Summary
El artículo describe la diferenciación dirigida paso a paso de células madre pluripotentes inducidas a organoides pulmonares enteros tridimensionales que contienen células pulmonares epiteliales proximales y distales junto con mesénquima.
Abstract
El desarrollo y la enfermedad pulmonar humana han sido difíciles de estudiar debido a la falta de sistemas modelo in vitro biológicamente relevantes. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) se pueden diferenciar paso a paso en organoides pulmonares multicelulares 3D, formados por poblaciones de células epiteliales y mesenquimales. Recapitulamos las señales del desarrollo embrionario introduciendo temporalmente una variedad de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para generar eficientemente el endodermo definitivo, el endodermo del intestino anterior y, posteriormente, las células progenitoras pulmonares. Estas células se incrustan en el medio de matriz de membrana basal reducida por factor de crecimiento (GFR), lo que les permite desarrollarse espontáneamente en organoides pulmonares 3D en respuesta a factores de crecimiento externos. Estos organoides pulmonares completos (WLO) se someten a etapas tempranas del desarrollo pulmonar, incluida la morfogénesis ramificada y la maduración después de la exposición a dexametasona, AMP cíclico e isobutilxantina. Los WLO poseen células epiteliales de las vías respiratorias que expresan los marcadores KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) y MUC5AC (cáliz), así como células epiteliales alveolares que expresan HOPX (alveolar tipo I) y SP-C (alveolar tipo II). Las células mesenquimales también están presentes, incluida la actina del músculo liso (AME) y el receptor A del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα). Los WLO derivados de iPSC se pueden mantener en condiciones de cultivo 3D durante muchos meses y se pueden clasificar para marcadores de superficie para purificar una población celular específica. Los WLO derivados de iPSC también se pueden utilizar para estudiar el desarrollo pulmonar humano, incluida la señalización entre el epitelio pulmonar y el mesénquima, para modelar mutaciones genéticas en la función y el desarrollo de las células pulmonares humanas, y para determinar la citotoxicidad de los agentes infecciosos.
Introduction
El pulmón es un órgano complicado, heterogéneo y dinámico que se desarrolla en seis estadios distintos: maduración embrionaria, pseudoglandular, canalicular, saccular, alveolar y microvascular1,2. Las dos últimas fases ocurren pre y postnatalmente en el desarrollo humano, mientras que las primeras cuatro etapas ocurren exclusivamente durante el desarrollo fetal, a menos que ocurra el parto prematuro3. La fase embrionaria comienza en la capa germinal endodérmica y concluye con la brotación de la tráquea y las yemas pulmonares. El desarrollo pulmonar ocurre en parte a través de la señalización entre las células epiteliales y mesenquimales4. Estas interacciones dan como resultado la ramificación pulmonar, la proliferación, la determinación del destino celular y la diferenciación celular del pulmón en desarrollo. El pulmón se divide en zonas conductoras (tráquea a los bronquiolos terminales) y zonas respiratorias (bronquiolos respiratorios a los alvéolos). Cada zona contiene tipos únicos de células epiteliales; incluyendo células basales, secretoras, ciliadas, de cepillo, neuroendocrinas e ionocitos en la vía aérea conductora5, seguidas de células alveolares tipo I y II en el epitelio respiratorio6. Todavía se desconoce mucho sobre el desarrollo y la respuesta a la lesión de los diversos tipos de células. Los modelos organoides pulmonares derivados de iPSC permiten el estudio de los mecanismos que impulsan el desarrollo pulmonar humano, los efectos de las mutaciones genéticas en la función pulmonar y la respuesta tanto del epitelio como del mesénquima a los agentes infecciosos sin la necesidad de tejido pulmonar humano primario.
Los marcadores correspondientes a las diversas etapas de la diferenciación embrionaria incluyen CXCR4, cKit, FOXA2 y SOX17 para el endodermo definitivo (DE)7, FOXA2, TBX1 y SOX2 para el endodermo del intestino anterior (AFE)8, y NKX2-1 para las células progenitoras pulmonares tempranas9. En el desarrollo pulmonar embrionario, el intestino anterior se divide en el esófago dorsal y la tráquea ventral. Las yemas de los pulmones derecho e izquierdo aparecen como dos bolsas externas independientes alrededor de la yema traqueal10. Durante la morfogénesis ramificada, el mesénquima que rodea el epitelio produce tejido elástico, músculo liso, cartílago y vasculatura11. La interacción entre el epitelio y el mesénquima es esencial para el desarrollo pulmonar normal. Esto incluye la secreción de FGF1012 por el mesénquima y SHH13 producida por el epitelio.
Aquí, describimos un protocolo para la diferenciación dirigida de hiPSCs en organoides pulmonares enteros tridimensionales (3D) (WLO). Si bien existen enfoques similares que incorporan el aislamiento de células progenitoras pulmonares a través de la clasificación en la etapa LPC para hacer organoides similares a los alveolares14,15 (distales) u organoides de las vías respiratorias16 (proximales), o generar esferoides del intestino anterior ventral-anterior para hacer organoides pulmonares humanos que expresan marcadores de células alveolares y mesenquimales y organoides progenitores de punta de yema17 , la fuerza de este método es la inclusión de los tipos de células epiteliales y mesenquimales pulmonares para modelar y orquestar la morfogénesis, maduración y expansión de la ramificación pulmonar in vitro.
Este protocolo utiliza moléculas pequeñas y factores de crecimiento para dirigir la diferenciación de las células madre pluripotentes a través del endodermo definitivo, el endodermo del intestino anterior y las células progenitoras pulmonares. Estas células se inducen a organoides pulmonares enteros en 3D a través de importantes pasos de desarrollo, incluida la ramificación y la maduración. El resumen del protocolo de diferenciación se muestra en la Figura 1a con imágenes representativas de campo brillante de diferenciación endodérmica y organoide que se muestran en la Figura 1b. La Figura 1c,d muestra los detalles de la expresión génica de la diferenciación endodérmica, así como la expresión génica de las poblaciones proximal y distal de las células epiteliales pulmonares después de completar la diferenciación.
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Protocol
Este protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Programa de Protecciones de Investigación Humana de UCSD (181180).
1. Inducción definitiva del endodermo a partir de células madre pluripotentes inducidas (Día 1 - 3)
- Descongele lentamente el medio de matriz de membrana basal reducida (GFR) sobre hielo 30 minutos antes de su uso. En dmEM/F12 frío, mezclar, diluir el medio de matriz BM GFR 1:1 de tal manera que constituya el 50% de este medio. Coloque las puntas de pipeta P1000 en el congelador para enfriarlas antes de usarlas.
- Cubra cada pocillo de una placa de 12 pocillos con 500 μL de medio de matriz de membrana basal GFR al 50% preparado en DMEM/F12 helado. Una vez que se haya recubierto el número deseado de pocillos, retire cualquier exceso de mezcla media y / o burbujas de los pozos y coloque la placa sobre hielo o refrigerador a 4 ° C durante 20 minutos para que cuaje. Luego, mueva la placa a la incubadora a 37 ° C durante la noche para gelificar y secar.
- Una vez que las hiPSC alcancen el 70-90% de confluencia, agregue 10 μM de inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632 una hora antes de la disociación. Aspire el medio y lave una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Disociar las hiPSCs añadiendo medio de desprendimiento celular (0,5 mL/pocillo de una placa de 12 pocillos) e incubar durante 20 min a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5%.
- Retire las placas de la incubadora y agregue 0,5 ml/12 pocillos de medio de paso de células madre (Tabla 1) a los pocillos; triturar suavemente las células usando una punta P1000 para obtener la suspensión de una sola célula. Transferir células disociadas a un tubo centrífugo cónico de 15 ml; centrífuga durante 5 min a 300 x g.
- Aspire el medio y resuspenda el pellet celular con 1 ml de medio mTeSR Plus suplementado con un inhibidor de ROCK de 10 μM (Y-27632). Realice un recuento de celdas. Agregue 2.0 x 105 hiPSCs en 1 ml de mTeSR suplementado con el inhibidor de ROCK Y-27632 por pocillo de una placa recubierta de media membrana basal GFR de 12 pocillos. Incubar a 37 °C durante la noche.
NOTA: El número de siembra de celdas debe optimizarse por línea celular. 24 h después del revestimiento, los pocillos deben ser 50% -70% confluentes. - El día 1, aspire el mTeSR Plus y agregue medios de inducción de Endoderm Definitivo (DE) (Tabla 1) suplementados con 100 ng/ml de activina A humana y 5 μM de inhibidor de GSK3β/activador Wnt CHIR99021.
NOTA: Los medios DE con inhibidor de GSK3β/activador de Wnt CHIR99021 deben retirarse dentro de las 20-24 h de la inducción del día 1 DE para una diferenciación exitosa. - El día 2 y el día 3, cambie a medios de inducción DE suplementados con 100 ng / ml de activina A solamente.
NOTA: La diferenciación de DE no debe exceder un total de 72 h, o la eficacia disminuirá. En el día 4, si se observa una muerte de células grandes, disminuya el tiempo total de exposición a los medios de DE en 6-12 h. - Para analizar la eficiencia de DE, confirme una expresión superior al 90% de CXCR4 y/o cKit mediante citometría de flujo o análisis de inmunofluorescencia de FOXA2 y/o SOX17 (Figura 2a).
2. Inducción del endodermo del intestino anterior (AFE) (Día 4 - 6)
- El día 4, cambie el medio a medio basal libre sérico (SFBM) (Tabla 1) suplementado con 10 μM SB431542 y 2 μM de dorsomorfina para la inducción de AFE. Cambie los medios de AFE diariamente durante 3 días (día 4, día 5 y día 6).
- Para analizar la eficiencia de AFE, confirme la expresión robusta de SOX2, TBX1 y FOXA2 a través de la tinción por inmunofluorescencia (Figura 2b).
3. Diferenciación de células progenitoras pulmonares (LPC) (Día 7 - 16)
- El día 7, descongele el medio de matriz de membrana basal GFR en hielo. Aspire fuera del medio AFE y lave bien con 1x PBS. Añadir 1 ml de solución de desprendimiento celular e incubar durante 10 min a 37 °C.
- Añadir 1 ml de medio de enfriamiento (2% FBS en DMEM/F12) a los pocillos que contienen solución de desprendimiento celular. Mantenga las celdas como agregados mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo suavemente. Asegúrese de que todas las células se desalojen y se transfieran a un tubo de centrífuga cónica de 15 ml. Centrífuga durante 5 min a 300 x g.
- Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en medio de enfriamiento suplementado con 10 ng/mL de proteína morfogénica ósea recombinante humana-4 (BMP4), 0,1 μM de ácido retinoico trans (AR), 3 μM de inhibidor de GSK3β/activador de Wnt CHIR99021 y 10 μM de inhibidor de roca Y-27632.
- Realice un recuento de celdas. Agregue 2.5 x 105 células a 100 μL de medio de matriz de membrana basal GFR fría, mezcle bien y coloque gotas en un pozo de una placa de 12 pocillos. Incubar la placa a 37 °C durante 30-60 min para permitir que el medio polimerice. Agregue 1 ml de medio LPC suplementado con 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632 por pozo, asegurando que la gota media esté completamente sumergida e incube a 37 ° C durante la noche.
- El día 8, 24 h después de la inducción de LPC, cambie el medio lpC para eliminar el inhibidor de ROCK Y-27632. Cambie el medio LPC cada dos días durante un total de 9-11 días.
NOTA: Si el medio se vuelve amarillo dentro de las 24 h, cambie de medio todos los días. - Para analizar la eficiencia de LPC, confirmar la expresión robusta del factor de transcripción intracelular NKX2-1 o realizar citometría de flujo para marcadores de superficie CD47hi/CD26low15 o CPM18 (Figura 2c). Grossly, los esferoides LPC deben ser redondos y transparentes (Figura 2c).
NOTA: No proceda con la diferenciación organoide pulmonar si la eficiencia de NKX2-1 es inferior al 30%.
4.3D inducción organoide pulmonar (Día 16 - 22)
- El día 17, descongele el medio de matriz de membrana basal GFR en hielo. Aspirar el medio de inducción LPC. Luego agregue 2 μg / ml de dispasa (1 ml) al pozo y vuelva a suspender la mezcla de medio / dispasa con una pipeta P1000. Incubar a 37 °C durante 15 min. Triturar la mezcla de nuevo e incubar a 37 °C durante otros 15 min.
- Transfiera la dispasa y las células a un tubo centrífugo cónico de 15 ml. Use PBS refrigerado (2-3 ml) para lavar el pozo y volver a suspender la mezcla de dispasa/célula. Centrífuga durante 5 min a 400 x g. Retire manualmente el sobrenadante, teniendo cuidado de no distusar la capa de gránulos del medio/célula. Repita el lavado de PBS refrigerado y centrífique el tubo de centrífuga cónica durante otros 5 minutos a 400 x g.
- Retire manualmente el sobrenadante y luego agregue 2 ml de solución de disociación a base de tripsina al tubo de centrífuga cónica. Incubar a 37 °C durante 12 min.
- Después de la incubación, resuspenda las células con una punta de pipeta P1000. A continuación, agregue un volumen igual de medios de enfriamiento al tubo cónico de la centrífuga y gire hacia abajo a 400 x g durante 5 minutos. Aspirar las células sobrenadantes y resuspendidas en medio de enfriamiento + 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632.
NOTA: La inducción organoide pulmonar exitosa ocurre cuando las células se incrustan como agregados, no como células individuales, ajuste el pipeteo en consecuencia. - Realice un recuento de celdas. Calcule el volumen necesario para obtener 5.0-8.0 x 104 células por pozo. Alícuota la célula LPC se agrega en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y centrífuga durante 5 minutos a 400 x g. Retire el exceso de sobrenadante, teniendo cuidado de no agitar la bolita celular. Deje solo 10 μL de medios residuales.
- Vuelva a suspender el pellet celular en 200 μL de medio de matriz de membrana basal GFR fría y agréguelo a los insertos de membrana de cultivo celular (6,5 mm de diámetro, poro de 0,4 μm, membrana de poliéster). Incubar la placa a 37 °C durante 30-60 min para permitir que el medio de matriz de membrana basal GFR se polimerice.
- Añadir 1 ml de medio de inducción organoide 3D (Tabla 1) suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos-7 (FGF7) (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inhibidor de GSK3β/activador de Wnt CHIR (3 μM), factor de crecimiento epidérmico (EGF) (10 ng/mL) y 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632 a la cámara basolateral del inserto de membrana. Cambie el medio cada dos días durante 6 días.
5.3D Ramificación organoidea pulmonar (Día 23 - 28)
- El día 23 cambio a medio de ramificación 3D (Tabla 1) suplementado con FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inhibidor de GSK3β/activador de Wnt CHIR99021 (3 μM), AR (0,1 μM), EGF (10 ng/mL) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) / factor de crecimiento placentario (PlGF) (10 ng/mL). Cambie el medio cada dos días durante 6 días.
NOTA: En el día 6 de la diferenciación de ramificación 3D, debe haber múltiples organoides ramificados (Figura 2).
6.3D maduración organoide pulmonar (Día 29 - 34)
- En el día 29, cambie a medio de maduración 3D (Tabla 1), que es el mismo que el medio de ramificación 3D pero con la adición de dexametasona (50 nM), cAMP (100 μM) y 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), un inhibidor de la fosfodiesterasa también denominado isobutilxantina (100 μM). Cambie el medio cada dos días durante 6 días.
NOTA: Dentro de las 24 h posteriores a la maduración 3D, los organoides ramificados deben expandirse y transformarse en esferas transparentes.
7.3D Inmunocitoquímica organoide pulmonar
- Para el análisis organoide 3D de todo el pulmón, fije el medio de matriz de membrana basal GFR en los insertos de membrana con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 1 h a 4 °C. Incruste en cera de parafina y monte en diapositivas según los protocolos estándar publicados.
- Realizar la recuperación de antígenos antes de la tinción. Los marcadores de las vías respiratorias incluyen KRT5, MUC5AC y SCGB3A2. Los marcadores alveolares incluyen SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 y HOPX (Figura 3).
8. Extracción de organoides pulmonares enteros del medio de matriz de membrana basal TFG para paso, FACS o criopreservación
- Para disociar los organoides del medio de matriz de membrana basal TFG, retire los medios de la cámara basal y agregue 2 μg / ml de dispasa (1 ml) en la cámara apical.
- Triture suavemente la mezcla de medio / dispase con una pipeta P1000 y colóquela en la incubadora durante 15 min. Tritura suavemente la mezcla de nuevo e incuba durante otros 15 minutos.
- Añadir 1 ml de PBS refrigerado (4 °C) y transferir organoides con el medio de matriz a un tubo centrífugo cónico de 15 ml. Girar a 400 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante con cuidado, para no molestar la bolita celular.
- Lavar una vez más con 1 ml de PBS refrigerado y girar a 400 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante con cuidado, para no perturbar la mezcla de medio/célula.
- Agregue 1 ml de solución de desprendimiento celular al tubo de centrífuga cónica, triture suavemente resuspend el medio de matriz de membrana basal GFR/mezcla celular. Colocar en la incubadora durante 12 min para las células de paso como agregados o para la criopreservación), o 20 min para la suspensión de una sola célula.
- Agregue el mismo volumen de medios de enfriamiento y gire hacia abajo a 400 x g durante 5 minutos. Resuspend en medio de enfriamiento + 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632.
NOTA: En este paso, no se debe ver ningún medio residual de membrana basal en el tubo. Si queda medio residual, repita los pasos 8.5 y 8.6. - Realice un recuento de celdas. Calcule el volumen necesario para las aplicaciones posteriores.
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Representative Results
24 horas después del emplatado, día 1, las iPSC deben ser 50% -90% confluentes. En el día 2, el DE debe ser 90%-95% confluente. Durante la inducción de DE, es común observar una muerte celular significativa en el día 4, pero las células unidas conservarán una morfología de adoquines compacta (Figura 2b). Suspenda la diferenciación si la mayoría de las células adherentes se desprenden y considera acortar la exposición a los medios DE con activina A en 6-12 h. Durante la inducción de AFE, la muerte celular es mínima y las células permanecen adherentes, pero parecerán más pequeñas y heterogéneas. El paso de las células en el día 7 solo debe hacerse si el rendimiento de SOX2 y FOXA2 doblemente positivos es >80%. Después de pasar a la matriz de membrana basal para la inducción 3D de LPC, primero aparecerán pequeños esferoides, luego crecerán y algunos pueden comenzar a ramificarse. Los perfiles de expresión génica para una diferenciación endodérmica exitosa incluyen un aumento de SOX17 en DE, un aumento de FOXA2 y SOX2 con una disminución de SOX17 y la primera aparición de NKX2-1, y un aumento de NKX2-1, junto con la presencia de SOX2 y FOXA2. Consistente con el desarrollo embrionario temprano, la ventralización de AFE ocurre para el desarrollo de brotes pulmonares (NKX2-1+) y la dorsalización de AFE ocurre para el desarrollo gastrointestinal (SOX2+). Los cultivos en LPC tendrán una mezcla de progenitores pulmonares y gástricos.
La inducción organoide pulmonar a partir de LPC se ha realizado utilizando varios métodos. Algunos grupos clasifican las células utilizando reporteros fluorescentes NKX2-1 o un proxy de antígeno de superficie (CPM, CD26lowCD47high). Pero esos organoides pulmonares contienen células alveolares tipo II sin células alveolares tipo I o mesénquima. Otros grupos han recolectado grupos celulares que brotan de la monocapa AFE / LPC y los han incrustado en la matriz de la membrana basal. Estos organoides contienen una población mixta de células epiteliales y mesenquimales pulmonares, pero tardan meses en cultivarse19. Nuestro protocolo incluye tanto la presencia de células epiteliales como mesenquimales. Los WLO expresan marcadores de células epiteliales proximales p63 y KRT5 (células basales) y SCGB3A2 (células club), así como marcadores de células epiteliales distales HOPX (ATI) y proSPC, SPB y NKX2-1 (ATII). También expresan el marcador mesenquimal Vimentina en la etapa LPC, así como en los organoides pulmonares completos. PDGFRα es un marcador de fibroblastos que tienen una función importante en el pulmón durante la sacculación y la alveolarización20 y se coexpresa con el factor de transcripción importante en la diferenciación celular distal, SOX9 (Figura 3).
Nuestro método genera eficientemente cultivos LPC 3D que expresan NKX2-1 utilizando moléculas de señalización que se producen en el desarrollo pulmonar fetal para formar organoides pulmonares tempranos. Al pasar lpCs a medio de matriz de membrana basal GFR para la inducción organoide pulmonar, es imperativo no disociarse en exceso en una suspensión de una sola célula, sino retener pequeños grupos de células (10 células / grupo). El conteo celular no será completamente preciso, pero aún así será necesario para evitar la confluencia excesiva durante la diferenciación organoide pulmonar de 3 semanas.
La inducción organoide pulmonar debe producir organoides pequeños y ramificados para el día 6 de la inducción (día 23 de diferenciación). Estos deben continuar creciendo durante el paso de ramificación organoide y el paso de maduración. Veinticuatro horas después de la introducción de dexametasona, cAMP e IBMX, las ramas deben expandirse en esferas transparentes. El análisis organoide de todo pulmón se puede realizar al final de la diferenciación, o los WLO se pueden pasar a la matriz de membrana basal fresca con TFG o criopreservados mediante congelación en DMSO al 10%.
Figura 1: Esquema general de la diferenciación de organoides pulmonares enteros (WLO) a partir de hiPSCs y datos representativos. (a) Esquema de diferenciación de WLO de hiPSCs. Los círculos representan el tipo de célula endodérmica con marcadores de identificación. La línea de tiempo de diferenciación se indica en barras negras. Factores de crecimiento y/o moléculas pequeñas para la inducción de poblaciones organoides endodérmicas y pulmonares. En resumen, las células madre se diferencian en endodermo definitivo, endodermo del intestino anterior y en células progenitoras pulmonares en aproximadamente 16 días. Estas células pasan al medio de matriz de membrana basal GFR que contiene insertos de medio y se someten a inducción, ramificación y maduración de organoides pulmonares. La diferenciación total dura aproximadamente 35 días. b) Imágenes representativas de contraste de fase de las células en las principales etapas endodérmicas e imágenes 3D de organoides pulmonares completos. Tamaño de la barra de escala como se indica en el panel. c) análisis qRT-PCR de marcadores de desarrollo pulmonar durante el endodermo y d) diferenciación organoide pulmonar completa de marcadores de células proximales y distales. Todos los datos representan un promedio de 3-5 réplicas biológicas. Las barras de error representan el error estándar de la media y se normalizan a la actina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización de la diferenciación del endodermo por citometría de flujo e inmunocitoquímica. (a) Citometría de flujo del marcador endodermo definitivo CXCR4. El panel izquierdo muestra el cierre contra la población no manchada, mientras que el panel central muestra la población positiva CXCR4. El panel derecho muestra la imagen inmunocitoquímica de SOX17 (rojo) superpuesta con núcleos (azul). b) Imagen inmunocitoquímica de los marcadores AFE FOXA2 y SOX2 superpuestos con núcleos (azul). (c) Expresión endógena de NKX2-1-GFP en una línea celular reportera en LPC 3D. Imágenes tomadas de cultivos de células vivas en campo brillante y GFP. Citometría de flujo del progenitor pulmonar del marcador intracelular NKX2-1 después de la fijación y permeabilización. Tamaño de la barra de escala = 50 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Caracterización de organoides pulmonares enteros 3D después de 3 semanas de diferenciación por inmunocitoquímica. (a) Marcadores pulmonares proximales. El panel izquierdo muestra SOX2 (blanco) y SOX9 (rojo) superpuestos por núcleos (azul). Estos marcadores son importantes en la morfogénesis ramificada y representan las poblaciones epiteliales proximales y distales. Los paneles centrales muestran P63 (rojo) y KRT5 (rojo), ambos marcadores de células basales. El panel derecho muestra SCGB3A2, un marcador de células club. b) Marcadores pulmonares distales. El panel izquierdo representa pro-SPC (PSPC), (verde) y HOPX (rojo), marcadores de células alveolares tipo II ad I, respectivamente, superpuestas con núcleos (azul). El panel central muestra pro-SPC (PSPC) (verde) y SPB (rojo), marcadores de células alveolares tipo II, superpuestas con núcleos (azul). El panel derecho muestra NKX2-1 (rojo) y ZO1 (verde) superpuestos con núcleos (azul). c) Marcadores de mesénquima pulmonar. El panel izquierdo muestra PDGFRA (rojo) y SOX9 (blanco), que representan el mesénquima distal. El panel derecho muestra Vimentina (rojo), que se dispersa por todo el pulmón. Tamaño de la barra de escala = 50 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| REACTIVOS Y SOLUCIONES - Para conocer los nombres de las empresas, consulte la Tabla de la Lista de Materiales |
| Medio de inducción organoide 3D (día 17-22) |
| Medio basal sin suero (ver receta) suplementado con: |
| FGF7 (10 ng/ml) |
| FGF10 (10 ng/ml) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| FEAG (10 ng/ml) |
| Medio de ramificación organoide 3D (día 23-28) |
| Medio basal sin suero (ver receta) suplementado con: |
| FGF7 (10 ng/ml) |
| FGF10 (10 ng/ml) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Ácido retinoico all-trans (0,1 μM) |
| FEAG (10 ng/ml) |
| VEGF/PIGF (10 ng/ml) |
| Medio de maduración organoide 3D (día 29-34) |
| Medio basal sin suero (ver receta) suplementado con: |
| Dexametasona (50 nM) |
| Br-cAMP (100 μM) |
| IBMX (100 μM) |
| Medio de inducción AFE (día 4-6) |
| Medio basal sin suero (ver receta) suplementado con: |
| SB431542 (10 μM) |
| Dorsomorfina (2 μM) |
| Medio de inducción DE (día 1-3) |
| 48,5 ml RPMI1640 + Glutamax |
| 1 mL B27 sin ácido retinoico |
| 500 μl HEPES (1%) |
| Pluma/estreptococo de 500 μl |
| Activina A humana (100 ng/mL) |
| CHIR99021 (5 μM) - sólo en las primeras 24 horas |
| Medio de inducción LPC (día 7-16) |
| Medio basal sin suero (ver receta) suplementado con: |
| BMP4 (10 ng/ml) |
| Ácido retinoico (AR) totalmente trans (0,1 μM) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Medio de enfriamiento |
| 49 ml DMEM/F12 |
| 1 ml FBS |
| Medio basal sin suero (SFBM) |
| 375 mL De Medio Dulbecco Modificado (IMDM) de Iscove + Glutamax |
| 125 mL Ham's F12 |
| 5 mL B27 sin ácido retinoico |
| 2,5 ml N2 |
| 500 μl de ácido ascórbico, 50 mg/ml |
| 13 μl de monotioglicerol/1ml de IMDM" use 300ul de 0.4mM de monotioglicerol por 100ml de medios libres séricos |
| 3,75 ml de albúmina sérica bovina (BSA) Fracción V, solución al 7,5% |
| Pluma/estreptococo de 500 μl |
| Medio de paso de células madre (día 0) |
| 500 ml DMEM/F12 |
| Reemplazo de suero Knockout de 129 ml (KSR) |
| 6,5 ml de glutáx |
| 6.5 ml NEAA |
| 1.3 mL 2-mercaptoetanol |
| Pluma/estreptococo de 6,5 ml |
Tabla 1: Tabla de medios.
| Problema | Solución |
| La diferenciación DE no es eficiente | 24 horas después del recubrimiento en medio de células madre, las células deben ser 50-70% confluentes |
| El inhibidor de GSK3β/activador Wnt CHIR99021 debe retirarse dentro de las 20-24 horas del día 1 INDUCCIÓN DE | |
| La diferenciación de DE no debe exceder un total de 72 horas | |
| La diferenciación AFE no es eficiente | Asegurar que la diferenciación de DE fue exitosa y que las células expresan > 80% CXCR4 |
| Asegúrese de que los factores de crecimiento frescos / moléculas pequeñas se agregan a los medios diariamente | |
| La diferenciación lpC no es eficiente | Asegurar que la diferenciación AFE fue exitosa y que las células expresan > 80% FOXA2/SOX2 |
| Asegúrese de que las células AFE se pasen como agregados de 4-10 células y no como células individuales | |
| Organoides pulmonares 3D que no crecen ni se diferencian | Asegúrese de que la diferenciación de LPC fue exitosa y las células expresan > 30% NKX2-1 |
| Asegúrese de que los LPC se pasen como agregados de 4-10 celdas y no como células individuales | |
| Asegúrese de que no haya matrigel residual de los LPC durante el pasaje | |
| Agregue el inhibidor de ROCK Y-27632 con cada cambio de medio | |
| Asegúrese de que el medio se cambie a tiempo y se agreguen factores de crecimiento frescos / moléculas pequeñas | |
| Asegurar que la concentración de factores de crecimiento/moléculas pequeñas es correcta |
Tabla 2: Solución de problemas.
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Discussion
La diferenciación exitosa de organoides pulmonares enteros (WLO) en 3D se basa en un protocolo de 6 semanas de varios pasos con atención al detalle, incluido el tiempo de exposición a factores de crecimiento y moléculas pequeñas, densidad celular después del pasaje y la calidad de las hiPSC. Para solucionar problemas, consulte la Tabla 2. Las hiPSC deben ser aproximadamente 70%-80% confluentes, con menos del 5% de diferenciación espontánea antes de la disociación. Este protocolo requiere el medio "mTeSR plus"; sin embargo, el medio simple "mTeSR" también se ha utilizado con resultados comparables y es menos costoso. Para la matriz extracelular, utilizamos el medio de matriz de membrana basal GFR. Pasamos los hiPSCs usando ReLesR (ver Tabla de Materiales) para reducir la diferenciación.
Durante la diferenciación del endodermo, las células deben visualizarse diariamente antes y después de los cambios en los medios. Los factores de crecimiento especificados / moléculas pequeñas deben agregarse diariamente frescos al medio base para evitar la degradación prematura. La muerte celular en el endodermo definitivo (DE) es común, pero debe limitarse durante la inducción del endodermo del intestino anterior (AFE) y la célula progenitora pulmonar (LPC). Si hay una gran muerte en el tercer día de DE (día 4), disminuya el tiempo total de DE en 6-12 h. Es posible que sea necesario optimizar las nuevas líneas celulares de iPSC para una diferenciación exitosa del endodermo. Realice citometría de flujo en DE para CXCR4 para confirmar la inducción exitosa (>85% de células CXCR4 +). Las células deben ser relativamente estables en AFE y cambiarán morfológicamente con poca muerte.
El paso a LPC es otro proceso que debe optimizarse para el tipo de célula. Replantear las células a una densidad demasiado baja (<50%) dará como resultado una diferenciación ineficiente. Confirmar la inducción exitosa de LPC con inmunocitoquímica para NKX2-1 o citometría de flujo para CPM18 o CD26low/CD47high15. La inducción exitosa de LPC debe tener >40% NKX2-1, de lo contrario los organoides tendrán mayor abundancia de AFE dorsal. Para la inducción de LPC, los factores de crecimiento deben agregarse a los medios base con cada cambio de medio. Si el medio se vuelve amarillo más tarde en la inducción de LPC, considere aumentar el volumen de medios frescos o cambie los medios todos los días. Durante la inducción organoide de todo pulmón en 3D, el número de recubrimientos y el mantenimiento de los grupos celulares son clave para el crecimiento exitoso de organoides. El medio de matriz de membrana basal GFR es difícil de manejar y altamente sensible a la temperatura, por lo que siempre manténgalo en hielo. Si el medio de matriz de membrana basal GFR se gelifica demasiado pronto, entonces las células LPC no se integrarán dentro de él. Recomendamos descongelar 1 ml de alícuotas de medio de matriz de membrana basal GFR en hielo 30 minutos antes del paso. Una vez que se hayan contado las células / grupos y se hayan hecho las alícuotas apropiadas, coloque la bolita celular sobre hielo. Sugerimos preparar placas, etiquetar y agregar insertos de membrana de cultivo celular antes del manejo del medio de matriz de membrana basal GFR.
Use puntas de pipeta para agregar el volumen correcto de medio líquido de matriz de membrana basal GFR inmediatamente a la bolita celular, manteniéndose en hielo. Pipete hacia arriba y hacia abajo rápida pero suavemente (manejo matizado) para no introducir burbujas, luego coloque el tubo nuevamente sobre hielo. Agregue la mezcla de medio de matriz celular y de membrana basal GFR a la porción apical del transwell en placas preparadas. La mezcla debe extenderse y cubrir todo el transpocillo; Incline suavemente la placa para asegurar el recubrimiento. Después de gelificar en la incubadora durante 30-60 min, debe haber grupos de células visibles en el medio de matriz de membrana basal GFR. Agregue los medios de inducción pulmonar apropiados a la cámara basal suplementada con el inhibidor de ROCK de 10 μM Y-27632 y monitoree el crecimiento de organoides cada dos días.
Las aplicaciones futuras de los organoides generados por este protocolo incluyen el estudio de las vías moleculares que controlan el compromiso temprano del linaje pulmonar y la especificación del destino celular21,22,23. La interacción entre el epitelio y el mesénquima se puede determinar mediante la utilización de modelos de eliminación de genes24. Los organoides también podrían ser co-cultivados con células endoteliales para determinar la importancia de la señalización de co-patrón específico del tejido entre el epitelio pulmonar, el mesénquima y el endotelio25. El desarrollo pulmonar ocurre en paralelo con el desarrollo vascular y esa relación puede provocar importantes mecanismos moleculares necesarios para el desarrollo pulmonar adecuado. También hemos demostrado que estos organoides pulmonares completos son funcionales a través de ensayos de secreción de surfactante después de que se eliminó el medio de matriz de membrana basal GFR seguido de cultivo a corto plazo en pozos de unión ultrabaja26. Otras estrategias incluyen clasificar las células para marcadores de superficie celular como NGFR (células basales)27 y HTII-280 (células ATII)28 y reemplazarlas como organoides homogéneos o una monocapa en condiciones de cultivo de interfase de líquido de aire. Los organoides pulmonares enteros, proximales y distales también se han utilizado para estudiar los objetivos celulares y la fisiopatología de la infección viral por SARS-CoV-2 con el fin de comprender mejor y detectar medicamentos que podrían combatir covid-19.
Este protocolo es robusto y reproducible, pero aún existen muchos desafíos. Se han probado muchas líneas iPSC y ESC diferentes (>20 líneas), pero el protocolo debe optimizarse para cada línea celular. A pesar de la robusta inducción de DE y AFE, la inducción de LPC puede ser difícil de lograr >40% de las células NKX2-1 +. Otros protocolos incluyen un paso de clasificación para marcadores de superficie de células NKX2-115,18, pero estos solo producen alveolar tipo II como organoides sin mesénquima y aún contienen poblaciones de células gástricas y hepáticas a pesar de purificar la población progenitora pulmonar29. También hemos observado una pequeña cantidad de células gástricas y hepáticas tanto en el LPC como en los organoides pulmonares enteros, posiblemente debido a la presencia de células del intestino anterior dorsal que contaminan las LPC. Por lo tanto, la diferenciación de los organoides pulmonares puros aún no se ha logrado, y se debe completar más investigación sobre el desarrollo de las células progenitoras pulmonares en el tejido humano. Los ensayos posteriores deben compararse vigorosamente con la expresión de genes y proteínas del tejido pulmonar humano primario. Si bien, hasta la fecha, el uso más fructífero de los organoides pulmonares ha sido en el modelado de enfermedades y la detección de medicamentos in vitro, el trasplante de organoides pulmonares derivados de hiPSC en pacientes para medicina regenerativa se ha contemplado como una terapia futura para una variedad de afecciones. Sin embargo, antes de considerar tales intervenciones, se debe perfeccionar una buena cantidad de control de calidad, incluida la identificación y eliminación de derivados de hiPSC contaminantes, indeseables y potencialmente tumorígenos. Además, aún es necesario desarrollar mejores ensayos funcionales in vitro y mejores modelos animales de enfermedad pulmonar.
Específicamente, se debe confirmar la funcionalidad y seguridad de las células derivadas de hiPSC. Las células indiferenciadas deben ser excluidas ya que tienen la capacidad de generar teratomas. Un método para determinar las células madre indiferenciadas en el endodermo definitivo es clasificar las células utilizando el marcador de pluripotencia SSEA4. Recientemente se detectaron genes marcadores para hiPSC indiferenciadas mediante secuenciación de ARN unicelular30. ESRG, CNMD y SFRP2 se pueden utilizar para validar células indiferenciadas en cualquier paso de diferenciación. Una vez que se confirma la pureza, el beneficio de las terapias autólogas derivadas de iPSC es la capacidad de las células trasplantadas para evitar el rechazo, ya que provienen de las propias células del paciente. Los inconvenientes incluyen el tiempo que lleva diferenciar completamente las células, someterse a rigurosas pruebas de grado clínico y trasplantar las células a un paciente con una lesión aguda (síndrome de dificultad respiratoria, infarto de miocardio o lesión espinal). La alternativa es utilizar células derivadas de iPSC alogénicas almacenadas31. Estos pueden almacenarse y estar fácilmente disponibles para pacientes con donantes compatibles con antígeno leucocitario humano (HLA) y se habrán sometido a pruebas exhaustivas de contaminación. El mayor inconveniente es la posibilidad de rechazo inmune. La inmunosupresión puede ser necesaria en el trasplante de células alogénicas, que es la realidad actual de los trasplantes alogénicos de tejido entero. Se están diseñando estrategias para permitir que las células alogénicas derivadas de iPSC evadan la respuesta inmune para trasplantarlas de forma segura a los pacientes32.
Eventualmente, los organoides pulmonares completos derivados de iPSC se utilizarán para estudiar modelos de enfermedades específicas del paciente, adaptar la terapéutica y mejorar la investigación médica regenerativa.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A.
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X.
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C.
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
