies respiratoires. La streptavidine se lie à la biotine endogène qui est considérée comme exprimée dans les cellules de Clara (et les cellules épithéliales alvéolaires de type II dans une moindre mesure)20. Comme les cellules clara (également appelées cellules Club) en l’absence d’inflammation résident dans les bronches et les bronchioles, mais pas dans le compartiment alvéolaire, la coloration à la streptavidine ne visualise que les branches bronchiques. Par conséquent, dans l’approche actuelle, toutes les conidies à l’extérieur des voies respiratoires étiquetées à la streptavidine ont été déterminées comme étant situées dans l’espace alvéolaire. Pour une détection plus précise de l’emplacement des conidies, d’autres marqueurs des voies respiratoires, tels que SOX9, doivent être utilisés3. Dans le cas où l’utilisation d’anticorps est nécessaire Ce3D ou l’imagerie tridimensionnelle des organes éliminés par solvant (3DISCO),19 techniques sont plus appropriées que la clairance optique à base de BAAB. Cependant, le nettoyage optique BABB est l’approche la plus simple et la plus longue, et est donc la plus avantageuse pour la détection préalable de conidies marquées par fluorescence dans les voies respiratoires marquées par streptavidine.
L’imagerie 3D des poumons de souris peut également être réalisée à l’aide de la tomographie par projection optique en microscopie intégrée3. Cependant, en raison de la limitation de la résolution de la tomographie, CLSM est plus approprié pour l’imagerie simultanée des voies respiratoires et des conidies de 3 μm. Dans notre cas, un seul conidium est considéré comme un pixel. Le traitement de telles images a permis de quantifier les conidies à l’intérieur et à l’extérieur des branches bronchiques. La méthode peut également être appliquée pour comparer la distribution des conidies anatomiques chez les souris immunocompétentes et immunodéprimées. L’approche peut également être utilisée pour estimer la cinétique de l’élimination des conidies des voies respiratoires des souris. De plus, la combinaison de l’approche de la morphométrie des voies respiratoires entières qui a été développée par Scott et al. 15 avec l’algorithme pour les conidies impartiales L’analyse quantitative peut être utile dans l’emplacement précis des conidies A. fumigatus et d’autres particules de taille comparable dans différentes générations de l’arbre bronchique.
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Disclosures
Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts dans ce travail.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le professeur Sven Krappmann (hôpital universitaire d’Erlangen et FUA Erlangen-Nürnberg, Allemagne) d’avoir fourni la souche AfS150 de conidies Aspergillus fumigatus. Les auteurs remercient le service de presse du MIPT. V.B. remercie le Ministère des sciences et de l’enseignement supérieur de la Fédération de Russie (#075-00337-20-03, projet FSMG-2020-0003). Les travaux concernant l’imagerie et la quantification des conidies d’A. fumigatus ont été soutenus par RSF n° 19-75-00082. Les travaux concernant l’imagerie des voies respiratoires ont été soutenus par le RFBR No 20-04-60311.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 - 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With ground-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
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