Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

De automatiserede krystallografirørledninger på EMBL HTX-anlægget i Grenoble

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62491
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 1, 1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2
1European Molecular Biology Laboratory, 2ALPX S.A.S., 3Institut de Biologie Structurale

Summary

Her beskriver vi, hvordan du bruger de automatiserede makromolekylær krystallografirørledninger til protein-til-struktur, hurtig ligandprotein kompleks analyse og storskala fragmentscreening baseret på CrystalDirect-teknologien på HTX Laboratory i EMBL Grenoble.

Abstract

EMBL Grenoble driver High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), en storstilet brugerfacilitet, der tilbyder høj gennemløb krystallografi tjenester til brugere over hele verden. HTX laboratoriet har et stærkt fokus i udviklingen af nye metoder inden for makromolekylære krystallografi. Gennem kombinationen af en høj gennemløb krystallisering platform, CrystalDirect teknologi til fuldautomatisk krystal montering og kryokooling og CRIMS software, vi har udviklet fuldautomatiske rørledninger til makromolekylær krystallografi, der kan fjernstyres over internettet. Disse omfatter en protein-til-struktur-rørledning til bestemmelse af nye strukturer, en rørledning til hurtig karakterisering af protein-ligand-komplekser til støtte for medicinsk kemi og en storstilet, automatiseret fragmentscreeningspipeline, der gør det muligt at evaluere biblioteker med over 1000 fragmenter. Her beskriver vi, hvordan du får adgang til og bruger disse ressourcer.

Introduction

Automatisering er blevet indført på alle trin i den makromolekylære krystallografi eksperimentelle proces, fra krystallisering til diffraktion dataindsamling og behandling1,2,3,4,5,6,7,8,9, herunder en række teknologier til prøve montering10,11,12 ,13,14,15,16,17. Dette har ikke kun fremskyndet det tempo, hvormed krystallographic struktureropnås,men har bidraget til at strømline applikationer som strukturstyret lægemiddeldesign18,19,20,21,22,23,24. I dette manuskript beskriver vi nogle af de aspekter af de automatiserede krystallografirørledninger, der er tilgængelige på HTX-laboratoriet i Grenoble samt de underliggende teknologier.

HTX-laboratoriet på EMBL Grenoble er en af de største akademiske faciliteter til udkrystalaliseringsscreening i Europa. Det er co-placeret på European Photon and Neutron (EPN) campus sammen med den europæiske Synkrotron Radiation Facility (ESRF), som producerer nogle af verdens mest strålende røntgenstråler og Institut Laue Langevin (ILL), som giver høje flux neutronstråler. Siden starten af operationer i 2003 har HTX-laboratoriet leveret tjenester til over 800 forskere og behandler mere end 1000 prøver om året. HTX-laboratoriet har et stærkt fokus på udvikling af nye metoder inden for makromolekylær krystallografi, herunder metoder til prøveevaluering ogkvalitetskontrol 25,26 og CrystalDirect-teknologien, der muliggør fuldautomatisk krystalmontering og -behandling15,16,17. HTX-laboratoriet har også udviklet Crystallographic Information Management System (CRIMS), et webbaseret laboratorieinformationssystem, der giver automatiseret kommunikation mellem krystallisering og synkrotron dataindsamlingsfaciliteter, hvilket muliggør uafbrudt informationsflow over hele prøvecyklussen fra rene protein- til diffraktionsdata. Gennem kombinationen af kapaciteten i HTX-anlægget, CrystalDirect-teknologien og CRIMS-softwaren har vi udviklet fuldautomatiske protein-til-struktur-rørledninger, der integrerer krystalliseringsscreening, krystaloptimering, automatiseret krystalhøstbehandling og kryokooling og røntgendataindsamling ved flere synkrotroner i en enkelt og kontinuerlig arbejdsgang, der kan fjernstyres via en webbrowser. Disse rørledninger kan anvendes til at støtte hurtig bestemmelse af nye strukturer, karakterisering af protein-ligand komplekser og storstilet sammensatte og fragment screening gennem røntgenkrystallografi.

HTX-laboratoriet er udstyret med en ikke-volum krystalliseringsrobot (herunder et LCP-modul, der muliggør krystallisering af både opløselige og membranproteiner), krystalfarme (ved 5 °C og 20 °C), to robotvæskehåndteringsstationer til forberedelse af krystalliseringsskærme og to automatiserede CrystalDirect-krystalhøstere med kapacitet til at producere og opbevare op til 400 frosne prøvenåle pr. driftscyklus. Forskere sender deres prøver til anlægget med ekspreskurer, som derefter behandles af dedikerede teknikere på HTX-laboratoriet. Forskere kan fjerndesigne krystallisering screening og optimering eksperimenter gennem en web-interface, som CRIMS system. Gennem denne grænseflade kan de vælge mellem en lang række parametre og eksperimentelle protokoller, der er tilgængelige på anlægget, så de passer til deres specifikke prøvekrav. Resultater sammen med alle eksperimentelle parametre stilles til rådighed for brugerne i realtid gennem CRIMS. Alle modtagne prøver analyseres ved hjælp af en specielt udviklet metode , der gør det muligt at vurdere sandsynligheden for krystallisering af prøve25,26,27. Baseret på resultaterne af denne analyse fremsættes specifikke anbefalinger til brugerne vedrørende den optimale inkubationstemperatur og mulige forsøg med optimering af prøver. Når krystallisering eksperimenter er oprettet, videnskabsmand kan evaluere resultaterne ved at se på krystallisering billeder indsamlet på forskellige tidspunkter via internettet. Når krystaller, der er egnede til røntgen diffraktionsforsøg, identificeres, kan forskere bruge en dedikeret grænseflade til at etablere en krystalmonteringsplan, der derefter udføres af CrystalDirect-robotten.

CrystalDirect-teknologien er baseret på brugen af en modificeret dampdiffusoriseringsmikroplade og en laserstråle til at montere og kryokøle krystalprøver i diffraktionskompatible understøtter lukning af automatiseringskløften mellem krystallisering og dataindsamling15,16,17. Kort sagt dyrkes krystaller i en modificeret dampdiffusionsplade, CrystalDirect-mikropladen. Når krystaller vises CrystalDirect høst robot automatisk anvender en laserstråle til punktafgifter en film stykke, der indeholder krystal, vedhæfte den til en standard diffraktion dataindsamling pin, og kryo-cool det i en nitrogen gasstrøm (se Zander et al. 2016 og https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). Denne teknologi har en række yderligere fordele i forhold til manuelle eller halvautomatiske krystalmonteringsprotokoller. For eksempel er krystallernes størrelse og form ikke et problem, hvilket gør det lige så nemt at høste store krystaller eller mikrokrystaller, det er ofte muligt at undgå brugen af kryo-protectants på grund af den specielle måde, hvorpå teknologien fungerer (se reference 17, Zander et al.), hvilket gør X-ray diffraktionsanalyse meget mere ligetil. Laserstrålen kan også bruges som et kirurgisk værktøj til at vælge de bedste dele af en prøve, når krystaller vokser på klynger eller viser epitalsvækst for eksempel. CrystalDirect-teknologien kan også bruges til automatiserede iblødsætningsforsøg17. Levering af opløsninger med små molekyler eller andre kemikalier til krystaller. Derved gør det muligt at understøtte fuldautomatisk, storstilet forbindelses- og fragmentscreening. Når krystaller er høstet og cryocooled af CrystalDirect robot, de overføres til enten SPINE eller Unipuck pucks, som er kompatible med de fleste synkrone makromolekylær krystallografi strålelinjer rundt om i verden. Systemet kan høste op til 400 stifter (kapaciteten af den kryogene opbevaring Dewar) på en fuldt autonom måde. CRIMS kommunikerer med mejetærskeren robot under processen og giver automatiseret sporing af krystal prøver (pucks og stifter). Pucks er markeret med både stregkoder og RFID-tags for at lette prøvestyring21,28.

CRIMS giver en applikationsprogram interface (API), der understøtter automatiseret kommunikation med ISPyB-systemet, der understøtter administration og behandling af røntgendata på mange synkrotroner i Europa og verden29. Når automatiseret krystalhøst er afsluttet, kan forskerne vælge krystalprøver (pucks) og oprette prøveforsendelser til de makromolekylære krystallografibjælkelinjer på enten ESRF (Grenoble, Frankrig)7,8,9 eller Petra III synkrotroner (Hamburg, Tyskland)18,19. CRIMS overfører de data, der svarer til de valgte strålelinjeeksempler, til synkrotroninformationssystemet sammen med forudvalgte dataindsamlingsparametre. Når prøverne ankommer til den valgte synkrotronstrålelinje, udføres røntgendataindsamlingen enten manuelt, gennem fjernstråleoperation eller på en fuldautomatisk måde (dvs. ved MASSIF-1-strålelinjen i ESRF8, der drives af den fælles EMBL ESRF Joint Structural Biology Group (JSBG)). Efter dataindsamlingen henter CRIMS automatisk oplysninger om resultaterne af dataindsamling sammen med de første databehandlingsresultater, der udføres af synkrotrondatabehandlingssystemerne, og præsenterer dem for forskeren gennem en bekvem brugergrænseflade.

HTX-laboratoriet anvender disse automatiserede rørledninger til at understøtte tre forskellige applikationer, hurtige bestemmelseer af nye strukturer, hurtig karakterisering af protein-ligand komplekser og storstilet forbindelses- og fragmentscreening. Nedenfor beskriver vi, hvordan du bruger og betjener dem.

Protocol

BEMÆRK: Finansieret adgang til disse rørledninger for forskere over hele verden understøttes gennem en række finansieringsprogrammer. I skrivende stund accepteres disse manuskriptansøgninger om adgang enten via iNEXT Discovery-programmet (https://inext-discovery.eu), et europæisk facilitetsnetværk til stimulering af translationel strukturel biologi20 finansieret af Europa-Kommissionens Horizon 2020-program eller INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/). Kontakt den tilsvarende forfatter for de nuværende metoder og ruter for finansieret adgang på et bestemt tidspunkt. Denne protokol beskriver driften af protein-til-struktur-rørledningen og omfatter trin, der er fælles for alle vores rørledninger, mens særlige forhold for de to andre rørledninger diskuteres i det følgende afsnit. Instruktionerne her henviser til CRIMS V4.0.

1. Høj gennemløb Krystallisering Laboratorium

  1. Før du starter, skal du bede om registrering på HTX-laboratoriet gennem CRIMS-systemet https://htxlab.embl.fr/#/. Brugerlegitimationsoplysningerne giver fjernadgang til alle eksperimentelle design- og evalueringsgrænseflader.
    1. Log på CRIMS via en webnavigator (Firefox, Chrome og Safari understøttes). CRIMs webserver er krypteret for at forhindre tredjeparter i at få adgang til data, mens den rejser via internettet. En gang i CRIMS hjælper en række menuer til venstre for screeningen med at styre og oprette prøver, anmode om krystalliseringseksperimenter, administrere og visualisere plader osv. En række video tutorials er tilgængelige på https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d.
      BEMÆRK: Brugere, der sender prøver med kurer, skal registrere prøverne og de ønskede krystalliseringseksperimenter gennem CRIMS, før de sender prøven for at sikre, at de kan behandles uden forsinkelse ved ankomsten. Send forsendelsesoplysningerne til htx@embl.fr.
  2. Log på CRIMS (https://htxlab.embl.fr) med en webbrowser, og klik på menuen Eksempler. Dette åbner en grænseflade med projekt- og eksempelstyringsværktøjer.
  3. Klik på knappen Ny prøve, og angiv de ønskede oplysninger. CRIMS gør det muligt at organisere prøver under forskellige projekter, mål og konstruktioner. Tildel eksemplet til eksisterende, eller opret nye på dette tidspunkt.
  4. Når de ønskede oplysninger er angivet, skal du klikke på Gem & Ankvirer. Vælg krystalliseringsprotokollen, krystalliseringsskærmene, der skal bruges, inkubationstemperaturen og den ønskede dato for forsøgene.
    1. Brug kommentarfelterne til at give indikationer om de prøver, der er vigtige for HTX-laboratorieoperatørerne at kende. Brugerdefinerede skærmbilleder kan også vælges (se nedenfor). Når du har indsendt crystalliseringsanmodningen, vil den blive valideret af HTX Lab Team, og bekræftelse om planlægningen af forsøgene sendes via e-mail. Sørg for at vælge eksperimentdatoer, der er kompatible med de tidspunkter, der kræves til eksempelforsendelse.
  5. Når prøverne ankommer til anlægget operatører på HTX lab vil udføre eksperimenter som ønsket. Når krystalliseringseksperimenter er oprettet, sendes bekræftelsen via e-mail, og krystalliseringsbakker overføres til de automatiserede imagere. CRIMS giver adgang til alle eksperimentelle parametre og sporer automatisk nye billedsessioner. E-mail-meddelelser sendes automatisk, når nye billeder er tilgængelige. Et termofluorbaseret30-prøvekvalitetsvurderingseksperiment baseret på en protokol udviklet på faciliteten25, 26 udføres med hver prøve på dette tidspunkt og vil være tilgængelig via CRIMS.
  6. Billeder af krystalliseringseksperimenterne sammen med resultaterne af stikprøvens kvalitetsvurdering vil være tilgængelige i CRIMS kort tid efter, at krystalliseringsbakkerne er oprettet. Klik på termofluormenuen, og naviger til prøven for at se resultaterne af eksperimentet til vurdering af stikprøven.
    1. Klik på menuen Plader for at se billederne fra krystalliseringspladerne. Gå til eksemplet, og klik enten på Vis for at se den sidste billedsession eller på symbolet + (udvid) for at vælge en anden billedsession. En række værktøjer hjælper med at finde og navigere nemt gennem prøverne. Hvis du f.eks. klikker i en projektboks øverst på skærmene, er der tilgængelige eksempler på eksempel for det pågældende projekt, og søgefunktioner er tilgængelige for de fleste tabelkolonner.
  7. Brug pladen Vis interface til at hjælpe med at evaluere og score resultaterne af krystallisering eksperimenter. Det giver mulighed for navigation gennem de forskellige brønde af krystallisering plader, vælg billedtyper (dvs. Vis, UV), vælg billedopløsning eller optage scorer, for eksempel. Denne grænseflade indeholder også alle eksperimentelle parametre, der anvendes til krystallisering eksperimenter, herunder sammensætningen af krystallisering løsninger.
  8. Klik på menuen Raffinement for at designe skærme til optimering af krystaller baseret på primære hitbetingelser, der er identificeret gennem den indledende screening. Undermenuerne Kemikalier og Lagerløsninger gør det muligt at registrere og styre krystalliseringslagerløsningerne. Undermenuen Skærme giver adgang til en grænseflade til at designe din egen optimering eller brugerdefinerede skærme.
    1. Vælg den pladetype, lagerløsninger eller gradueringskonfigurationer, der passer bedst til det eksperimentelle design. Det er muligt at bede CRIMS om at udsende en fil, der er direkte kompatibel med FormulatorRobot (Formulatrix), automatisk at pipette skærmene ind i pladen eller at udsende et dokument, der kan udskrives, med diskenhederne til manuel betjening.
  9. Gentag gennem trin 1.2-1.8 for at udføre krystaloptimeringseksperimenter.
  10. Når krystaller, der er egnede til røntgen diffraktionseksperimenter, er identificeret, skal du navigere til pladen View-grænsefladen og vælge det billede, der svarer til den rigtige krystalliseringsdråbe. Forudindstillede scoringer hjælper dig med at gøre dette nemt.
    1. Klik enten på Crystal Harvesting for at registrere en automatiseret krystalhøstplan for CrystalDirect-mejetærskensrobotten eller på Manuel høst til traditionel manuel krystalmontering, hvis du bruger CRIMS på et anlæg, der ikke er udstyret med CrystalDirect. Begge grænseflader vil guide brugeren gennem krystal høst proces. CRIMS registrerer og opbevarer automatisk placeringen af høstede krystaller i enten SPINE eller Unipucks21.
  11. Vælg menuen Crystal Manager i CRIMS. Klik på undermenuen Høstede krystaller for at inspicere de frosne prøver. Når du bruger CrystalDirect-mejetærseren, præsenteres billeder af høstprocessen, herunder billeder af stifterne med de høstede krystaller.
  12. Vælg menuen Forsendelser for at oprette forbindelse til enten ESRF- eller Petra III-synkrotroner og oprette eksempelforsendelser til røntgen diffraktionsanalyse. Klik på knappen Opret forsendelse og vælg den synkrotron, du vil bruge, og posenummeret (taskeadgangskoden ved synkrotronen er nødvendig her). Den næste serie af grænseflader bruges til at vælge de pukcs, der skal medtages i forsendelsen. Systemet gør det muligt at give kommentarer til at understøtte dataindsamling og bestemme dataindsamlingsparametre for automatiserede beamlines som MASSIF-1.
  13. Hvis dataindsamlingen udføres på ESRF eller Petra III HTX lab, vil operatørerne overføre prøverne til beamline, dataindsamling på andre synkrotroner vil ske på brugerens egen regning. Det er muligt at indsamle data ved at rejse til synkrotronen, gennem fjernstråleoperation eller ved MASSIF-1. I sidstnævnte tilfælde er dataindsamlingsprocessen fuldautomatisk. Ved synkrotronen giver specifikke grænseflader i ISPyB29 brugerne mulighed for at gendanne de oplysninger, der sendes af CRIMS, og knytte prøve pucks til det, så resultaterne af dataindsamling automatisk spores. For de eksperimenter, der er beskrevet her, dataindsamling på synkrotroner blev typisk udført med MXcube31 software, mens databehandling og struktur raffinement blev udført med atuoPROC32, Staraninso33, BUSTER33, Pipedream32,33 og Coot35.
  14. Når dataindsamlingseksperimenter er udført, henter CRIMS sammenfattende oplysninger sammen med resultaterne af den indledende databehandling ved synkrotronen fra ISPyB29-systemet. Gå til menuen CRIMS Crystal Manager, og klik på undermenuen Crystal Diffraction Data. Alle oplysninger og metadata vedrørende dataindsamling af diffraktion er tilgængelige. Det er også muligt at downloade behandlede data fra synkrotronen samt rå diffraktionsbilleder. Få vist flere dataindsamlinger, eller vælg bestemte datasæt. Eksempelstyringsværktøjer gør det muligt at navigere og udvælge eksempler til bestemte projektkonstruktioner.
    BEMÆRK: Denne pipeline giver fuldautomatisk drift over internettet fra rent protein til røntgen diffraktion resultater og kan betjenes med en eller flere prøver på samme tid. Det kan anvendes til forskellige kontekst- og projekttyper i strukturel biologi.

Representative Results

Den automatiserede krystallografi pipeline beskrevet ovenfor er blevet anvendt til at støtte et stort antal interne og eksterne projekter med bemærkelsesværdig succes. Et par højdepunkter omfatter projektet fra Djinović-Carugo og kolleger fra Max Perutz Laboratories (Wien) med fokus på den strukturelle og funktionelle analyse af en dipeptidyl peptidase afgørende for væksten en bakteriel patogen. Den hurtige række af krystallisering screening, diffraktion evaluering, krystal optimering og X-ray dataindsamling cykler (op til 8 gentagelser for dette projekt) gjorde det muligt at opnå strukturelle modeller for tre forskellige kropsbygningstilstande af proteinet på blot et par uger, som gav centrale mekanistiske forståelse om funktionen af denne klasse af proteiner36 (se figur 1).

Et andet eksempel er fra Macias og kolleger fra Institute of Biomedical Research (IRB, Barcelona), der kombinerede bioinformatik værktøjer og strukturelle tilgange til at identificere nye DNA bindende motiver for SMAD3 og SMAD4 transskription faktorer, der er involveret i celle skæbne regulering. Dette arbejde har produceret 6 høj opløsning strukturer af SMAD3 & 4 i kompleks med forskellige DNA-bindende motiver37,38 afslører en hidtil upåagtet evne af disse transskription faktorer til at genkende og binde sig til en bred vifte af DNA-sekvenser, som er nøglen til fortolkningen af deres funktion i forskellige biologiske sammenhænge. Disse teknologier er også blevet anvendt til at støtte proprietær forskning i forbindelse med projekter vedrørende lægemiddeldesign fra forskningsgrupper i pharma- og biotekvirksomheder. F.eks. kan den strukturelle analyse af flere ligand-målkomplekser på grund af den hurtighed, som disse rørledninger har bidraget med, opnås inden for få dage, hvilket er af stor værdi for at støtte efterfølgende runder af medicinsk kemioptimering i forbindelse med lægemiddeludvikling. Endelig har vi også anvendt denne infrastruktur til storstilet røntgenbaseret fragmentscreening39.

Figure 1
Figur 1: Automatiseret krystallografirørledning. Integreret drift af EMBL HTX-laboratoriet, herunder CrystalDirect-teknologien og CRIMS-softwaren med MASSIF-1-beamline ved ESRF og automatiseret kommunikation mellem CRIMS- og ISPyB-softwaren, gør det muligt at understøtte fuldautomatisk, fjernstyret protein-til-struktur-rørledning, der integrerer krystalliseringsscreening og optimering, automatiseret krystalhøst og kryokøling og automatiseret dataindsamling og -behandling. De strukturelle modeller svarer til tre forskellige kropsbygningstilstande af en protease fra en patogen bakterie, der er identificeret på rekordtid ved at anvende disserørledning 36. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

De automatiserede krystallografirørledninger, der er beskrevet her, er tilgængelige for forskere over hele verden gennem forskellige finansieringsprogrammer. I øjeblikket kan finansieret adgang til krystalliseringseksperimenter og CrystalDirect-teknologien opnås ved at anvende iNEXT Discovery-programmet og INSTRUCT-ERIC, mens adgang til makromolekylær krystallografistrålelinjer ved ESRF understøttes gennem ESRF-brugeradgangsprogrammet. Denne tilgang minimerer forsinkelsen mellem krystalvækst og måling, fremskynder udviklingen af meget udfordrende projekter, der kræver diffraktionsbaseret optimering af proteinproduktion og krystalliseringsforhold og frigør forskere fra komplekse operationer forbundet med krystallisering, krystalhåndtering og stråleoperation, hvilket gør krystallografi mere tilgængelig for ikke-ekspertgrupper. Det kan også bruges til hurtig udforskning af krystallisering tilsætningsstoffer, udfasning agenter eller til sammensatte screening gennem co-krystallisering eksperimenter. Mens de fleste krystallografiprojekter potentielt kunne drage fordel af denne tilgang, kan nogle prøver kræve særlige protokoller, der ikke kan modtages for automatisering eller til de rørledninger, der præsenteres her, for eksempel dem, der kræver mikrofluidiske systemer eller højt specialiserede krystalliseringsenheder eller prøver, der er ekstremt labile og ikke ville tolerere forsendelse.

CrystalDirect-teknologien muliggør også automatiseret krystalblødning17 til karakterisering af små molekyle-målkomplekser. Til dette oprettes en lille blænde med laseren forud for høstprocessen, og en dråbe af en opløsning, der indeholder de ønskede kemikalier (dvs. indfasningsmidler eller potentielle ligands) tilsættes ovenpå, så den kommer i kontakt med og diffunderer ind i krystalliseringsopløsningen, der til sidst når krystallen. Kemiske opløsninger kan formuleres i vand, DMSO eller andre organiske opløsningsmidler. Efter en vis inkubationstid kan krystallerne høstes og analyseres ved diffraktion som beskrevet ovenfor. Denne tilgang er blevet anvendt til hurtig karakterisering af ligandproteinkomplekser i forbindelse med strukturbaseret lægemiddeldesign samt på storstilet blandings- og fragmentscreening. I sidstnævnte tilfælde kan fragmentbiblioteker med hundreder til over tusind fragmenter hurtigt analyseres. Specifikke CRIMS-grænseflader, der ikke præsenteres her, letter design og automatiseret sporing af krystalblødningseksperimenter, mens integration mellem CRIMS-softwaren og Pipedream-softwarepakken, der er udviklet af Global Phasing Ltd (Storbritannien), muliggør automatiseret databehandling, indfasning, ligandidentifikation og strukturforbedring over hundredvis af datasæt parallelt, strømliner dataanalyse og fortolkning32,33 . For eksempel blev denne rørledning for nylig anvendt til identifikation af fragmenter, der binder både til det aktive sted og flere allosteriske steder i Trypanosoma brucei farnesyl pyrophosphat synthase, et centralt enzym af parasitten, der forårsager human afrikansk trypanosomiasis.

De rørledninger, der præsenteres her, kan bidrage til at fremskynde opdagelseshastigheden i strukturel biologi og gøre makromolekylær krystallografi mere tilgængelig for et større antal forskningsgrupper. Ved at lette omfattende screening af forbindelser og fragment kan de desuden bidrage til at fremme translationel forskning og fremskynde narkotikaopdagelsesprocessen og bidrage til at lette udviklingen af bedre og sikrere lægemidler mod et større antal mål.

Disclosures

JAM er medforfatter til et patent på CrystalDirect-systemet

Acknowledgments

Vi vil gerne takke den fælles EMBL-ESRF Structural Biology Group (JSBG) for støtte til brug og drift af ESRF makromolekylære bjælkelinjer. Vi er taknemmelige for Matthew Bowler for støtte med dataindsamling på MASSIF-1 beamline af ESRF og Thomas Schneider og EMBL Hamburg Team for fremragende support med dataindsamling på P14 af PetraIII synkrotron (DESY, Hamburg, Tyskland). CrystalDirect-mejetærseren er udviklet i samarbejde med Instrumentation Team hos EMBL Grenoble. Dette projekt blev støttet af midler fra Det Europæiske FællesskabsH2020-program under projekterne iNEXT (Grant No 653706) og iNEXT Discovery (Grant No 871037) samt Région Auvergne-Rhône-Alpes gennem Booster-programmet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CrystalDirect harvester Arinax Automated crystal mounting and cryocooling
CrystalDirect Crystallization plate Mitegen SKU: M-XDIR-96-2 96-well crytsallization microplate
Formulator 16 Formulatrix For the autoamted preparation of crystallization screens
Mosquito crystallization Robot SPT Labtech For the preparation of crystallization experiments
Tecan Evo Liquid handling station Tecan For the preparation of crystallization solutions
Spine Pucks Mitegen SKU: M-SP-SC3-1 SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
UniPucks Mitegen SKU: M-CP-111-021 Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. Automation of X-ray crystallography. Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).
  2. Banci, L., et al. First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value. Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).
  3. Edwards, A. Large-scale structural biology of the human proteome. Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).
  4. Rupp, B., et al. The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density. Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).
  5. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  6. Cusack, S., et al. Small is beautiful: protein micro-crystallography. Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).
  7. McCarthy, A. A., et al. ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).
  8. Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  9. von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).
  10. Viola, R., et al. First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals. Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).
  11. Khajepour, M. Y. H., et al. REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).
  12. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69, 1297-1302 (2006).
  13. Collins, P. M. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).
  14. Deller, M. C., Rupp, B. Approaches to automated protein crystal harvesting. Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).
  15. Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).
  16. Márquez, J. A., Cipriani, F. CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films. Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).
  17. Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
  18. Cianci, M., et al. P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).
  19. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  20. iNEXT Consortium . iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  21. Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
  22. Whittle, P. J., Blundell, T. L. Protein Structure-Based drug design. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).
  23. Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. High-throughput crystallography for lead discovery in drug design. Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).
  24. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination. Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).
  25. Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay. Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).
  26. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  27. Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. Acta Crystallographica. F63, 204-208 (2007).
  28. Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines. , 060074 (2019).
  29. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  30. Ericsson, U., et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  31. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).
  32. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
  33. Smart, O. S., et al. Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).
  34. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  35. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).
  36. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  37. Martin-Malpartida, P., et al. Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors. Nature Communications. 8 (1), 2070 (2017).
  38. Aragón, E., et al. Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling. Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).
  39. Münzker, L., et al. Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase. ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).

Tags

Biokemi udgave 172
De automatiserede krystallografirørledninger på EMBL HTX-anlægget i Grenoble
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cornaciu, I., Bourgeas, R.,… More

Cornaciu, I., Bourgeas, R., Hoffmann, G., Dupeux, F., Humm, A. S., Mariaule, V., Pica, A., Clavel, D., Seroul, G., Murphy, P., Márquez, J. A. The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble. J. Vis. Exp. (172), e62491, doi:10.3791/62491 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter