Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

خطوط أنابيب البلورات الآلية في مرفق EMBL HTX في غرونوبل

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62491
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 1, 1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2
1European Molecular Biology Laboratory, 2ALPX S.A.S., 3Institut de Biologie Structurale

Summary

هنا، ونحن نصف كيفية استخدام خطوط أنابيب البلورات الجزيئية الكلية الآلي للبروتين إلى هيكل، وتحليل مجمع البروتين ليغاندي السريع وفحص جزء على نطاق واسع على أساس التكنولوجيا CrystalDirect في مختبر HTX في EMBL غرونوبل.

Abstract

تدير EMBL Grenoble مختبر تبلور الإنتاجية العالية (مختبر HTX) ، وهو مرفق مستخدم واسع النطاق يقدم خدمات عالية الإنتاجية للبلورات للمستخدمين في جميع أنحاء العالم. مختبر HTX لديه تركيز قوي في تطوير أساليب جديدة في علم البلورات الجزيئية الكلية. من خلال الجمع بين منصة تبلور عالية الإنتاجية ، وتكنولوجيا CrystalDirect لتركيب الكريستال الآلي بالكامل والتبريد وبرنامج CRIMS قمنا بتطوير خطوط أنابيب مؤتمتة بالكامل للبلورات الجزيئية الكبيرة التي يمكن تشغيلها عن بعد عبر الإنترنت. وتشمل هذه الخطوط خط أنابيب من البروتين إلى الهيكل لتحديد الهياكل الجديدة، خط أنابيب لتوصيف سريع لمجمعات البروتين ليغند لدعم الكيمياء الطبية، وعلى نطاق واسع، أنبوب فحص جزء الآلي تمكين تقييم المكتبات من أكثر من 1000 شظايا. هنا نحن وصف كيفية الوصول إلى واستخدام هذه الموارد.

Introduction

تم إدخال الأتمتة في جميع خطوات العملية التجريبية للبلورات الجزيئية الكلية ، من التبلور إلى جمع ومعالجة بيانات الحيود1،2،3، 4،5،6،7،8،9، بما في ذلك عدد من التقنيات لتركيب العينة10،11،12 ،13،14،15،16،17. هذا لم يسرع فقط وتيرة التي يتم الحصول على الهياكل البلورية ولكن ساهمت في تبسيط التطبيقات مثل هيكل تصميم المخدرات الموجهة18،19،20،21،22،23،24. في هذه المخطوطة، نصف بعض جوانب خطوط أنابيب البلورات الآلية المتاحة في مختبر HTX في غرونوبل وكذلك التقنيات الأساسية.

يعد مختبر HTX في EMBL Grenoble أحد أكبر المرافق الأكاديمية لفحص التبلور في أوروبا. ويقع في موقع مشترك في حرم فوتون ونيوترون الأوروبي (EPN) جنبا إلى جنب مع مرفق الإشعاع السنكروترون الأوروبي (ESRF)، الذي ينتج بعض من ألمع أشعة إكس في العالم ومعهد لاو لانجيفين (ILL)، الذي يوفر أشعة نيوترونية عالية التدفق. منذ بدء العمليات في عام 2003، قدم مختبر HTX خدمات لأكثر من 800 عالم ويعالج أكثر من 1000 عينة سنويا. مختبر HTX لديه تركيز قوي في تطوير أساليب جديدة في علم البلورات الجزيئية الكلية، بما في ذلك أساليب لتقييم العينات ومراقبة الجودة25،26 وتكنولوجيا CrystalDirect ، مما يتيح تركيب الكريستال المؤتمت بالكاملومعالجة 15،16،17. كما طور مختبر HTX نظام إدارة المعلومات البلورية (CRIMS)، وهو نظام معلومات مختبري على شبكة الإنترنت يوفر اتصالا آليا بين مرافق جمع البيانات التبلورية والسنكروترونية، مما يتيح تدفق المعلومات دون انقطاع على مدار دورة العينة بأكملها من البروتين النقي إلى بيانات الحيود. من خلال الجمع بين قدرات منشأة HTX ، وتكنولوجيا CrystalDirect وبرنامج CRIMS ، قمنا بتطوير خطوط أنابيب مؤتمتة بالكامل من البروتين إلى الهيكل تدمج فحص التبلور ، وتحسين الكريستال ، ومعالجة حصاد الكريستال الآلي والتبريد وجمع بيانات الأشعة السينية في synchrotrons متعددة في سير عمل واحد ومستمر يمكن تشغيله عن بعد من خلال متصفح الويب. ويمكن تطبيق خطوط الأنابيب هذه لدعم التحديد السريع للهياكل الجديدة، وتوصيف مجمعات البروتين- ليغاند، وفحص المركبات والشظايا على نطاق واسع من خلال التصوير البلوري بالأشعة السينية.

تم تجهيز مختبر HTX بروبوت تبلور غيرفولومي (بما في ذلك وحدة LCP التي تمكن من بلورة كل من البروتينات القابلة للذوبان والأغشية) ، ومزارع الكريستال (عند 5 درجات مئوية و 20 درجة مئوية) ، ومحطتين آليتين للتعامل مع السائل لإعداد شاشات التبلور ، وحصادتين بلوريتين آليتين من كريستال دايركت مع القدرة على إنتاج وتخزين ما يصل إلى 400 دبابيس عينة مجمدة لكل دورة عملية. يرسل العلماء عيناتهم إلى المنشأة عن طريق البريد السريع ، والتي يتم معالجتها بعد ذلك من قبل فنيين مخصصين في مختبر HTX. يمكن للعلماء تصميم فحص التبلور عن بعد وتجارب التحسين من خلال واجهة ويب يوفرها نظام CRIMS. ومن خلال هذه الواجهة، يمكنهم الاختيار من بين مجموعة واسعة من المعلمات والبروتوكولات التجريبية المتاحة في المرفق لتناسب متطلباتهم المحددة من العينات. يتم توفير النتائج مع جميع المعلمات التجريبية للمستخدمين في الوقت الحقيقي من خلال CRIMS. يتم فحص جميع العينات المستلمة من خلال طريقة مطورة خصيصا تمكن من تقدير احتمال تبلور العينة25و26و27. بناء على نتائج هذه التوصيات المحددة المقايسة يتم تقديمها للمستخدمين بشأن درجة حرارة الحضانة المثلى والتجارب المحتملة لتحسين العينة. بمجرد إعداد تجارب التبلور ، يمكن للعالم تقييم النتائج من خلال النظر في صور التبلور التي تم جمعها في نقاط زمنية مختلفة من خلال الويب. عندما يتم تحديد بلورات مناسبة لتجارب الحيود بالأشعة السينية، يمكن للعلماء استخدام واجهة مخصصة لوضع خطة تركيب الكريستال التي سيتم تنفيذها بعد ذلك من قبل الروبوت كريستال دايركت.

وتستند التكنولوجيا CrystalDirect على استخدام بخار تعديل نشر بلورة microplate وشعاع ليزر لتركيب والتبريد بارد عينات الكريستال في حيود متوافق يدعم سد الفجوة الأتمتة القائمة بين التبلور وجمع البيانات15،16،17. باختصار، تزرع البلورات في لوحة نشر بخار معدلة، لوحة كريستال دايركت الدقيقة. بمجرد ظهور البلورات ، يطبق روبوت الحصاد CrystalDirect شعاع ليزر تلقائيا لاستئصال قطعة فيلم تحتوي على الكريستال ، وإرفاقها بدبوس جمع بيانات الحيود القياسي ، وتبريده في تيار غاز النيتروجين (انظر Zander et al. 2016 و https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8). هذه التكنولوجيا لديها عدد من المزايا الإضافية على بروتوكولات تركيب الكريستال اليدوي أو شبه الآلي. على سبيل المثال ، حجم وشكل البلورات ليست مشكلة ، مما يجعل من السهل بنفس القدر حصاد بلورات كبيرة أو بلورات دقيقة ، فمن الممكن في كثير من الأحيان تجنب استخدام المواد حماية التبريد ، وذلك بسبب الطريقة الخاصة التي تعمل بها التكنولوجيا (انظر المرجع 17 ، زاندر وآخرون) ، مما يجعل تحليل حيود الأشعة السينية أكثر وضوحا. يمكن أيضا استخدام شعاع الليزر كأداة جراحية لتحديد أفضل أجزاء العينة عندما تنمو البلورات على مجموعات أو تظهر نموا فوق الضرائب على سبيل المثال. ويمكن أيضا أن تستخدم التكنولوجيا CrystalDirect لتجارب نقع الآلي17. تسليم المحاليل مع جزيئات صغيرة أو غيرها من المواد الكيميائية إلى بلورات. وبالتالي فإنه يمكن من دعم الآلي بالكامل، والفحص المركب على نطاق واسع وجزء. مرة واحدة يتم حصاد بلورات و cryocooled بواسطة الروبوت CrystalDirect، يتم نقلها إلى العمود الفقري أو الصولجانات Unipuck التي تتوافق مع معظم خطوط شعاعية البلورات الجزيئية الكلية متزامنة في جميع أنحاء العالم. يمكن للنظام حصاد ما يصل إلى 400 دبابيس (قدرة التخزين المبرد ديوار) بطريقة مستقلة تماما. تتواصل CRIMS مع روبوت الحصاد أثناء العملية وتوفر تتبعا آليا لعينات الكريستال (الصولجانات والدبابيس). يتم وضع علامة على الصولجانات مع كل من الباركود وعلامات RFID لتسهيل إدارة العينة21،28.

يوفر CRIMS واجهة برنامج تطبيق (API) تدعم الاتصالات الآلية مع نظام ISPyB لدعم إدارة ومعالجة جمع البيانات بالأشعة السينية في العديد من السنكروترونات في أوروبا والعالم29. بعد اكتمال حصاد الكريستال الآلي، يمكن للعلماء اختيار عينات الكريستال (الصولجانات) وإنشاء شحنات عينة لعوارض البلورات الجزيئية الكلية إما في ESRF (غرونوبل، فرنسا)7،8،9 أو البتراء الثالثة السنكروترونات (هامبورغ، ألمانيا)18،19. نقل البيانات الموافقة لعينات الحزم المحددة إلى نظام معلومات السنكروترون مع معلمات جمع البيانات المحددة مسبقا. وبمجرد وصول العينات إلى خط الحزم السينكروتروني المختار، يتم جمع بيانات الأشعة السينية إما يدويا، أو من خلال تشغيل خط الحزم عن بعد أو بطريقة مؤتمتة بالكامل (أي في خط الحزمة MASSIF-1 من ESRF8 الذي تديره مجموعة EMBL ESRF المشتركة للبيولوجيا الهيكلية المشتركة (JSBG)). بعد جمع البيانات يقوم CRIMS باسترداد المعلومات تلقائيا حول نتائج جمع البيانات جنبا إلى جنب مع نتائج معالجة البيانات الأولية التي تقوم بها أنظمة معالجة البيانات synchrotron ويعرضها على العالم من خلال واجهة مستخدم مريحة.

يطبق مختبر HTX خطوط الأنابيب الآلية هذه لدعم ثلاثة تطبيقات مختلفة ، والتحديد السريع للهياكل الجديدة ، والتوصيف السريع لمجمعات البروتين - ليغند وفحص المركبات والشظايا على نطاق واسع. فيما يلي وصف كيفية استخدامها وتشغيلها.

Protocol

ملاحظة: يتم دعم الوصول الممول إلى خطوط الأنابيب هذه للعلماء في جميع أنحاء العالم من خلال سلسلة من برامج التمويل. في لحظة كتابة هذه المخطوطة يتم قبول طلبات الوصول إما من خلال برنامج اكتشاف iNEXT (https://inext-discovery.eu) ، وهي شبكة منشأة أوروبية لتحفيز البيولوجيا الهيكلية الترجمية20 الممولة من برنامج أفق 2020 للمفوضية الأوروبية أو INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/). اتصل بالمؤلف المقابل للاطلاع على الطرائق والطرق الحالية للوصول الممول في وقت معين. يصف هذا البروتوكول تشغيل خط أنابيب البروتين إلى الهيكل ويتضمن خطوات مشتركة بين جميع خطوط الأنابيب الخاصة بنا بينما تتم مناقشة خصوصيات خطي الأنابيب الآخرين في القسم التالي. التعليمات هنا تشير إلى قرمزي V4.0.

1. عالية الإنتاجية تبلور المختبر

  1. قبل البدء، اطلب التسجيل في مختبر HTX من خلال نظام CRIMS https://htxlab.embl.fr/#/. توفر بيانات اعتماد المستخدم الوصول عن بعد إلى كافة واجهات التصميم والتقييم التجريبية.
    1. تسجيل الدخول إلى CRIMS من خلال متصفح الويب (فايرفوكس، كروم وسفاري معتمدة). يتم تشفير خادم الويب CRIMs لمنع الأطراف الثالثة من الوصول إلى البيانات أثناء تنقلها عبر الويب. مرة واحدة في CRIMS، سلسلة من القوائم إلى يسار الفحص تساعد على إدارة وإنشاء عينات، وطلب تجارب تبلور، وإدارة وتصور لوحات، الخ. تتوفر سلسلة من دروس الفيديو في https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d.
      ملاحظة: يحتاج المستخدمون الذين يرسلون العينات عن طريق البريد السريع إلى تسجيل العينات وتجارب التبلور المطلوبة من خلال CRIMS قبل إرسال العينة للتأكد من إمكانية معالجتها دون تأخير عند الوصول. رجاء، أرسل تفاصيل الشحنة إلى htx@embl.fr.
  2. تسجيل الدخول إلى CRIMS (https://htxlab.embl.fr) مع متصفح ويب وانقر على قائمة العينات. سيؤدي ذلك إلى فتح واجهة مع أدوات إدارة المشروع والعينات.
  3. انقر على زر عينة جديدة وتقديم المعلومات المطلوبة. يسمح CRIMS بتنظيم عينات في إطار مشاريع وأهداف وبنى مختلفة. تعيين العينة إلى الموجودة أو إنشاء جديدة في هذه المرحلة.
  4. بمجرد إدخال المعلومات المطلوبة انقر على حفظ وتقديم طلب. حدد بروتوكول التبلور، وشاشات التبلور التي سيتم استخدامها، ودرجة حرارة الحضانة والتاريخ المطلوب للتجارب.
    1. استخدم حقول التعليق لتوفير مؤشرات حول العينات التي تعتبر مهمة لعوامل تشغيل مختبر HTX لمعرفة. ويمكن أيضا تحديد شاشات مخصصة (انظر أدناه). بعد تقديم طلب التبلور سيتم التحقق من صحته من قبل فريق مختبر HTX وسيتم إرسال تأكيد حول جدولة التجارب عبر البريد الإلكتروني. تأكد من تحديد تواريخ التجربة المتوافقة مع الأوقات المطلوبة لشحن العينة.
  5. وبمجرد وصول العينات إلى المرفق سيقوم مشغلو المختبر بإجراء التجارب على النحو المطلوب. وبمجرد إعداد تجارب التبلور، سيتم إرسال التأكيد عبر البريد الإلكتروني وسيتم نقل صواني التبلور إلى الصور الآلية. يوفر CRIMS الوصول إلى جميع المعلمات التجريبية وسيتتبع تلقائيا جلسات التصوير الجديدة. سيتم إرسال إعلامات البريد الإلكتروني تلقائيا عند توفر صور جديدة. يتم إجراء تجربة تقييم جودة العينة المستندة إلى30 درجة حرارة استنادا إلى بروتوكول تم تطويره في المرفق25،26 مع كل عينة في هذه المرحلة وستكون متاحة من خلال CRIMS.
  6. وسوف تكون صور لتجارب التبلور جنبا إلى جنب مع نتائج تقييم جودة العينة متاحة في CRIMS بعد وقت قصير من إعداد صواني التبلور. انقر على قائمة Thermofluor وانتقل إلى العينة لرؤية نتائج تجربة تقييم جودة العينة.
    1. انقر على قائمة اللوحات لرؤية الصور من لوحات التبلور. انتقل إلى العينة وإما انقر على عرض لمشاهدة جلسة التصوير الأخيرة أو على رمز + (توسيع) لتحديد جلسة تصوير مختلفة. وهناك سلسلة من الأدوات تساعد على العثور على والتنقل بسهولة من خلال العينات. على سبيل المثال، النقر فوق في مربع مشروع في أعلى شاشات عوامل تصفية نماذج لهذا المشروع و تتوفر وظائف البحث لمعظم أعمدة الجدول.
  7. استخدم واجهة عرض اللوحة للمساعدة في تقييم نتائج تجارب التبلور وتسجيلها. فهو يسمح بالتنقل عبر الآبار المختلفة للوحات التبلور، أو تحديد أنواع الصور (أي Vis أو UV) أو تحديد دقة الصورة أو تسجيل الدرجات، على سبيل المثال. توفر هذه الواجهة أيضا جميع المعلمات التجريبية المستخدمة في تجارب التبلور بما في ذلك تكوين حلول التبلور.
  8. انقر على القائمة الصقل لتصميم شاشات الكريستال الأمثل على أساس شروط ضرب الأولية التي تم تحديدها من خلال الفحص الأولي. تسمح الخانة الفرعية لحلول المواد الكيميائية والمخزون لأحدها بتسجيل حلول مخزون التبلور وإدارتها. توفر الشاشة الفرعية الوصول إلى واجهة لتصميم شاشات التحسين أو الشاشات المخصصة الخاصة بك.
    1. حدد نوع اللوحة أو حلول المخزون أو تكوينات التدرج التي تناسب التصميم التجريبي بشكل أفضل. من الممكن أن تطلب من CRIMS إخراج ملف متوافق مباشرة مع روبوت المصوغ (Formulatrix) لتزين الشاشات تلقائيا في اللوحة أو إخراج مستند قابل للطباعة مع وحدات التخزين للتشغيل اليدوي.
  9. يتكرر من خلال الخطوات 1.2-1.8 لإجراء تجارب التحسين الكريستال.
  10. بمجرد تحديد بلورات مناسبة لتجارب الحيود بالأشعة السينية ، انتقل إلى واجهة عرض اللوحة وحدد الصورة المقابلة لإسقاط التبلور الصحيح. ستساعدك الدرجات المخزنة مسبقا على القيام بذلك بسهولة.
    1. انقر إما على حصاد كريستال لتسجيل خطة حصاد الكريستال الآلي للروبوت حصادة CrystalDirect أو على الحصاد اليدوي لتركيب الكريستال اليدوي التقليدي، إذا باستخدام CRIMS في منشأة غير مجهزة كريستال دايركت. كل من واجهات ستوجه المستخدم من خلال عملية حصاد الكريستال. سوف قرمزي تلقائيا تسجيل وتخزين موقع بلورات حصادها في العمود الفقري أو Unipucks21.
  11. حدد قائمة مدير كريستال في CRIMS. انقر على البلورات المحصودة الفرعية لفحص العينات المجمدة. عند استخدام حصادة CrystalDirect ، يتم تقديم صور لعملية الحصاد ، بما في ذلك صور الدبابيس مع البلورات المحصودة.
  12. حدد قائمة الشحنات للاتصال إما ب ESRF أو البتراء III synchrotrons وإنشاء عينات الشحنات لتحليل حيود الأشعة السينية. انقر على زر إنشاء شحنة وحدد السنكروترون الذي تريد استخدامه ورقم الحقيبة (كلمة مرور الحقيبة في السنكروترون ضرورية هنا). وتستخدم السلسلة التالية من الواجهات لتحديد pukcs ليتم تضمينها في الشحنة. يتيح النظام تقديم تعليقات لدعم جمع البيانات وتحديد معلمات جمع البيانات لخطوط الحزم الآلية مثل MASSIF-1.
  13. إذا كان يجري جمع البيانات في ESRF أو بترا الثالث HTX المختبر، المشغلين سيتم نقل العينات إلى خط الحزمة، وسيتم جمع البيانات في السنكروترونات الأخرى على حساب المستخدم نفسه. من الممكن جمع البيانات عن طريق السفر إلى السنكروترون، من خلال تشغيل خط الحزم عن بعد أو في MASSIF-1. وفي الحالة الأخيرة، تكون عملية جمع البيانات مؤتمتة بالكامل. في السنكروترون، تسمح واجهات محددة في ISPyB29 للمستخدمين باسترداد المعلومات المرسلة من قبل CRIMS وربط عينات الصولجانات إليها بحيث يتم تتبع نتائج جمع البيانات تلقائيا. للتجارب الموصوفة هنا ، تم جمع البيانات في synchrotrons عادة مع برنامج MXcube31 ، في حين تم معالجة البيانات وصقل الهيكل مع atuoPROC32، Staraninso33، BUSTER33، Pipedream32،33 و Coot35.
  14. بمجرد إجراء تجارب جمع البيانات ، تقوم CRIMS باسترداد معلومات موجزة إلى جانب نتائج معالجة البيانات الأولية في السنكروترون من نظام ISPyB29. انتقل إلى قائمة مدير كريستال كريمز وانقر على القائمة الفرعية بيانات الحيود كريستال. جميع المعلومات والبيانات الوصفية المتعلقة بجمع بيانات الحيود متاحة. من الممكن أيضا تنزيل البيانات المعالجة من السنكروترون بالإضافة إلى صور الحيود الخام. عرض مجموعات بيانات متعددة أو تحديد مجموعات بيانات محددة. أدوات إدارة العينة تجعل من الممكن التنقل وتحديد عينات لبنى مشاريع محددة.
    ملاحظة: يوفر خط الأنابيب هذا التشغيل الآلي بالكامل عبر الإنترنت من البروتين النقي إلى نتائج حيود الأشعة السينية ويمكن تشغيله بعينة واحدة أو عدة عينات في نفس الوقت. ويمكن تطبيقه على مختلف السياق وأنواع المشاريع في البيولوجيا الهيكلية.

Representative Results

تم تطبيق خط أنابيب البلورات الآلي الموصوف أعلاه لدعم عدد كبير من المشاريع الداخلية والخارجية بنجاح ملحوظ. ومن أبرز هذه المشاريع المشروع الذي قام به جينوفيتش كاروغو وزملاء العمل من مختبرات ماكس بيروتز (فيينا) مع التركيز على التحليل الهيكلي والوظيفي لبيبتيديز ثنائي البيبتيديل الضروري لنمو العامل الممرض البكتيري. وقد مكنت التعاقب السريع لفحص التبلور وتقييم الحيود وتحسين الكريستال ودورات جمع البيانات بالأشعة السينية (ما يصل إلى 8 تكرارات لهذا المشروع) من الحصول على نماذج هيكلية لثلاث حالات تشكيلية مختلفة للبروتين في غضون أسابيع قليلة، مما وفر فهما ميكانيكيا رئيسيا لوظيفة هذه الفئة من البروتينات36 (انظر الشكل 1).

مثال آخر هو من ماسياس وزملاء العمل من معهد البحوث الطبية الحيوية (IRB، برشلونة) التي جمعت بين أدوات المعلوماتية الحيوية والنهج الهيكلية لتحديد زخارف جديدة ملزمة الحمض النووي لعوامل النسخ SMAD3 و SMAD4 المشاركة في تنظيم مصير الخلية. وقد أنتج هذا العمل 6 هياكل عالية الدقة من SMAD3 و 4 في مجمع مع مختلف الزخارف ملزمة الحمض النووي37،38 تكشف عن قدرة غير مشكوك فيها حتى الآن من هذه العوامل النسخ للتعرف على وربط لمجموعة متنوعة من تسلسل الحمض النووي ، وهو أمر أساسي لتفسير وظيفتها في سياقات بيولوجية مختلفة. كما تم تطبيق هذه التقنيات لدعم البحوث الملكية في سياق مشاريع تصميم الأدوية من مجموعات البحوث في شركات الأدوية والتكنولوجيا الحيوية. على سبيل المثال ، بفضل السرعة التي ساهمت بها خطوط الأنابيب هذه ، يمكن تحقيق التحليل الهيكلي للمجمعات متعددة الأهداف في غضون أيام ، وهو أمر ذو قيمة كبيرة لدعم الجولات المتعاقبة تحسين الكيمياء الطبية في سياق تطوير الأدوية. وأخيرا قمنا أيضا بتطبيق هذه البنية التحتية على نطاق واسع الأشعة السينية على أساس فحص جزء39.

Figure 1
الشكل 1: خط أنابيب البلورات الآلي. التشغيل المتكامل لمختبر EMBL HTX بما في ذلك تقنية CrystalDirect وبرنامج CRIMS مع خط الحزم MASSIF-1 في ESRF والاتصال الآلي بين برنامج CRIMS و ISPyB يمكن من دعم خط أنابيب من البروتين إلى الهيكل المؤتمت بالكامل والتحكم فيه عن بعد ودمج فحص التبلور والتحسين ، والحصاد الآلي للكريستال والتبريد البارد وجمع البيانات ومعالجتها تلقائيا. تتوافق النماذج الهيكلية مع ثلاث حالات تشكيلية مختلفة من بروتياز من بكتيريا مسببة للأمراض تم تحديدها في وقت قياسي من خلال تطبيق خط الأنابيب36. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تتوفر خطوط أنابيب البلورات الآلية الموصوفة هنا للباحثين في جميع أنحاء العالم من خلال برامج تمويل مختلفة. حاليا، يمكن الحصول على الوصول الممول لتجارب التبلور وتكنولوجيا CrystalDirect من خلال تطبيق برنامج اكتشاف iNEXT و INSTRUCT-ERIC، في حين يتم دعم الوصول إلى خطوط شعاعية بلورية مجهرية في ESRF من خلال برنامج وصول المستخدم ESRF. ويقلل هذا النهج من التأخير بين نمو الكريستال وقياسه، ويسرع من تقدم المشاريع الصعبة للغاية التي تتطلب التحسين القائم على الحيود لإنتاج البروتين وظروف التبلور ويحرر العلماء من العمليات المعقدة المرتبطة بالتبلور والمناولة البلورية وتشغيل الحزمة، مما يجعل علم البلورات أكثر سهولة للمجموعات غير الخبيرة. ويمكن أيضا استخدامه للاستكشاف السريع لإضافات التبلور أو عوامل التدرج أو للفحص المركب من خلال تجارب التبلور المشترك. وفي حين أن معظم مشاريع علم البلورات يمكن أن تستفيد من هذا النهج، فإن بعض العينات قد تتطلب بروتوكولات خاصة غير قابلة للأتمتة أو لخطوط الأنابيب المعروضة هنا، على سبيل المثال تلك التي تتطلب نظما ميكروفلويدية أو أجهزة تبلور متخصصة للغاية أو عينات شديدة التشبيه ولن تتسامح مع الشحن.

كما تمكن تقنية CrystalDirect من امتصاص الكريستال الآلي17 لتوصيف المجمعات الصغيرة المستهدفة بالجزيئات. لهذا، يتم إنشاء فتحة صغيرة مع الليزر قبل عملية الحصاد ويتم إضافة قطرة من محلول يحتوي على المواد الكيميائية المطلوبة (أي عوامل المراحل أو الليجاندس المحتملة) على القمة، بحيث يدخل في اتصال مع، ويوزع في حل تبلور تصل في نهاية المطاف إلى الكريستال. يمكن صياغة الحلول الكيميائية في الماء أو DMSO أو المذيبات العضوية الأخرى. بعد فترة حضانة معينة يمكن حصاد البلورات وتحليلها عن طريق الحيود كما هو موضح أعلاه. وقد طبق هذا النهج على التوصيف السريع لمجمعات البروتين الليغاندي في سياق تصميم الأدوية القائمة على الهيكل وكذلك على فحص المركبات والشظايا على نطاق واسع. في الحالة الأخيرة يمكن تحليل مكتبات مجزأة مع مئات إلى أكثر من ألف شظايا بسرعة. تسهل واجهات CRIMS المحددة غير المعروضة هنا تصميم تجارب نقع الكريستال وتتبعها آليا ، في حين أن التكامل بين برنامج CRIMS ومجموعة برامج Pipedream ، التي طورتها Global Phasing Ltd (المملكة المتحدة) تمكن من معالجة البيانات الآلية ، والتدرج ، وتحديد ligand وصقل الهيكل على مئات مجموعات البيانات بالتوازي ، وتبسيط تحليل البياناتوتفسيرها 32333 . على سبيل المثال ، تم تطبيق خط الأنابيب هذا مؤخرا لتحديد الأجزاء الملزمة للموقع النشط والعديد من المواقع الأل أوسترية في تريبانوسوما بروسي فارنيسيل بيريوسفات synthase ، وهو إنزيم رئيسي للطفيلي يسبب التريبانوسوسوميا الأفريقية البشرية.

يمكن أن تساهم خطوط الأنابيب المعروضة هنا في تسريع وتيرة الاكتشاف في البيولوجيا الهيكلية وجعل علم البلورات الجزيئية الكلية أكثر سهولة لعدد أكبر من مجموعات البحث. وعلاوة على ذلك، فإنها، بتسهيلها للفحص الواسع النطاق للمركبات والشظايا، يمكنها أن تسهم في تعزيز البحوث التحويلية والتعجيل بعملية اكتشاف المخدرات، مما يسهم في تيسير تطوير عقاقير أفضل وأكثر أمانا ضد عدد أكبر من الأهداف.

Disclosures

JAM هو المؤلف المشارك لبراءة اختراع على نظام CrystalDirect

Acknowledgments

نود أن نشكر مجموعة EMBL-ESRF المشتركة للبيولوجيا الهيكلية (JSBG) على الدعم في استخدام وتشغيل خطوط الحزم الجزيئية الكلية ESRF. نحن ممتنون لماثيو بولر لدعمه في جمع البيانات في خط الحزم MASSIF-1 من ESRF وتوماس شنايدر وفريق EMBL هامبورغ للدعم الممتاز مع جمع البيانات في P14 من السنكروترون PetraIII (DESY، هامبورغ، ألمانيا). تم تطوير حصادة CrystalDirect بالتعاون مع فريق الأجهزة في EMBL Grenoble. وقد تم دعم هذا المشروع بتمويل من برنامج الجماعة الأوروبيةH2020 في إطار مشروعي iNEXT (المنحة رقم 653706) و iNEXT Discovery (المنحة رقم 871037) وكذلك Région Auvergne-Rhône-Alpes من خلال برنامج الداعم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CrystalDirect harvester Arinax Automated crystal mounting and cryocooling
CrystalDirect Crystallization plate Mitegen SKU: M-XDIR-96-2 96-well crytsallization microplate
Formulator 16 Formulatrix For the autoamted preparation of crystallization screens
Mosquito crystallization Robot SPT Labtech For the preparation of crystallization experiments
Tecan Evo Liquid handling station Tecan For the preparation of crystallization solutions
Spine Pucks Mitegen SKU: M-SP-SC3-1 SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
UniPucks Mitegen SKU: M-CP-111-021 Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. Automation of X-ray crystallography. Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).
  2. Banci, L., et al. First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value. Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).
  3. Edwards, A. Large-scale structural biology of the human proteome. Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).
  4. Rupp, B., et al. The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density. Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).
  5. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  6. Cusack, S., et al. Small is beautiful: protein micro-crystallography. Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).
  7. McCarthy, A. A., et al. ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).
  8. Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  9. von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).
  10. Viola, R., et al. First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals. Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).
  11. Khajepour, M. Y. H., et al. REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).
  12. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69, 1297-1302 (2006).
  13. Collins, P. M. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).
  14. Deller, M. C., Rupp, B. Approaches to automated protein crystal harvesting. Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).
  15. Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).
  16. Márquez, J. A., Cipriani, F. CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films. Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).
  17. Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
  18. Cianci, M., et al. P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).
  19. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  20. iNEXT Consortium . iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  21. Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
  22. Whittle, P. J., Blundell, T. L. Protein Structure-Based drug design. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).
  23. Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. High-throughput crystallography for lead discovery in drug design. Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).
  24. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination. Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).
  25. Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay. Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).
  26. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  27. Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. Acta Crystallographica. F63, 204-208 (2007).
  28. Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines. , 060074 (2019).
  29. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  30. Ericsson, U., et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  31. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).
  32. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
  33. Smart, O. S., et al. Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).
  34. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  35. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).
  36. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  37. Martin-Malpartida, P., et al. Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors. Nature Communications. 8 (1), 2070 (2017).
  38. Aragón, E., et al. Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling. Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).
  39. Münzker, L., et al. Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase. ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 172،
خطوط أنابيب البلورات الآلية في مرفق EMBL HTX في غرونوبل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cornaciu, I., Bourgeas, R.,… More

Cornaciu, I., Bourgeas, R., Hoffmann, G., Dupeux, F., Humm, A. S., Mariaule, V., Pica, A., Clavel, D., Seroul, G., Murphy, P., Márquez, J. A. The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble. J. Vis. Exp. (172), e62491, doi:10.3791/62491 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter