Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

De automatiserte krystallografirørledningene ved EMBL HTX-anlegget i Grenoble

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62491
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 1, 1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2
1European Molecular Biology Laboratory, 2ALPX S.A.S., 3Institut de Biologie Structurale

Summary

Her beskriver vi hvordan du bruker de automatiserte makromolekylære krystallografirørledningene til protein-til-struktur, rask ligandproteinkompleksanalyse og storskala fragmentscreening basert på CrystalDirect-teknologien ved HTX Laboratory i EMBL Grenoble.

Abstract

EMBL Grenoble driver High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), et stort brukeranlegg som tilbyr krystallografitjenester med høy gjennomstrømning til brukere over hele verden. HTX-laboratoriet har et sterkt fokus på utvikling av nye metoder innen makromolekylær krystallografi. Gjennom kombinasjonen av en høy gjennomstrømningskrystalliseringsplattform har CrystalDirect-teknologien for helautomatisk krystallmontering og kryoisolering og CRIMS-programvaren vi har utviklet helautomatiske rørledninger for makromolekylær krystallografi som kan fjernstyres over internett. Disse inkluderer en protein-til-struktur rørledning for bestemmelse av nye strukturer, en rørledning for rask karakterisering av protein-ligand komplekser til støtte for medisinsk kjemi, og en storskala, automatisert fragmentscreening rørledning som muliggjør evaluering av biblioteker på over 1000 fragmenter. Her beskriver vi hvordan du får tilgang til og bruker disse ressursene.

Introduction

Automatisering har blitt introdusert i alle trinn i den makromolekylære krystallografi eksperimentelle prosessen, fra krystallisering til diffraksjonsdatainnsamling og prosessering1,2,3,4,5,6,7,8,9, inkludert en rekke teknologier for prøvemontering10,11,12 ,13,14,15,16,17. Dette har ikke bare akselerert tempoet som krystallografiske strukturer oppnås, men har bidratt til å strømlinjeforme applikasjoner som strukturstyrt legemiddeldesign18,19,20,21,22,23,24. I dette manuskriptet beskriver vi noen av aspektene ved de automatiserte krystallografirørledningene som er tilgjengelige på HTX-laboratoriet i Grenoble, samt de underliggende teknologiene.

HTX-laboratoriet ved EMBL Grenoble er et av de største akademiske anleggene for krystalliseringsscreening i Europa. Det er samlokalisert på European Photon and Neutron (EPN) campus sammen med European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), som produserer noen av verdens mest briljante røntgenstråler og Institut Laue Langevin (ILL), som gir høyfluks nøytron bjelker. Siden oppstarten i 2003 har HTX-laboratoriet levert tjenester til over 800 forskere og behandler mer enn 1000 prøver per år. HTX-laboratoriet har et sterkt fokus på utvikling av nye metoder innen makromolekylær krystallografi, inkludert metoder for prøveevaluering og kvalitetskontroll25,26 og CrystalDirect-teknologien, noe som muliggjør helautomatisk krystallmontering og prosessering15,16,17. HTX-laboratoriet har også utviklet Crystallographic Information Management System (CRIMS), et nettbasert laboratorieinformasjonssystem som gir automatisert kommunikasjon mellom krystallisering og synkrotron datainnsamlingsanlegg, noe som muliggjør uavbrutt informasjonsflyt over hele prøvesyklusen fra rent protein til diffraksjonsdata. Gjennom kombinasjonen av kapasiteten til HTX-anlegget, CrystalDirect-teknologien og CRIMS-programvaren har vi utviklet helautomatiske protein-til-struktur-rørledninger som integrerer krystalliseringsscreening, krystalloptimalisering, automatisert krystallhøstingsbehandling og kryooling og røntgendatainnsamling ved flere synkrotroner i en enkelt og kontinuerlig arbeidsflyt som kan betjenes eksternt gjennom en nettleser. Disse rørledningene kan brukes til å støtte rask bestemmelse av nye strukturer, karakterisering av protein-ligandkomplekser og storskala sammensatt og fragmentscreening gjennom røntgenkrystallografi.

HTX-laboratoriet er utstyrt med en ikke-volum krystalliseringsrobot (inkludert en LCP-modul som muliggjør krystallisering av både oppløselige og membranproteiner), krystall gårder (ved 5 °C og 20 °C), to robotiserte væskehåndteringsstasjoner for å forberede krystalliseringsskjermer og to automatiserte CrystalDirect-krystallhøstere med kapasitet til å produsere og lagre opptil 400 frosne prøvepinner per driftssyklus. Forskere sender sine prøver til anlegget med ekspresskurer, som deretter behandles av dedikerte teknikere på HTX-laboratoriet. Forskere kan eksternt designe krystalliseringsscreening og optimaliseringseksperimenter gjennom et webgrensesnitt levert av CRIMS-systemet. Gjennom dette grensesnittet kan de velge mellom et bredt spekter av parametere og eksperimentelle protokoller som er tilgjengelige på anlegget for å passe til deres spesifikke utvalgskrav. Resultater sammen med alle eksperimentelle parametere gjøres tilgjengelig for brukere i sanntid gjennom CRIMS. Alle mottatte prøver er analysert gjennom en spesielt utviklet metode som gjør det mulig å estimere krystalliseringssannsynligheten forprøven 25,26,27. Basert på resultatene av denne analysen er det gitt spesifikke anbefalinger til brukere om optimal inkubasjonstemperatur og mulige prøveoptimaliseringsforsøk. Når krystalliseringseksperimenter er satt opp, kan forskeren evaluere resultatene ved å se på krystalliseringsbilder samlet på forskjellige tidspunkter via nettet. Når krystaller som er egnet for røntgendiffraksjonseksperimenter identifiseres, kan forskere bruke et dedikert grensesnitt for å etablere en krystallmonteringsplan som deretter utføres av CrystalDirect-roboten.

CrystalDirect-teknologien er basert på bruk av en modifisert dampdiffusjonskrystallisasjonsmikroplate og en laserstråle for å montere og kryokjøle krystallprøver i diffraksjonskompatible støtter lukking av automatiseringsgapet som eksisterer mellom krystallisering og datainnsamling15,16,17. Kort sagt dyrkes krystaller i en modifisert dampdiffusjonsplate, CrystalDirect-mikroplaten. Når krystaller vises, bruker CrystalDirect-høstingsroboten automatisk en laserstråle for å skille ut et filmstykke som inneholder krystallen, feste den til en standard diffraction-datainnsamlingspinne og kryokjøle den i en nitrogengassstrøm (se Zander et al. 2016 og https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). Denne teknologien har en rekke ekstra fordeler i forhold til manuelle eller halvautomatiske krystallmonteringsprotokoller. For eksempel er krystallenes størrelse og form ikke et problem, noe som gjør det like enkelt å høste store krystaller eller mikrokrystaller, det er ofte mulig å unngå bruk av kryo-beskyttere, på grunn av den spesielle måten teknologien opererer på (se referanse 17, Zander et al.), noe som gjør røntgendiffraksjonsanalyse mye enklere. Laserstrålen kan også brukes som et kirurgisk verktøy for å velge de beste delene av en prøve når krystaller vokser på klynger eller viser epitoksial vekst for eksempel. CrystalDirect-teknologien kan også brukes til automatiserte bløtleggingsforsøk17. Levering av løsninger med små molekyler eller andre kjemikalier til krystaller. Dermed gjør det mulig å støtte helautomatisk, storskala sammensatt og fragmentscreening. Når krystaller høstes og kryoisoleres av CrystalDirect-roboten, overføres de til enten SPINE- eller Unipuck-pucker som er kompatible med de fleste synkrone makromolekylære krystallografistrålelinjer rundt om i verden. Systemet kan høste opptil 400 pinner (kapasiteten til den kryogene lagringen Dewar) på en helt autonom måte. CRIMS kommuniserer med innhøstingsroboten under prosessen og gir automatisert sporing av krystallprøver (pucker og pinner). Pucks er merket med både strekkoder og RFID-brikker for å lette prøvehåndtering21,28.

CRIMS tilbyr et API (Application Program Interface) som støtter automatisert kommunikasjon med ISPyB-systemet som støtter administrasjon og behandling av røntgendatainnsamling ved mange synkrotroner i Europa og verden29. Etter at automatisert krystallhøsting er fullført, kan forskere velge krystallprøver (pucks) og lage prøveforsendelser for de makromolekylære krystallografistrålene på enten ESRF (Grenoble, Frankrike)7,8,9 eller Petra III synkrotroner (Hamburg, Tyskland)18,19. CRIMS overfører dataene som tilsvarer de valgte strålelinjeprøvene, til synkrotroninformasjonssystemet sammen med forhåndsvalgte datainnsamlingsparametere. Når prøvene ankommer den valgte synkrotronstrålelinjen, utføres røntgendatainnsamling enten manuelt, gjennom fjernstrålelinjedrift eller på en helautomatisk måte (dvs. ved MASSIF-1-strålelinjen til ESRF8 som drives av den felles EMBL ESRF Joint Structural Biology Group (JSBG)). Etter datainnsamling henter CRIMS automatisk informasjon om resultatene av datainnsamling sammen med innledende databehandlingsresultater utført av synkrotrondatabehandlingssystemene og presenterer den for forskeren gjennom et praktisk brukergrensesnitt.

HTX-laboratoriet bruker disse automatiserte rørledningene for å støtte tre forskjellige applikasjoner, raske bestemmelser av nye strukturer, rask karakterisering av protein-ligandkomplekser og storskala sammensatt og fragmentscreening. Nedenfor beskriver vi hvordan du bruker og betjener dem.

Protocol

MERK: Finansiert tilgang til disse rørledningene for forskere over hele verden støttes gjennom en rekke finansieringsprogrammer. I skrivende stund aksepteres disse manuskriptsøknadene for tilgang gjennom enten iNEXT Discovery-programmet (https://inext-discovery.eu), et europeisk anleggsnettverk for å stimulere translasjonell strukturbiologi20 finansiert av Horisont 2020-programmet til Europakommisjonen eller INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/). Kontakt den tilsvarende forfatteren for gjeldende modaliteter og ruter for finansiert tilgang på et bestemt tidspunkt. Denne protokollen beskriver driften av rørledningen mellom protein og struktur og inkluderer trinn som er felles for alle rørledningene våre, mens spesifisiteter for de to andre rørledningene er omtalt i følgende avsnitt. Instruksjonene her henviser til CRIMS V4.0.

1. Krystalliseringslaboratorium med høy gjennomstrømning

  1. Før du starter, be om registrering på HTX-laboratoriet gjennom CRIMS-systemet https://htxlab.embl.fr/#/. Brukerlegitimasjonen gir ekstern tilgang til alle eksperimentelle utformings- og evalueringsgrensesnitt.
    1. Logg inn på CRIMS via en nettnavigasjon (Firefox, Chrome og Safari støttes). CRIMs webserver er kryptert for å forhindre tredjeparter i å få tilgang til data mens den reiser via nettet. En gang i CRIMS hjelper en rekke menyer til venstre for screeningen med å administrere og lage prøver, be om krystalliseringseksperimenter, administrere og visualisere plater, etc. En rekke videoopplæringer er tilgjengelige på https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d.
      MERK: Brukere som sender prøver med kurer, må registrere prøvene og de forespurte krystalliseringsforsøkene gjennom CRIMS før de sender prøven for å sikre at de kan behandles uten forsinkelse ved ankomst. Vennligst send forsendelsesdetaljene til htx@embl.fr.
  2. Logg inn på CRIMS (https://htxlab.embl.fr ) med en nettleser og klikk på Eksempler-menyen. Dette vil åpne et grensesnitt med prosjekt- og eksempelstyringsverktøy.
  3. Klikk på Nytt eksempel-knappen og oppgi den forespurte informasjonen. CRIMS gjør det mulig å organisere prøver under ulike prosjekter, mål og konstruksjoner. Tilordne eksemplet til eksisterende, eller opprett nye på dette tidspunktet.
  4. Når den forespurte informasjonen er angitt, klikker du Lagre og be om . Velg krystalliseringsprotokollen, krystalliseringsskjermene som skal brukes, inkubasjonstemperaturen og ønsket dato for forsøkene.
    1. Bruk kommentarfeltene til å gi indikasjoner på prøvene som er viktige for HTX-laboratorieoperatørene å vite. Egendefinerte skjermer kan også velges (se nedenfor). Etter å ha sendt inn krystalliseringsforespørselen vil den bli validert av HTX Lab Team og bekreftelse på planleggingen av forsøkene vil bli sendt via e-post. Sørg for å velge eksperimentdatoer som er kompatible med tidspunktene som kreves for eksempelforsendelse.
  5. Når prøvene kommer inn, vil anleggsoperatørene på HTX-laboratoriet utføre forsøkene etter ønske. Når krystalliseringseksperimenter er satt opp, vil bekreftelsen bli sendt via e-post og krystalliseringsbrett vil bli overført til de automatiserte imagerne. CRIMS gir tilgang til alle eksperimentelle parametere og vil automatisk spore nye bildebehandlingsøkter. E-postvarsler sendes automatisk når nye bilder er tilgjengelige. Et termofluorbasert30 prøvekvalitetsvurderingseksperiment basert på en protokoll utviklet ved innretningen25,26 utføres med hver prøve på dette tidspunktet og vil være tilgjengelig gjennom CRIMS.
  6. Bilder av krystalliseringseksperimentene sammen med resultatene av prøvekvalitetsvurderingen vil være tilgjengelige i CRIMS kort tid etter at krystalliseringsskuffene er satt opp. Klikk på Thermofluor-menyen og naviger til prøven for å se resultatene av prøvekvalitetsvurderingseksperimentet.
    1. Klikk på Plater-menyen for å se bildene fra Krystalliseringsplatene. Naviger til eksemplet, og klikk enten på Vis for å se den siste bildebehandlingsøkten eller på +-symbolet (utvid) for å velge en annen bildeøkt. En rekke verktøy hjelper deg med å finne og navigere enkelt gjennom eksemplene. Hvis du for eksempel klikker i en prosjektboks øverst på skjermbildene, filtreres eksempler for prosjektet, og søkefunksjonene er tilgjengelige for de fleste tabellkolonnene.
  7. Bruk platevisningsgrensesnittet til å evaluere og score resultatene av krystalliseringseksperimentene. Det tillater navigering gjennom de forskjellige brønnene på krystalliseringsplatene, velg bildetyper (dvs. Vis, UV), velg bildeoppløsning eller rekordresultater, for eksempel. Dette grensesnittet gir også alle eksperimentelle parametere som brukes til krystalliseringsforsøkene, inkludert sammensetningen av krystalliseringsløsningene.
  8. Klikk på Raffinement-menyen for å designe krystalloptimaliseringsskjermer basert på primære treffforhold identifisert gjennom den første screeningen. Undermenyene Kjemikalier og Lagerløsninger gjør det mulig for en å registrere og administrere krystalliseringslagerløsningene. Undermenyen Skjermer gir tilgang til et grensesnitt for å utforme din egen optimalisering eller egendefinerte skjermer.
    1. Velg platetype, lagerløsninger eller gradientkonfigurasjoner som passer best til eksperimentell design. Det er mulig å be CRIMS om å sende ut en fil som er direkte kompatibel med Formulator Robot (Formulatrix) for automatisk å pipette skjermene inn i platen eller å sende et utskrivbart dokument med volumene for manuell drift.
  9. Gå gjennom trinn 1.2-1.8 for å utføre krystalloptimaliseringseksperimenter.
  10. Når krystaller som er egnet for røntgendiffraksjonseksperimenter er identifisert, navigerer du til platevisningsgrensesnittet og velger bildet som tilsvarer høyre krystalliseringsfall. Forhånds lagrede poengsummer vil hjelpe deg med å gjøre dette enkelt.
    1. Klikk enten på Crystal Harvesting for å registrere en automatisert krystallhøstingsplan for CrystalDirect-innhøstingsroboten eller på Manuell høsting for tradisjonell manuell krystallmontering, hvis du bruker CRIMS på et anlegg som ikke er utstyrt med CrystalDirect. Begge grensesnittene vil lede brukeren gjennom krystallhøstingsprosessen. CRIMS vil automatisk registrere og lagre plasseringen av høstede krystaller i enten SPINE eller Unipucks21.
  11. Velg Crystal Manager-menyen i CRIMS. Klikk på undermenyen Høstede krystaller for å inspisere de frosne prøvene. Når du bruker CrystalDirect-innhøstingen, presenteres bilder av høstingsprosessen, inkludert bilder av pinnene med høstede krystaller.
  12. Velg Forsendelser-menyen for å koble til enten ESRF- eller Petra III-synkrotroner og opprette prøveforsendelser for røntgendiffraksjonsanalyse. Klikk på Opprett forsendelse-knappen og velg synkrotronen du vil bruke og posenummeret (posepassordet på synkrotronen er nødvendig her). Den neste serien av grensesnitt brukes til å velge pukcs som skal inkluderes i forsendelsen. Systemet gjør det mulig å gi kommentarer for å støtte datainnsamling og bestemme datainnsamlingsparametere for automatiserte strålelinjer som MASSIF-1.
  13. Hvis datainnsamlingen utføres på ESRF eller Petra III HTX lab, vil operatørene overføre prøvene til strålelinjen, datainnsamling på andre synkrotroner vil bli gjort for brukerens egen regning. Det er mulig å samle inn data ved å reise til synkrotronen, gjennom fjernstrålelinjedrift eller ved MASSIF-1. I sistnevnte tilfelle er datainnsamlingsprosessen helautomatisk. Ved synkrotronen tillater spesifikke grensesnitt i ISPyB29 brukere å gjenopprette informasjonen som sendes av CRIMS og knytte eksempelpucker til den slik at resultatene av datainnsamlingen spores automatisk. For forsøkene som er beskrevet her, ble datainnsamling på synkrotroner vanligvis utført med MXcube31-programvaren, mens databehandling og strukturforbedring ble utført med atuoPROC32, Staraninso33, BUSTER33, Pipedream32,33 og Coot35.
  14. Når datainnsamlingseksperimenter er utført, henter CRIMS sammendragsinformasjon sammen med resultater av innledende databehandling ved synkrotronen fra ISPyB29-systemet. Gå til CRIMS Crystal Manager-menyen og klikk på Undermenyen Crystal Diffraction Data. All informasjon og metadata om innsamling av diffraksjonsdata er tilgjengelig. Det er også mulig å laste ned behandlede data fra synkrotronen så vel som rå diffraksjonsbilder. Vis flere datainnsamlinger, eller velg bestemte datasett. Eksempelbehandlingsverktøy gjør det mulig å navigere og velge prøver for bestemte prosjektkonstruksjoner.
    MERK: Denne rørledningen gir helautomatisk drift over internett fra rent protein til røntgendiffraksjonsresultater og kan betjenes med en eller flere prøver samtidig. Det kan anvendes på ulike kontekst- og prosjekttyper i strukturbiologi.

Representative Results

Den automatiserte krystallografirørledningen beskrevet ovenfor er brukt til å støtte et stort antall interne og eksterne prosjekter med bemerkelsesverdig suksess. Noen få høydepunkter inkluderer prosjektet fra Djinović-Carugo og medarbeidere fra Max Perutz Laboratories (Wien) med fokus på strukturell og funksjonell analyse av en dipeptidylpeptidase som er avgjørende for veksten et bakteriellt patogen. Den raske rekken av krystalliseringsscreening, diffraksjonsevaluering, krystalloptimalisering og innsamlingssykluser for røntgendata (opptil 8 gjentakelser for dette prosjektet) gjorde det mulig å oppnå strukturelle modeller for tre forskjellige konformasjonstilstander av proteinet på bare noen få uker, noe som ga viktig mekanistisk forståelse av funksjonen til denne klassen proteiner36 (se figur 1).

Et annet eksempel er fra Macias og medarbeidere fra Institute of Biomedical Research (IRB, Barcelona) som kombinerte bioinformatikkverktøy og strukturelle tilnærminger for å identifisere nye DNA-bindende motiver for SMAD3- og SMAD4-transkripsjonsfaktorene involvert i celle skjebneregulering. Dette arbeidet har produsert 6 høyoppløselige strukturer av SMAD3 &4 i kompleks med forskjellige DNA-bindende motiver37,38 som avslører en så langt intetanende kapasitet av disse transkripsjonsfaktorene til å gjenkjenne og binde seg til et mangfoldig utvalg av DNA-sekvenser, som er nøkkelen til tolkningen av deres funksjon i forskjellige biologiske sammenhenger. Disse teknologiene er også anvendt for å støtte proprietær forskning i sammenheng med narkotikadesignprosjekter fra forskningsgrupper i farmasøytiske og bioteknologiske selskaper. For eksempel, takket være hurtigheten som disse rørledningene bidro med, kan den strukturelle analysen av flere ligandmålkomplekser oppnås i løpet av dager, noe som er av stor verdi for å støtte påfølgende runder medisinsk kjemioptimalisering i sammenheng med narkotikautvikling. Endelig har vi også brukt denne infrastrukturen for storskala røntgenbasert fragmentscreening39.

Figure 1
Figur 1: Automatisert krystallografirørledning. Integrert drift av EMBL HTX-laboratoriet, inkludert CrystalDirect-teknologien og CRIMS-programvaren med MASSIF-1-strålelinjen ved ESRF og automatisert kommunikasjon mellom CRIMS- og ISPyB-programvaren, gjør det mulig å støtte helautomatisk, fjernstyrt protein-til-struktur-rørledning som integrerer krystalliseringsscreening og optimalisering, automatisert krystallhøsting og kryokjøling og automatisert datainnsamling og prosessering. De strukturelle modellene tilsvarer tre forskjellige konformasjonstilstander av en protease fra en patogen bakterie identifisert på rekordtid ved å bruke disserørledningene 36. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

De automatiserte krystallografirørledningene som er beskrevet her, er tilgjengelige for forskere over hele verden gjennom forskjellige finansieringsprogrammer. For tiden kan finansiert tilgang for krystalliseringseksperimenter og CrystalDirect-teknologien oppnås ved å søke på iNEXT Discovery-programmet og INSTRUCT-ERIC, mens tilgang til makromolekylære krystallografistråler på ESRF støttes gjennom ESRF-brukertilgangsprogrammet. Denne tilnærmingen minimerer forsinkelsen mellom krystallvekst og måling, akselererer progresjonen av svært utfordrende prosjekter som krever diffraksjonsbasert optimalisering av proteinproduksjon og krystalliseringsforhold og frigjør forskere fra komplekse operasjoner forbundet med krystallisering, krystallhåndtering og strålelinjedrift, noe som gjør krystallografi mer tilgjengelig for ikke-ekspertgrupper. Den kan også brukes til rask utforskning av krystalliseringstilsetningsstoffer, fasingsmidler eller for sammensatt screening gjennom kokrystalliseringseksperimenter. Selv om de fleste krystallografiprosjekter potensielt kan dra nytte av denne tilnærmingen, kan noen prøver kreve spesielle protokoller som ikke kan brukes til automatisering eller rørledninger som presenteres her, for eksempel de som krever mikrofluidiske systemer eller høyt spesialiserte krystalliseringsenheter eller prøver som er ekstremt labile og ikke vil tolerere forsendelse.

CrystalDirect-teknologien muliggjør også automatisert krystall-soaking17 for karakterisering av små molekylmålkomplekser. For dette opprettes en liten blenderåpning med laseren før høstingsprosessen og en dråpe av en løsning som inneholder de ønskede kjemikaliene (dvs. fasingmidler eller potensielle ligander) tilsettes på toppen, slik at den kommer i kontakt med, og diffuserer inn i krystalliseringsløsningen som til slutt når krystallen. Kjemiske løsninger kan formuleres i vann, DMSO eller andre organiske løsningsmidler. Etter en viss inkubasjonstid kan krystallene høstes og analyseres ved diffraksjon som beskrevet ovenfor. Denne tilnærmingen har blitt brukt på rask karakterisering av ligandproteinkomplekser i sammenheng med strukturbasert legemiddeldesign samt til storskala sammensatt og fragmentscreening. I sistnevnte tilfelle kan fragmentbiblioteker med hundrevis til over tusen fragmenter raskt analyseres. Spesifikke CRIMS-grensesnitt som ikke presenteres her, letter design og automatisert sporing av krystall-soaking-eksperimenter, mens integrasjon mellom CRIMS-programvaren og Pipedream-programvarepakken, utviklet av Global Phasing Ltd (Storbritannia) muliggjør automatisert databehandling, fasing, ligandidentifikasjon og strukturforbedring over hundrevis av datasett parallelt, effektiviserer dataanalyse og tolkning32,33 . For eksempel ble denne rørledningen nylig brukt på identifisering av fragmenter som binder seg både til det aktive stedet og flere allosteriske steder i Trypanosoma brucei farnesyl pyrofosfatsyntase, et viktig enzym av parasitten som forårsaker menneskelig afrikansk trypanosomiasis.

Rørledningene som presenteres her kan bidra til å akselerere oppdagelsestakten i strukturbiologien og gjøre makromolekylær krystallografi mer tilgjengelig for et større antall forskningsgrupper. Ved å legge til rette for storskala sammensatt og fragmentscreening kan de dessuten bidra til å fremme translasjonell forskning og fremskynde prosessen med narkotikaoppdagelse, noe som bidrar til å lette utviklingen av bedre og tryggere stoffer mot et større antall mål.

Disclosures

JAM er medforfatter av et patent på CrystalDirect-systemet

Acknowledgments

Vi vil takke den felles EMBL-ESRF Structural Biology Group (JSBG) for støtte i bruk og drift av ESRF makromolekylære bjelker. Vi er takknemlige til Matthew Bowler for støtte med datainnsamling på MASSIF-1-strålelinjen til ESRF og Thomas Schneider og EMBL Hamburg Team for utmerket støtte med datainnsamling på P14 av PetraIII synchrotron (DESY, Hamburg, Tyskland). CrystalDirect-innhøstingen er utviklet i samarbeid med Instrumentation Team ved EMBL Grenoble. Dette prosjektet ble støttet av midler fra European CommunityH2020 Program under prosjektene iNEXT (Grant No 653706) og iNEXT Discovery (Grant No 871037) samt Région Auvergne-Rhône-Alpes gjennom Booster-programmet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CrystalDirect harvester Arinax Automated crystal mounting and cryocooling
CrystalDirect Crystallization plate Mitegen SKU: M-XDIR-96-2 96-well crytsallization microplate
Formulator 16 Formulatrix For the autoamted preparation of crystallization screens
Mosquito crystallization Robot SPT Labtech For the preparation of crystallization experiments
Tecan Evo Liquid handling station Tecan For the preparation of crystallization solutions
Spine Pucks Mitegen SKU: M-SP-SC3-1 SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
UniPucks Mitegen SKU: M-CP-111-021 Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. Automation of X-ray crystallography. Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).
  2. Banci, L., et al. First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value. Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).
  3. Edwards, A. Large-scale structural biology of the human proteome. Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).
  4. Rupp, B., et al. The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density. Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).
  5. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  6. Cusack, S., et al. Small is beautiful: protein micro-crystallography. Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).
  7. McCarthy, A. A., et al. ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).
  8. Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  9. von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).
  10. Viola, R., et al. First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals. Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).
  11. Khajepour, M. Y. H., et al. REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).
  12. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69, 1297-1302 (2006).
  13. Collins, P. M. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).
  14. Deller, M. C., Rupp, B. Approaches to automated protein crystal harvesting. Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).
  15. Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).
  16. Márquez, J. A., Cipriani, F. CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films. Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).
  17. Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
  18. Cianci, M., et al. P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).
  19. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  20. iNEXT Consortium . iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  21. Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
  22. Whittle, P. J., Blundell, T. L. Protein Structure-Based drug design. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).
  23. Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. High-throughput crystallography for lead discovery in drug design. Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).
  24. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination. Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).
  25. Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay. Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).
  26. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  27. Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. Acta Crystallographica. F63, 204-208 (2007).
  28. Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines. , 060074 (2019).
  29. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  30. Ericsson, U., et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  31. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).
  32. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
  33. Smart, O. S., et al. Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).
  34. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  35. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).
  36. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  37. Martin-Malpartida, P., et al. Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors. Nature Communications. 8 (1), 2070 (2017).
  38. Aragón, E., et al. Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling. Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).
  39. Münzker, L., et al. Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase. ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).

Tags

Biokjemi utgave 172
De automatiserte krystallografirørledningene ved EMBL HTX-anlegget i Grenoble
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cornaciu, I., Bourgeas, R.,… More

Cornaciu, I., Bourgeas, R., Hoffmann, G., Dupeux, F., Humm, A. S., Mariaule, V., Pica, A., Clavel, D., Seroul, G., Murphy, P., Márquez, J. A. The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble. J. Vis. Exp. (172), e62491, doi:10.3791/62491 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter