Summary
这里描述的是一种确定HIV-1限制程度的既定方法，由细胞抑制蛋白SAMHD1。人髓系U937细胞用共表达YFP的SAMHD1表达载体转导，分化，然后用HIV-RFP攻击。限制水平由流式细胞术分析确定。
Abstract
无菌α-基序/组氨酸天冬氨酸结构域含蛋白 1 （SAMHD1） 抑制静止髓系细胞中 HIV-1 的复制。由于SAMHD1 RNA表达水平低，U937细胞被广泛用作分析SAMHD1活性的便捷细胞系统，导致内源性蛋白表达检测不到。基于Stoye实验室开发的用于表征其他逆转录病毒限制因子的类似测定，Bishop实验室开发了一种双色限制性测定法来分析U937细胞中的SAMHD1。小鼠白血病 表达SAMHD1的病毒样颗粒以及从IRES表达的YFP用于转导U937细胞。然后用醋酸佛波肉豆蔻酸酯处理细胞，以诱导分化为静止表型。分化后，细胞感染表达荧光报告基因的HIV-1病毒样颗粒。48小时后，收获细胞并通过流式细胞术进行分析。将表达SAMHD1的群体中HIV感染细胞的比例与缺乏SAMHD1的内部对照细胞的比例进行比较。这种比较揭示了一个限制比率。SAMHD1表达导致HIV感染减少五倍，对应于0.2的限制比。我们最近用RFP代替原始GFP作为HIV感染的报告基因，促进了流式细胞术分析。
该测定已成功用于表征氨基酸取代对SAMHD1限制的影响，方法是通过转导编码改变的SAMHD1蛋白的病毒，这些蛋白来源于表达载体的定点诱变。例如，催化位点取代物HD206-7AA显示出限制性表型为1，表明限制性活性的丧失。同样，可以确定不同测试病毒的易感性。该测定可以进一步适应结合分化状态、代谢状态和 SAMHD1 修饰剂的影响，以更好地了解 SAMHD1、细胞代谢状态和病毒限制之间的关系。
Introduction
无菌α-基序/组氨酸-天冬氨酸结构域含蛋白 1 （SAMHD1） 可阻止人类免疫缺陷病毒 1 型 （HIV-1） 在髓系静止细胞中的复制。SAMHD1通过其作为dNTP三磷酸水解酶的酶活性阻断复制，这导致细胞内dNTP水平降低。因此，HIV-1不能有效地执行逆转录过程。自初步观察以来的几年中已经取得了很大进展，特别是在特定结构域和氨基酸对SAMHD1抗病毒活性的贡献方面。这些见解是使用生化测定以及模拟生理相关静止髓系环境的细胞系统得出的。U937细胞1 被广泛用作分析SAMHD1活性的便捷骨髓细胞系统。这是由于缺乏内源性SAMHD1表达，被认为是由于与表达SAMHD1的细胞相比RNA水平低（正在进行的研究领域）。在这里，该协议描述了U937细胞与共表达SAMHD1的病毒样颗粒和黄色荧光蛋白（YFP）报告基因的瞬时转导，以检查SAMHD1限制HIV-1的机制。这种用于检查逆转录病毒限制的瞬时双色流式细胞术测定首先在Stoye实验室2 中开发，此后已被调整用于研究其他限制因子，包括三方基序（TRIM）蛋白3。受这些测定的启发，Bishop实验室开发了一种双色测定法来分析U937细胞中的SAMHD1限制。
实验的工作流程如图 1 所示。小鼠白血病病毒（MLV）样颗粒含有编码SAMHD1的双顺反子信息以及从IRES表达的YFP用于转导U937细胞。然后用醋酸佛波醇肉豆蔻酸酯（PMA）处理细胞，以诱导分化为静止表型。细胞接下来感染表达红色荧光蛋白（RFP）的HIV-1病毒样颗粒。48小时后，收获细胞并通过双色流式细胞术进行分析。该测定法还与YFP和绿色荧光蛋白（GFP）一起使用，流式细胞术分析所需的标准过滤器组合较少。使用HIV-RFP可以实现更直接的补偿，因此经验不足的流式细胞术用户更容易获得该测定，并且大多数流式细胞仪都可以实现。
在分析过程中，在同一细胞孔中，在表达SAMHD1的细胞和缺乏SAMHD1的细胞之间比较HIV感染细胞的比例。这为孔/流式细胞术管提供了内部控制，这是一个关键特征。转导细胞和未转导细胞中感染水平的比较揭示了限制性比。比率为1.0表示转导因子对感染性没有影响。在该测定中，野生型SAMHD1表达导致HIV感染减少五倍，对应于0.2的限制性比。虽然与更经典的限制性因子（如TRIM5）相比，这种效应是适度的，但这种效应仍然是可重复的，并允许将修饰的SAMHD1表达子分类为那些以等效方式限制野生型蛋白的表达子，那些不能限制的表达子，以及那些具有中间表型的表达子。
该测定已成功用于通过与编码突变体SAMHD1序列的病毒转导来表征SAMHD1结构域和氨基酸突变体的限制性表型。例如，催化位点取代HD206-7AA在该测定中无法限制。同样，可以确定不同测试病毒的易感性。例如，HIV-1逆转录酶突变体更容易受到SAMHD1介导的限制（例如，151V4）。该协议概述了病毒样颗粒（VLP）产生，使用SAMHD1表达载体转导U937，携带荧光报告基因的HIV感染以及随后通过流式细胞术进行分析的详细信息。本文讨论预期哪些数据以及如何避免次优结果。最后，除了检查不同的SAMHD1变体以更彻底地了解SAMHD1，dNTP水平和病毒感染之间的相互作用外，还概述了该测定的替代用途。鉴于SAMHD1在细胞代谢中心的作用，以及与癌症的其他联系，这仍然是一个引起强烈兴趣的领域。
Protocol
该协议不包含任何作者进行的涉及动物或人类参与者的研究。该协议的所有步骤均按照执行它们的机构的准则和业务守则执行。
1. 转染 293T 细胞用于 VLP 生产（SAMHD1 表达载体和测试仪 HIV 颗粒）
注意：成功生产病毒颗粒的最重要因素是生产者293T细胞的健康，转染时的汇合度和收获时间。实验室通常会有他们首选的转染试剂和逆转录病毒颗粒生产的方案。以下方案产生高质量的传染性颗粒，但等效的方案也适用于此应用。为了保持良好的质量293T细胞，每周至少传代三次以保持恒定的生长速度。应在生长的对数期接种细胞，以实现高效转染。
- 第 1 天：接种所需数量的 10 cm 培养皿，从接近汇合的 293T 细胞培养皿中分离 1/4，以在第二天产生约 60% 的汇合度（约 5 x 105 个细胞/mL）。在使用新细胞原液时，可能需要接种几种密度，以达到适当的密度，以便在第二天进行转染。
- 第 2 天（早晨）：通过显微镜检查约 60% 的汇合度，并用 10 mL 新鲜的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 轻轻替换细胞上的培养基。
- 第 2 天（下午，更换培养基后至少 4 小时）：转染用于 VLP 生产。
- 在 600 μL 无血清 DMEM 中补足含有 3 μg gag-pol 表达质粒、长末端重复 （LTR） 驱动的报告质粒和水疱性口炎病毒 G 蛋白 （VSV-G） 表达质粒（总计 9 μg，参见注释）的 DNA 稀释混合物。涡旋并短暂离心（15秒，>500 x g ）。
- 加入20μL转染试剂（参见 材料表），涡旋（不要离心）并在20°C孵育15-20分钟。将转染混合物滴加到平板中，轻轻旋转混合，然后返回培养箱。
注意：对于表达SAMHD1的MLV VLP，请使用KB45，6 （gag-pol 表达质粒），pLGatewaySAMHD1IeYFP1 （LTR驱动的报告质粒）和pczVSV-G7。对于 HIV-RFP VLP，使用 p8.918，9 （gag-pol 表达质粒）、SCRPSY10 （LTR 驱动的报告质粒）和 pczVSV-G。 替代品在材料表中讨论。可能需要针对不同的质粒/转染系统优化质粒比例。
- 第 3 天（上午晚些时候）：通过移液小心地从细胞中取出培养基，用 5 mL 新鲜 DMEM 洗涤，并用 5 mL 新鲜 DMEM 替换。
- 第4天（早晨）：通过从细胞中收集上清液来收获病毒，并用5mL新鲜DMEM替换。将含VLP的上清液通过0.45nm过滤器，等分试样并转移到-70°C储存。确保等分试样的大小适合计划的实验（建议为 250 μL），因为重复冻融循环会导致病毒滴度损失。
- 第5天（早晨）：像1.5一样收获病毒，但在收集上清液后丢弃平板。
2. 使用前滴定新的 VLP
- 第 1 天：在 24 孔板的每孔 2 x 105 个细胞下接种 293T - 每个要滴定的病毒 4 个孔，包括每个骨架具有已知感染性的病毒。优化给定细胞原液的接种密度。
- 第 2 天：观察板以检查汇合度（理想情况下~70%）。解冻步骤1.5和1.6中的含病毒上清液。向每个孔中加入 0、10、25 或 100 μL。
- 第4天（上午）：收获细胞通过流式细胞术进行分析。
- 通过小心移液或抽吸取出培养基。用 250 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 轻轻洗涤细胞。用 250 μL PBS 上下移液，从板中取出细胞，然后转移到微量离心管中。加入 250 μL 4% 多聚甲醛（使终浓度为 2%）。
注意：多聚甲醛有毒。不应与氯基消毒剂混合。 - 通过以 500 x g 离心 5 分钟来沉淀细胞，弃去上清液并将细胞沉淀重悬于 200 μL PBS 或替代流式细胞术缓冲液中。通过流式细胞术酌情分析RFP或YFP。根据已知传染性储备的值规范化给定病毒储备的感染性。
注意：VLP 也可以通过 p24 酶联免疫吸附测定 （ELISA） 进行标准化;然而，这不一定是VLP感染性的良好指标，特别是在不同转染中制备VLP储液的情况下。已公布的中位组织培养感染剂量或感染多重性 （TCID50/MOI） 方法11 也可以提供相对定量，尽管这些方法尚未很好地确定 MLV。相对荧光为商业逆转录酶ELISA方法提供了一种经济高效的替代方案。
- 通过小心移液或抽吸取出培养基。用 250 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 轻轻洗涤细胞。用 250 μL PBS 上下移液，从板中取出细胞，然后转移到微量离心管中。加入 250 μL 4% 多聚甲醛（使终浓度为 2%）。
3. U937与表达SAMHD1和YFP的VLP的转导
注意：步骤3-6构成限制性实验。为了便于计划，日期已编号。
- 第1天（下午）：解冻VLP进行转导，包括MLV-野生型SAMHD1-YFP（阳性对照），MLV-SAMHD1（HD206-7AA）-YFP（阴性对照）和变体MLV-SAMHD1-YFP（实验样品）。在微量离心管中用罗斯威尔公园纪念研究所 1640 培养基 （RPMI） 将标准化的 VLP 稀释至 500 μL 的最终体积，加入 0.5 μL 聚溴乙烯 （10 mg/mL），然后轻弹混合。
- 如果无法事先滴定VLP，则首先使用100 μL。使用 VLP 与 RPMI 的最大 1：1 比率来限制 VLP 诱导的毒性。目标是大约 30% 的转导率。
- 将5 x 105 U937细胞等分到无菌微量离心管中，用于每种转导条件。通过以500× g 离心5分钟沉淀，并除去上清液（包括两个额外的管作为流式细胞术的未转导对照）。将细胞沉淀重悬于 500 μL 稀释的 VLP（或未转导对照的 RPMI）中，并转移到 24 孔板的一个孔中。
- 在台式离心机中以800× g 在20°C下旋转90分钟。 向孔中加入1mL的37°C RPMI，并在37°C培养箱中回收3天。
4. 转导U937的分化
- 第 4 天（早晨）：轻轻移液重新悬浮细胞，并将 350 μL 转移到 12 孔板的 4 个孔中的每一个中。向每个孔中加入 700 μL 含有 150 nM PMA 的 37 °C RPMI，最终浓度为 100 nM，并允许分化 3 天。
注意：PMA以粉末形式购买，应在DMSO中重悬至1 mM并储存在黑暗中。应通过用DMSO从1mM储备液中稀释1/10来制备100μM的工作储备液。
5.分化，表达SAMHD1的U937感染HIV-RFP
- 第7天：通过显微镜观察细胞。确保细胞贴壁。从所有孔中吸出培养基，向每组 4 个孔中的 1 个孔中加入 1 mL RPMI，允许未转导、未感染的对照以及单色对照。将含有大约 10 μL HIV-1-RFP（大约 10 ng p24 作为指南）的 0.5 mL RPMI 重新添加到所有其他孔中。目标是大约 50% 的感染。
- 第 8 天（早晨）：向每个感染孔中加入 0.5 mL RPMI。
6. 流式细胞术分析
注意：最好在流式细胞术管道中使用活死染色剂。但是，如果U937细胞质量良好，则可以省略此步骤，而不会对下游分析产生负面影响。对胰蛋白酶消化的细胞进行轻柔移液应容易产生单细胞悬液。
- 第10天（早上）：从孔中吸出培养基并用PBS洗涤一次。加入 300 μL 细胞解离酶（或胰蛋白酶）5-10 分钟。再加入 300 μL PBS，彻底重悬以确保所有细胞都已从平板上脱落，然后转移到流式细胞术管中。
- 加入 300 μL 4% 多聚甲醛（使终浓度达到 2%）。通过以 500 x g 离心 5 分钟来沉淀细胞，弃去上清液并将细胞沉淀重悬于 200 μL PBS 或替代流式细胞术缓冲液中。通过流式细胞术分析。
注意：以下步骤适用于Fortessa分析仪，但可以使用任何能够读取RFP和YFP荧光的分析仪进行等效分析。在设置任何流式细胞术分析之前，请咨询当地流式细胞术支持或其他经验丰富的研究人员。当需要同时筛选多个样品时，高通量采样器可能是合适的。在这种情况下，建议使用更大的细胞数量和体积。
7. 流式细胞术分析
- 在需要前10分钟打开细胞仪并打开计算机。检查废物是否为空，护套罐是否已满。
- 登录机器并打开分析软件。
- 将手臂移到一边，取下水管，将流速设置为 高 ，然后按 Prime。等待灯熄灭，再重复三次。
- 重新打开水并在高处运行 3 分钟，然后切换到 低 并按 待机 ，直到继续采集。
- 同时在软件中设置实验：
- 选择 “实验/新建实验 ”（根据本地指南命名）。在检查器中，删除不需要的荧光染料，保留蓝色激光 530/30 和黄色激光 610/20 或机器推荐的 YFP 和 RFP 激光和滤光片组合。
- 右键单击实验并选择 细胞仪设置/应用程序设置/创建工作表。在工作表上，通过单击相应的图标并通过单击轴标签更改轴来更改轴，创建前向散射区域 （FSC-A）/侧散射区域 （FSC-A） 点印迹和 YFP 直方图、RFP 直方图和 GFP/YFP 点印迹。
- 再次右键单击 实验 并添加新 标本。根据需要重命名。通过单击加号打开标本以显示新管。
- 从 View 打开采集仪表板，加载未感染、未转导的控件，然后按 采集。调整仪表板中的 FSC 和 SSC 电压，以将单元格定位在左下象限（轴上没有单元格）。此种群 P1 周围的门。右键单击其他图并选择显示 P1 以从后续分析中去除碎片。
- 加载 YFP（仅限野生型 SAMHD1）的单色对照并采集。在仪表板中调整YFP电压，使大多数荧光细胞都在检测器的范围内（不在轴的边缘）。对单色 RFP 控件重复此操作。
- 使用未转导、未感染和单色对照运行自动补偿。
- 从菜单中选择“ 实验>补偿设置”>“创建补偿控件 ”以切换到普通工作表。选择未染色的普通工作表，按“ 运行” 并获取未染色的对照。
- 在完整单元格（P1）周围画一个门并记录。取下管子并将机器置于 待机状态。右键单击 P1，单击 应用于所有补偿控件。
- 切换到 RFP 普通工作表，然后按 运行。记录单色 RFP 控件，并将机器置于 待机状态。 软件应自动选择阳性总体。
- 对 YFP 单色控制重复此操作。选择 实验>补偿设置>计算补偿>链接并保存。
- 切换到全局工作表。获取用野生型SAMHD1转导的细胞，感染HIV-RFP，并检查在象限的角落中可以看到四个不同的群体，这些群体分别垂直和水平排列YFP和RFP。取下管子并按 待机。
- 重新加载未转导、未感染的样本，按 运行 并 记录 30，000 个事件，P1 作为停止门。对其余样本（包括其他对照）重复此操作。在运行时或 事后重命名示例。导出后，无法重命名文件。
- 将数据导出为 .fcs 文件，并根据当地说明清洁流体。
8. 数据分析
注意：以下步骤对应于 FlowJo v10 中的分析;但是，可以在其他分析软件中轻松执行等效步骤。
- 打开软件并将所有 .fcs 文件拖到仪表板中。选择补偿控件并将其拖到补偿子文件夹中。双击打开未转导、未感染管的文件，这将调出 FSC-A/SSC-A 图。
- 选择面工具并在完整像元群上浇口，排除左下角的碎片。命名此单元格。将此门拖动到 “所有样本” 栏中的整个管群上。使用水平箭头按钮滚动浏览每个单独的样品，以确保门控适用于每个试管。
- 双击未转导、未感染样品的 细胞 群，并将轴调整为 FSC 高度 （H） 与 FSC 面积 （A）。使用矩形门选择单个大种群以排除双峰。该软件将自动建议命名此单个单元格。
- 将此门拖到所有 细胞 群上，然后再次检查门控是否适用于所有样品。为未感染、未转导的样品选择 单细胞 群，将轴更改为补偿蓝色激光（y ，YFP）与补偿黄色激光（x， RFP）。按轴上的 T 并为 x 和 y 选择 双指数 刻度。
- 选择象限设门工具，然后单击阴性细胞群的右上角极值。通过拖动到“所有样本”栏中，将此初步门控应用于所有单细胞群体。如果象限门不能令人满意地分离种群，则可能需要使用面工具对各个象限进行门控，如图 2 所示。
- 滚动到仅野生型SAMHD1样本（仅限YFP），并检查未转化（YFP阴性）和YFP阳性之间的门控是否正确。切换到轮廓视图以区分阴性和昏暗的YFP细胞可能会有所帮助。如果最上层的 YFP +ve 细胞分布广泛，请将上部垂直门调整到右侧。
- 滚动浏览所有样本并检查有关 YFP 阳性的门控。使用对所有样本都有效的YFP阴性和阳性之间的最佳划分。
注意：补偿将根据野生型SAMHD1 YFP表达水平计算。如果不同SAMHD1-YFP转导细胞之间的感染水平差异很大，则可能需要调整补偿。因此，优选在使用前对YFP VLP进行标准化。 - 滚动到未转导的HIV-RFP感染管，并检查未感染的RFP阴性和受感染的RFP阳性之间的门控是否正确。根据需要使用轮廓视图进行适当调整，并滚动浏览其余样品以检查门控是否对所有样品有效。
- 每个样本都需要双阴性（Q4：左下角，未转导，未感染），YFP阳性（Q1：左上角，SAMHD1表达，未感染），RFP阳性（Q3：右下，未转导，HIV感染）和双阳性（Q2：右上，SAMHD1表达HIV感染）。通过单击图标打开表格编辑器，然后将四个象限门拖到仪表板中。选择“ Excel 导出 ”，然后单击“ 创建表”。根据本地文件命名约定保存生成的电子表格。
- 要导出绘图和门控策略的表示，请单击 布局编辑器 图标。选择每个人口，然后拖动到编辑器中，其中包含所需的轴、标签和间距。
- 要创建具有所有样品显示的相同图的布局，请选择一列并按 Batch。按 “缩放到宽度” ，然后 避免使用分页符。以所需的文件格式保存。
- 在导出的电子表格中，通过生成 YFP-ves 的百分比 RFP （RFP+ve / （双负 + RFP+ve）） 和 YFP+ves 的百分比 RFP （双正 / （双正 + YFP+ve））和最后一列（YFP+ve 的 %RFP / YFP-ve 的 %RFP）来计算限制比率，请参见 图 1。使用适当的数据分析软件平均每个SAMHD1构建体的重复数据，并计算测试SAMHD1变体的限制值是否与野生型和/或206-7AA显着不同。
Representative Results
上述分析结果应为野生型SAMHD1阳性对照组提供0.25或更低的限制比，阴性对照组的限制比应为1.0。如果这两个质量控制检查有效，则考虑结果的统计显著性。因此，与野生型没有显着差异的SAMHD1变体携带的替换不会影响SAMHD1限制。那些与野生类型明显不同的类型显示出受损的限制。如果这些与阴性对照没有显着差异，那么它们在这种情况下缺乏限制能力（图4左图 ）。
如果野生型 SAMHD1 限制值大于 0.3，则测试病毒的结果可能具有指示性，但不能依赖。野生型蛋白的无效限制可能是由于在重建后过早地使用U937细胞（2周内）或当它们太老（>2-3个月）所致。对于给定的细胞储备，可能需要根据经验确定这些参数。通常，传代越低，细胞分化越可靠，因此为SAMHD1限制提供适当的环境。SAMHD1-YFP或HIV-RFP的不适当感染水平也可能导致补偿和下游限制比确定的困难。 图 4 的右侧面板中显示了一个示例。
如果阴性对照偏离1.0（超出0.9-1.2的范围），这可能表明分析存在问题，感染细胞的比例，门控策略或细胞的健康状况正在影响测定。请参阅上面的注释。
图 1：概述协议的示意图。 VLP，病毒样颗粒，PMA，佛波肉豆蔻酸酯乙酸酯。编号的阶段对应于协议中的阶段。使用 BioRender.com 制作的图。 请点击此处查看此图的大图。
图2：逆转录病毒质粒示意图 。 （A） 包装载体 （B） 转移载体 （C） VSV-G 包膜表达器。显示了关键编码和监管元素。有关详细信息，请参阅 材料表。巨细胞病毒IE：巨细胞病毒即时早期启动子，BGH：牛生长激素，pA：polyA，RRE：Rev反应元件，CMV-LTR：复合CMV-HIV-1 LTR启动子，Psi：HIV-1包装信号，cPPT/CTS：中央聚嘌呤束/中枢终止序列，SV40：猿猴空泡病毒40。使用 BioRender.com 制作的图。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：流式细胞术分析的设门策略。 （A）补偿对照：左图显示未转导、未感染对照的轻触细胞上的FSC-A/SSC-A门控。中间和右侧面板显示了YFP（中）和RFP（右）的单色补偿控件的屏幕截图，其中未补偿数据为黑色，补偿为蓝色。（B）上述补偿控制的相应补偿矩阵和绘图。（C）门控策略。通过FSC-A/SSC-A（左图）分析所有细胞来消除碎片。通过FSC高度与面积（中央图）的浇口排除双峰。右图显示了野生型SAMHD1限制HIV-1的示例。轴显示分别对应于YFP（SAMHD1）和RFP（HIV）阳性细胞的补偿蓝色和黄色激光荧光。通过比较 RFP 和 YFP 的负色和单色对照来绘制象限门。数字表示父母人口的百分比。带有GFP的YFP的补偿值会高得多，但可以使用适当的过滤器组进行区分。请点击此处查看此图的大图。
图4：预期结果：理想数据与次优数据。 （A）最佳（左）和次优（右）数据的代表性YFP / RFP图。数字表示父母人口的百分比。在右图中，艾滋病毒感染率太低，导致补偿和门控困难。限制比高于预期，为0.5。（B）SAMHD1变体相对于野生型（WT，红色）或使用统计软件生成的阴性对照（HD206-7AA，黑色）的限制比图。每个点代表一个仿行值。显示平均值和标准偏差。每组之间的配对t检验在所有情况下都是显着的。左：理想数据 - WT 显示预期限制约为 0.2，负值显示 1.0。变体R372D（灰色）与WT显着不同，但与阴性对照不显着，因此失去了限制能力。右：次优数据。在这里，阴性表现符合预期，但在所有六个重复中，由于感染率低，WT仅显示0.5的限制比。组内的低方差意味着R143H显示出与WT统计学上不同的中间表型和阴性，而G209S没有限制;然而，应用新鲜细胞重复此操作，因为阳性对照没有给出预期的限制比。请点击此处查看此图的大图。
Discussion
如上述注释所述，该方案的关键方面集中在保留用于VLP生产的正确细胞表型以及为观察SAMHD1限制创建适当的环境。首先，双色流式细胞术对限制性限制性物质的准确分析依赖于实现适当比例的转导和感染细胞，以便在图的每个区域中有足够的细胞进行分析。因此，研究人员的目标MOI应小于1（见 协议）。转导率和感染率过高或过低会导致分析问题，因为缺乏未感染或双重感染的细胞。同样，要比较的SAMHD1载体的相似转导速率是允许将相同的补偿基质和门控应用于整个实验的关键，从而增加了后续分析的信心。
其次，所用U937细胞的年龄是它们是否成功分化的关键因素。可以通过观察依从性、分化后培养基酸化随时间减少以及测定中野生型阳性对照的充分限制来监测成功的分化。长达 5 天的分化已经成功。
该测定的主要优点之一是其灵活性。SAMHD1的各种修饰版本（结构域，氨基酸，物种序列）可以通过载体的简单定点诱变或克隆进行测试。同样，可以探索测试病毒的变种。该测定先前已用于证明结合dNTP能力降低的HIV-1逆转录酶突变体对SAMHD1限制更敏感。相同的原理可用于测试SAMHD1对其他病毒的限制。此外，不同的分化条件或人工操纵细胞内dNTP浓度可用于进一步探测细胞内条件与SAMHD1活性之间的相互作用，这是Bishop实验室积极研究的领域。还描述了SAMHD1与各种核苷逆转录酶抑制剂的相互作用，并且使用该测定修饰用于原代细胞12，13，14，15的SAMHD1的作用显示。
调整方案以用于原代细胞克服了检查转化细胞中代谢表型所带来的限制。然而，现有形式为高通量分析提供了一种方便且技术挑战性较小的方案，特别是使用带有高通量进样器的流式细胞仪。在调整方案时，应考虑内部未转导细胞对旁观者效应（例如免疫信号传导）的敏感性。
与细胞生物学的许多方面一样，必须将此类测定用作理解给定现象的整体方法的一部分。并行使用SAMHD1活性16的生化测定，细胞内dNTP池的定量，以及观察人类， 离体 和动物模型中的SAMHD1突变表型（由世界各地的实验室进行，其中一些在本期中描述）是不断发展理解这种复杂蛋白质的关键。
Disclosures
出于开放获取的目的，作者已将CC BY公共版权许可应用于由此提交产生的任何作者接受的手稿版本。所表达的观点是作者的观点，不一定是NIHR或卫生和社会护理部的观点。
Acknowledgments
这项工作得到了弗朗西斯·克里克研究所的支持，该研究所的核心资金来自英国癌症研究中心（FC001042和FC001162），英国医学研究委员会（FC001042和FC001162）和威康信托基金（FC001042和FC001162）以及JPS的威康信托研究员奖（108012 / Z / 15 / Z）。剑桥大学的工作由NIHR剑桥生物医学研究中心，伊夫林信托基金（16/21），玫瑰树信托基金（M590）和英国医学研究委员会（MR / S009752 / 1）共同资助。后者由英国资助，是欧盟支持的EDCTP2计划的一部分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
| 10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance |
| 12 well plates | Greiner | 665180 | |
| 24 well plates | Greiner | 662160 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
| DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
| DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Flowjo | BD Bioscience | - | alternative analysis software can be used |
| light microscope | - | - | Any bright field light microscope |
| p8.91 | - | - | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
| paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
| polybrene | Sigma | TR-1003 | |
| pKB4 | - | - | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
| pLGatewaySAMHD1eYFP | - | - | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
| pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
- | - | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
| Prism | Graphpad | - | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
| pVSV-G | - | - | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
| RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
| screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
| SCRPSY | - | - | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/ |
| stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
| stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
| TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
| Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
| U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |
References
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- Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).
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