Summary
Beskrevet her er en etablert metode for å bestemme omfanget av HIV-1-begrensning av det cellulære hemmende proteinet SAMHD1. Humane myeloide avstamning U937-celler transduseres med en SAMHD1-ekspresjonsvektor som uttrykker YFP, differensiert og deretter utfordret med HIV-RFP. Restriksjonsnivået bestemmes ved analyse av flowcytometri.
Abstract
Sterilt α-motiv/histidin-aspartat-domeneholdig protein 1 (SAMHD1) hemmer replikasjon av HIV-1 i hvilende myeloide celler. U937-celler er mye brukt som et praktisk cellesystem for å analysere SAMHD1-aktivitet på grunn av et lavt nivå av SAMHD1 RNA-uttrykk, noe som fører til uoppdagelig endogent proteinuttrykk. Basert på lignende analyser utviklet i Stoye-laboratoriet for å karakterisere andre retrovirale restriksjonsfaktorer, utviklet Bishop-laboratoriet en tofarget begrensningsanalyse for å analysere SAMHD1 i U937-celler. Murine leukemiviruslignende partikler som uttrykker SAMHD1, sammen med YFP uttrykt fra en IRES, brukes til å transdusere U937-celler. Celler blir deretter behandlet med phorbol myristatacetat for å indusere differensiering til en hvilende fenotype. Etter differensiering er celler infisert med HIV-1 viruslignende partikler som uttrykker en fluorescerende reporter. Etter 48 timer høstes celler og analyseres ved flowcytometri. Andelen HIV-infiserte celler i SAMHD1-uttrykkende populasjon sammenlignes med andelen i interne kontrollceller som mangler SAMHD1. Denne sammenligningen avslører et begrensningsforhold. SAMHD1-ekspresjon fører til en femdobling av HIV-infeksjon, tilsvarende et restriksjonsforhold på 0,2. Vår nylige substitusjon av RFP for den opprinnelige GFP som reportergen for HIV-infeksjon har gjort det lettere å analysere flowcytometri.
Denne analysen har blitt brukt til å karakterisere effekten av aminosyresubstitusjoner på SAMHD1-begrensning ved å transdusere med virus som koder for endrede SAMHD1-proteiner, avledet fra stedrettet mutagenese av ekspresjonsvektoren. For eksempel viser de katalytiske stedssubstitusjonene HD206-7AA en restriksjonsfenotype på 1, noe som indikerer tap av restriksjonsaktivitet. På samme måte kan følsomheten til forskjellige testervirus bestemmes. Analysen kan tilpasses ytterligere for å inkorporere effekten av differensieringsstatus, metabolsk status og SAMHD1-modifikatorer for bedre å forstå forholdet mellom SAMHD1, cellemetabolsk tilstand og virusrestriksjon.
Introduction
Sterilt α-motiv/histidin-aspartatdomeneholdig protein 1 (SAMHD1) hindrer replikasjon av humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) i hvilende celler av myeloid avstamning. SAMHD1 blokkerer replikasjon gjennom sin enzymatiske aktivitet som en dNTP-trifosfohydrolase, noe som resulterer i reduserte nivåer av intracellulære dNTP-er. Som et resultat kan HIV-1 ikke utføre prosessen med revers transkripsjon effektivt. Mye fremgang har blitt gjort i de få årene siden denne første observasjonen, spesielt når det gjelder bidrag fra spesifikke domener og aminosyrer til SAMHD1s antivirale aktivitet. Disse innsiktene er gjort ved hjelp av biokjemiske analyser samt cellesystemer som etterligner det fysiologisk relevante hvilende myeloide miljøet. U937-celler1 er mye brukt som et praktisk myeloid cellesystem for å analysere SAMHD1-aktivitet. Dette skyldes mangel på endogent SAMHD1-uttrykk, antatt å skyldes lave RNA-nivåer sammenlignet med SAMHD1-uttrykkende celler (et område med pågående forskning). Her beskriver protokollen forbigående transduksjon av U937-celler med viruslignende partikler som uttrykker SAMHD1 og en gul fluorescerende protein (YFP) reporter for å undersøke mekanismen for SAMHD1-begrensning av HIV-1. Slike forbigående tofargede flowcytometrianalyser for å undersøke retrovirale restriksjoner ble først utviklet i Stoye-laboratoriet2 og har siden blitt tilpasset for å undersøke andre restriksjonsfaktorer, inkludert trepartsmotivet (TRIM) proteiner3. Inspirert av disse analysene utviklet Bishop-laboratoriet en tofarget analyse for å analysere SAMHD1-begrensning i U937-celler.
Arbeidsflyten for eksperimentet er vist i figur 1. Murine leukemivirus (MLV)-lignende partikler som inneholder en bi-cistronisk meldingskoding SAMHD1 sammen med YFP uttrykt fra en IRES, brukes til å transdusere U937-celler. Celler blir deretter behandlet med phorbol myristatacetat (PMA) for å indusere differensiering til en hvilende fenotype. Celler er neste infisert med HIV-1 viruslignende partikler som uttrykker rødt fluorescerende protein (RFP). Etter 48 timer høstes cellene og analyseres ved tofarget flowcytometri. Denne analysen brukes også med YFP og grønt fluorescerende protein (GFP), som krever mindre standard filterkombinasjoner for flowcytometrianalyse. Bruk av HIV-RFP gir enklere kompensasjon, og analysen er dermed lettere tilgjengelig for mindre erfarne flowcytometribrukere, og kan oppnås med de fleste cytometre.
Under analysen sammenlignes andelen HIV-infiserte celler mellom SAMHD1-uttrykkende celler og de som mangler SAMHD1 innenfor samme brønn av celler. Dette gir en intern kontroll i brønn/flowcytometri tube, som er en nøkkelfunksjon. Sammenligningen av infeksjonsnivåer i transducerte og utransduserte celler avslører et restriksjonsforhold. Et forhold på 1,0 indikerer at den transduserte faktoren ikke har noen effekt på smittsomhet. Wild type SAMHD1-uttrykk fører til en fem ganger reduksjon i HIV-infeksjon i denne analysen, tilsvarende et restriksjonsforhold på 0,2. Selv om denne effekten er beskjeden i forhold til mer klassiske restriksjonsfaktorer som TRIM5, er effekten likevel reproduserbar og tillater klassifisering av modifiserte SAMHD1-ekspretorer til de som begrenser på samme måte som villtypeproteinet, de som ikke klarer å begrense, og de med en mellomliggende fenotype.
Denne analysen har blitt brukt med hell for å karakterisere SAMHD1-domene og aminosyremutanters restriksjonsfenotyper ved å transdusere med virus som koder for mutante SAMHD1-sekvenser. For eksempel klarer ikke de katalytiske stedssubstitusjonene HD206-7AA å begrense i denne analysen. På samme måte kan følsomheten til forskjellige testervirus bestemmes. For eksempel er HIV-1 reverstranskriptasemutanter mer utsatt for SAMHD1-mediert begrensning (f.eks. 151V4). Denne protokollen skisserer detaljene for viruslignende partikkel (VLP) produksjon, transduksjon av U937 med SAMHD1-ekspresjonsvektorer, infeksjon med HIV som bærer en fluorescerende reporter og den påfølgende analysen ved flowcytometri. Denne artikkelen beskriver hvilke data du kan forvente og hvordan du unngår suboptimale resultater. Til slutt skisseres alternative bruksområder for analysen, i tillegg til å undersøke forskjellige SAMHD1-varianter for å forstå samspillet mellom SAMHD1, dNTP-nivåer og virusinfeksjon grundigere. Gitt rollen som SAMHD1 i sentrum av cellemetabolismen, med flere koblinger til kreft, fortsetter dette å være et område av intens interesse.
Protocol
Denne protokollen inneholder ingen studier som involverer dyr eller mennesker utført av noen av forfatterne. Alle trinnene i denne protokollen ble utført i henhold til retningslinjene og retningslinjene for institusjonene der de ble utført.
1. Transfeksjon av 293T-celler for VLP-produksjon (både SAMHD1-ekspresjonsvektorer og tester HIV-partikler)
MERK: De viktigste bidragsyterne til vellykket produksjon av viruspartikler er helsen til produsenten 293T-celler, sammenløp ved transfeksjon og tidspunkt for høsting. Laboratorier vil typisk ha sine foretrukne transfeksjonsreagenser og protokoll for retroviral partikkelproduksjon. Følgende protokoll gir smittsomme partikler av god kvalitet, men tilsvarende protokoller vil også være egnet for denne applikasjonen. For å opprettholde 293T-celler av god kvalitet, passasje minst tre ganger i uken for å opprettholde en konstant vekstrate. Celler skal sås i loggfasen av vekst for effektiv transfeksjon.
- Dag 1: Frø det nødvendige antall 10 cm retter med en 1/4 splitt fra en nesten sammenflytende tallerken med 293T-celler for å gi rundt 60% sammenløp dagen etter (ca. 5 x 105 celler / ml). Flere tettheter må kanskje sås for å oppnå en passende tetthet for transfeksjon dagen etter når du arbeider med en ny cellemasse.
- Dag 2 (morgen): Kontroller ca. 60 % konfluens ved mikroskopi og erstatt media forsiktig på celler med 10 ml fersk Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
- Dag 2 (ettermiddag, minst 4 timer etter mediebytte): Transfekt for VLP-produksjon.
- Utgjør DNA-fortynningsblandingen som inneholder 3 μg hver av gag-pol ekspresorplasmid, Long-terminal repeat (LTR)-drevet reporterplasmid og Vesicular Stomatitis Virus G-protein (VSV-G ) ekspresorplasmid (totalt 9 μg, se NOTE) i 600 μL serumfri DMEM. Vortex og sentrifuge kort (15 s, >500 x g).
- Tilsett 20 μL transfeksjonsreagens (se materialtabell), virvel (ikke sentrifuge) og inkuber ved 20 °C i 15-20 min. Tilsett transfeksjonsblandingen dråpevis på platen, virvle forsiktig for å blande og gå tilbake til inkubatoren.
MERK: For MLV VLP som uttrykker SAMHD1, bruk KB4 5,6 (gag-pol expressor plasmid), pLGatewaySAMHD1IeYFP1 (LTR-drevet reporter plasmid) og pczVSV-G7. For HIV-RFP VLP, bruk p8.91 8,9 (gag-pol expressor plasmid), SCRPSY10 (LTR-drevet reporter plasmid) og pczVSV-G. Alternativer er diskutert i materialtabellen. Plasmidforhold må kanskje optimaliseres for forskjellige plasmid / transfeksjonssystemer.
- Dag 3 (sen morgen): Fjern mediet forsiktig fra cellene ved pipettering, vask med 5 ml fersk DMEM og erstatt med 5 ml fersk DMEM.
- Dag 4 (morgen): Høst viruset ved å samle supernatanten fra cellene og erstatt med 5 ml fersk DMEM. Pass den VLP-holdige supernatanten gjennom et 0,45 nm filter, aliquot og overfør til -70 ° C for lagring. Sørg for at aliquotene er av en størrelse som er egnet for planlagte eksperimenter (250 μL som et forslag), da gjentatte fryse-tine-sykluser vil resultere i tap av viral titer.
- Dag 5 (morgen): Høst viruset som i 1,5, men kast platene etter å ha samlet supernatanten.
2. Titrering av ny VLP før bruk
- Dag 1: Frø 293T ved 2 x 105 celler per brønn av en 24-brønns plate - 4 brønner per virus som skal titreres, inkludert et virus med kjent smittsomhet for hver ryggrad. Optimaliser såtettheten for en gitt cellemasse.
- Dag 2: Vær oppmerksom på platen for å sjekke sammenløp (ideelt ~ 70%). Tine virus-inneholdende-supernatant fra trinn 1.5 og 1.6. Tilsett 0, 10, 25 eller 100 μL til hver brønn.
- Dag 4 (morgen): Høst cellene for analyse ved flowcytometri.
- Fjern mediet ved forsiktig pipettering eller aspirasjon. Vask cellene forsiktig med 250 μL fosfatbufret saltvann (PBS). Fjern cellene fra platen ved pipettering opp og ned med 250 μL PBS, og overfør til et mikrosentrifugerør. Tilsett 250 μL 4% paraformaldehyd (ta endelig konsentrasjon til 2%).
FORSIKTIG: Paraformaldehyd er giftig. Det bør ikke blandes med klorbaserte desinfeksjonsmidler. - Pellet cellene ved sentrifugering ved 500 x g i 5 minutter, kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 200 μL PBS eller alternativ flowcytometribuffer. Analyser for RFP eller YFP etter behov ved flowcytometri. Normaliser smittsomheten til en gitt virusbestand mot verdier for en bestand av kjent smittsomhet.
MERK: VLP kan også normaliseres ved p24 enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA); Dette er imidlertid ikke nødvendigvis en god indikator på VLP-smittsomhet, spesielt der VLP-lagre fremstilles i forskjellige transfeksjoner. Publisert median vevskultur infeksiøs dose eller infeksjonsmangfold (TCID50/MOI) metoder11 kan også gi relativ kvantifisering, selv om disse ikke er godt etablert for MLV. Relativ fluorescens gir et kostnadseffektivt alternativ til kommersielle revers transkriptase ELISA-metoder.
- Fjern mediet ved forsiktig pipettering eller aspirasjon. Vask cellene forsiktig med 250 μL fosfatbufret saltvann (PBS). Fjern cellene fra platen ved pipettering opp og ned med 250 μL PBS, og overfør til et mikrosentrifugerør. Tilsett 250 μL 4% paraformaldehyd (ta endelig konsentrasjon til 2%).
3. Transduksjon av U937 med VLP som uttrykker SAMHD1 og YFP
MERK: Trinn 3-6 utgjør begrensningseksperimentet. Dagene er nummerert for enkel planlegging.
- Dag 1 (ettermiddag): Tine VLP for transduksjon inkludert MLV-Wild-type SAMHD1-YFP (positiv kontroll), MLV-SAMHD1(HD206-7AA)-YFP (negativ kontroll) og variant MLV-SAMHD1-YFP (eksperimentelle prøver). Fortynn den normaliserte VLP til et endelig volum på 500 μL med Roswell Park Memorial Institute 1640 media (RPMI) i et mikrofugerør, tilsett 0,5 μL polybren (10 mg / ml), og bland ved å bla.
- Hvis VLP ikke kan titreres på forhånd, bruk 100 μL i første omgang. Bruk et maksimalt 1:1-forhold mellom VLP og RPMI for å begrense VLP-indusert toksisitet. Sikt på ca 30% transduksjon.
- Aliquot 5 x 105 U937-celler i et sterilt mikrofugerør for hver transduksjonstilstand. Pellet ved sentrifugering ved 500 x g i 5 minutter, og fjern supernatanten (inkluder ytterligere to rør som utransduserte kontroller for flowcytometri). Resuspender cellepelleten i 500 μL fortynnet VLP (eller RPMI for utransduserte kontroller) og overfør til en brønn i en 24-brønns plate.
- Spinokulere i en bordplatesentrifuge ved 800 x g i 90 minutter ved 20 °C. Tilsett 1 ml 37 ° C RPMI til brønnen og la den komme seg i en 37 ° C inkubator i 3 dager.
4. Differensiering av transducert U937
- Dag 4 (morgen): Re-suspendere cellene ved forsiktig pipettering og overføre 350 μL inn i hver av 4 brønner av en 12-brønns plate. Tilsett 700 μL 37 °C RPMI inneholdende 150 nM PMA til hver brønn, noe som gir en endelig konsentrasjon på 100 nM og la den differensiere i 3 dager.
MERK: PMA kjøpes som et pulver og skal resuspenderes til 1 mM i DMSO og lagres i mørket. Et arbeidslager på 100 μM bør fremstilles ved å fortynne 1/10 fra 1 mM-lageret med DMSO.
5. Infeksjon av differensiert, SAMHD1-uttrykkende U937 med HIV-RFP
- Dag 7: Observer cellene ved mikroskopi. Kontroller at cellene er festet. Aspirer media fra alle brønnene, legg til 1 ml RPMI til brønn 1 av hvert sett med 4, noe som gir uoversatt, uinfisert kontroll samt enkeltfargekontroller. Legg tilbake 0,5 ml RPMI som inneholder omtrent 10 μL HIV-1-RFP (ca. 10 ng p24 som en guide) til alle de andre brønnene. Sikt på ca 50% infeksjon.
- Dag 8 (morgen): Tilsett 0,5 ml RPMI til hver av de infiserte brønnene.
6. Analyse av flowcytometri
MERK: Det er god praksis å inkludere en levende død flekk i flowcytometri-rørledninger. Men hvis U937-cellene er av god kvalitet, kan dette trinnet utelates uten negative konsekvenser for nedstrømsanalyse. Skånsom pipettering av trypsiniserte celler skal lett resultere i en enkeltcellesuspensjon.
- Dag 10 (morgen): Aspirer media fra brønnene og vask en gang med PBS. Tilsett 300 μL celledissosiasjonsenzym (eller trypsin) i 5-10 min. Tilsett ytterligere 300 μL PBS, resuspender grundig og sørg for at alle cellene har kommet av platen, og overfør til flowcytometrirør.
- Tilsett 300 μL 4% paraformaldehyd (ta endelig konsentrasjon til 2%). Pellet cellene ved sentrifugering ved 500 x g i 5 minutter, kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 200 μL PBS eller alternativ flowcytometribuffer. Analyser ved flowcytometri.
MERK: Trinnene nedenfor er for en Fortessa-analysator, men ekvivalent analyse kan oppnås ved hjelp av en hvilken som helst analysator som kan lese RFP- og YFP-fluorescens. Rådfør deg med lokal flowcytometristøtte eller annen erfaren forsker før du setter opp noen flowcytometrianalyse. Når mange prøver må screenes samtidig, kan en prøvetaker med høy gjennomstrømning være hensiktsmessig. I dette tilfellet anbefales et større cellenummer og volum.
7. Analyse av flowcytometri
- Slå på cytometeret 10 minutter før det kreves, og slå på datamaskinen. Sjekk at avfallet er tomt og at skjedetanken er full.
- Logg inn på maskinen og åpne analyseprogramvaren.
- Flytt armen til siden, ta av vannrøret, sett strømningshastigheten til høy og trykk prime. Vent til lyset slukkes og gjenta tre ganger til.
- Sett vannet på igjen og kjør på høyt i 3 minutter, og bytt deretter til Lav og trykk standby til du fortsetter til oppkjøpet.
- I mellomtiden satt opp eksperimentet i programvaren:
- Velg Eksperiment / Nytt eksperiment (navn i henhold til lokal veiledning). I inspektøren sletter du de unødvendige fluorokromene, og etterlater blå laser 530/30 og gul laser 610/20 eller de anbefalte laser- og filterkombinasjonene for YFP og RFP for maskinen.
- Høyreklikk på eksperimentet og velg Cytometerinnstillinger / Applikasjonsinnstillinger / Opprett regneark. I regnearket oppretter du punktblotet og YFP-histogrammet YFP-histogram, RFP-histogram og GFP/YFP-punktblot i regnearket ved å klikke på det tilsvarende ikonet og endre aksene ved å klikke akseetiketten.
- Høyreklikk igjen på Eksperiment og legg til Nytt eksemplar. Gi nytt navn etter behov. Åpne prøven ved å klikke på plusstegnet for å avsløre et nytt rør.
- Åpne instrumentbordet for innhenting fra Vis, last inn den ikke-infiserte, uoverførte kontrollen og trykk Hent. Juster FSC- og SSC-spenninger på dashbordet for å plassere celler i nedre venstre kvadrant (ingen celler på aksene). Gate rundt denne befolkningen P1. Høyreklikk på andre tomter og velg vis P1 for å fjerne rusk fra påfølgende analyse.
- Last inn enfargekontrollen for YFP (kun wild-type SAMHD1) og skaff deg. Juster YFP-spenningen i dashbordet slik at de mest fluorescerende cellene er innenfor detektorens rekkevidde (ikke på kanten av aksen). Gjenta for RFP-kontroll med én farge.
- Kjør automatisk kompensasjon ved hjelp av kontrollene uoversatt, uinfisert og ensfarget.
- Velg Eksperiment > kompensasjonsoppsett > Opprett kompensasjonskontroller på menyen for å veksle til et vanlig regneark. Velg unstained normal regneark, trykk på Kjør og hent for unstained kontrollen.
- Tegn en port rundt de intakte cellene (P1) og registrer. Fjern røret og sett maskinen i ventemodus. Høyreklikk på P1, klikk på Bruk på alle kompensasjonskontroller.
- Bytt til det vanlige RFP-regnearket, og trykk Kjør. Ta opp RFP-kontrollen med én farge, og sett maskinen i ventemodus. Programvaren skal automatisk velge den positive befolkningen.
- Gjenta for YFP enkeltfargekontroll. Velg Eksperiment > kompensasjonsoppsett > beregne kompensasjon > koble til og lagre.
- Bytte til det globale regnearket. Oppnå cellene transducert med vill type SAMHD1, infisert med HIV-RFP og kontroller at fire forskjellige populasjoner kan ses i hjørnene av kvadrantene som er justert vertikalt og horisontalt for henholdsvis YFP og RFP. Fjern slangen og trykk på Standby.
- Last inn den uoverførte, uinfiserte prøven på nytt , trykk Kjør og Registrer 30 000 hendelser med P1 som stoppeport. Gjenta for de resterende prøvene (inkludert andre kontroller). Gi nytt navn til eksemplene mens du kjører eller post hoc. Når filene er eksportert, kan de ikke gis nytt navn.
- Eksporter dataene som .fcs-filer og rengjør fluidikken i henhold til lokale instruksjoner.
8. Dataanalyse
MERK: Trinnene som følger tilsvarer analysen i FlowJo v10; Tilsvarende trinn kan imidlertid enkelt utføres i annen analyseprogramvare.
- Åpne programvaren og dra alle .fcs-filer inn i dashbordet. Velg kompensasjonskontrollene, og dra dem til kompensasjonsundermappen. Åpne filen for det uovertrufektede, uinfiserte røret ved å dobbeltklikke, som vil få opp FSC-A/SSC-A-plottet.
- Velg polygonverktøyet og porten på den intakte cellepopulasjonen, unntatt rusk i nedre venstre hjørne. Gi navn til disse cellene. Dra denne porten til hele rørpopulasjonen på Alle prøver-linjen . Bla gjennom hver enkelt prøve ved hjelp av de horisontale pilknappene for å sikre at gating passer for hvert rør.
- Dobbeltklikk på cellepopulasjonen for den uoversatte, uinfiserte prøven og juster aksene til FSC-høyde (H) vs FSC-område (A). Velg den store enkeltpopulasjonen ved hjelp av en rektangulær port for å utelate dubletter. Programvaren vil automatisk foreslå å navngi denne Single Cells.
- Dra denne porten til alle cellepopulasjonene , og kontroller igjen at gatingen passer for alle prøver. Velg enkeltcellepopulasjonen for den uinfiserte, uoverførte prøven, endre aksene til kompensert blå laser (y , YFP) kontra kompensert gul laser (x, RFP). Trykk T på aksen, og velg Bieksponensiell skala for x og y.
- Velg Quadrant Gating Tool og klikk øverst til høyre i den negative cellepopulasjonen. Bruk denne foreløpige gating på alle enkeltcellepopulasjoner ved å dra inn i Alle prøver-linjen . Dersom kvadrantportene ikke separerer populasjonene tilfredsstillende, kan det være nødvendig å sperre enkeltkvadranter ved hjelp av polygonverktøyet, som i figur 2.
- Bla til wild-type SAMHD1 only-prøven (bare YFP), og kontroller at gating mellom de utransduserte (YFP-negative) og YFP-positive er riktige. Det kan hjelpe å bytte til konturvisning for å diskriminere negativt fra svake YFP-celler. Hvis de øverste YFP + ve-cellene er spredt mye, justerer du den øvre vertikale porten til høyre.
- Bla gjennom alle prøvene og sjekk gating med hensyn til YFP-positivitet. Bruk det beste skillet mellom YFP-negativ og positiv som er gyldig for alle prøver.
MERK: Kompensasjonen vil ha blitt beregnet basert på wild-type SAMHD1 YFP-uttrykksnivået. Hvis infeksjonsnivåene er svært forskjellige mellom forskjellige SAMHD1-YFP-transducerte celler, kan kompensasjonen måtte justeres. Det er derfor foretrukket at YFP VLP normaliseres før bruk. - Bla til det uoverførte, HIV-RFP-infiserte røret og kontroller om gating mellom uinfisert RFP-negativ og infisert RFP-positiv er riktig. Juster etter behov, bruk konturvisningen om nødvendig, og bla gjennom de resterende prøvene for å sjekke at gatingen er gyldig for alle prøver.
- Hver prøve krever doble negativer (Q4: nedre venstre, utransducert, uinfisert), YFP-positiv (Q1: øverst til venstre, SAMHD1 uttrykkende, uinfisert), RFP-positiv (Q3: nedre høyre, utransducert, HIV-infisert) og dobbelt positiv (Q2: øverst til høyre, SAMHD1 som uttrykker HIV-infisert). Åpne tabellredigereren ved å klikke på ikonet og dra de fire kvadrantportene inn i dashbordet. Velg Excel-eksport og klikk på Opprett tabell. Lagre det genererte regnearket i henhold til lokale filnavnkonvensjoner.
- For å eksportere representasjoner av plott og gatingstrategier, klikk på Layout Editor-ikonet . Velg hver populasjon og dra inn i redigeringsprogrammet med aksene, merkingen og avstanden som kreves.
- Hvis du vil opprette et oppsett med de samme plottene som vises for alle eksemplene, velger du én kolonne og trykker på Gruppe. Trykk på Skaler til bredde og deretter Unngå sideskift. Lagre i filformatet som kreves.
- I det eksporterte regnearket beregner du begrensningsforholdet ved å generere kolonner med prosentandel RFP for YFP-ves (RFP + ve / (doble negativer + RFP + ve)) og prosentandel RFP av YFP + ves (doble positive / (doble positiver + YFP + ve)) og deretter en siste kolonne på (% RFP av YFP + ve / % RFP av YFP-ve), se figur 1. Gjennomsnittlig replikere data for hver SAMHD1 konstruere og beregne om restriksjonsverdier for testede SAMHD1 varianter er vesentlig forskjellig fra wild-type og / eller 206-7AA ved hjelp av passende dataanalyse programvare.
Representative Results
Resultatene av analysen ovenfor bør gi et restriksjonsforhold på 0,25 eller lavere for villtype SAMHD1 positiv kontroll, og 1,0 for den negative kontrollen. Hvis disse to kvalitetskontrollkontrollene er gyldige, bør du vurdere den statistiske signifikansen av resultatene. SAMHD1-varianter som ikke viser noen signifikant forskjell fra villtype, har derfor erstatninger som ikke påvirker SAMHD1-begrensningen i denne sammenhengen. De som er vesentlig forskjellig fra villtype, viser nedsatt begrensning. Hvis disse ikke er vesentlig forskjellig fra den negative kontrollen, mangler de muligheten til å begrense i denne sammenhengen (figur 4 venstre paneler).
Hvis wild-type SAMHD1-begrensningsverdien er større enn 0,3, kan resultatene for testervirus være veiledende, men kan ikke stoles på. Ineffektiv begrensning av villtypeprotein kan skyldes bruk av U937-celler for tidlig etter utvinning fra rekonstituering (innen 2 uker), eller når de er for gamle (>2-3 måneder). Disse parametrene må kanskje bestemmes empirisk for en gitt cellebeholdning. Vanligvis, jo lavere passasjen, desto mer pålitelig skiller cellene og gir derfor det riktige miljøet for SAMHD1-begrensning. Uhensiktsmessig infeksjonsnivå med enten SAMHD1-YFP eller HIV-RFP kan også føre til vanskeligheter med både kompensasjon og nedstrøms bestemmelse av restriksjonsforhold. Et eksempel er illustrert i høyre paneler i figur 4.
Hvis den negative kontrollen avviker fra 1,0 (utenfor området 0,9-1,2), kan dette tyde på et problem med analysen, enten andelen infiserte celler, gatingstrategi eller helsen til cellene påvirker analysen. Se MERKNADER ovenfor.
Figur 1: Skjematisk disposisjonsprotokoll. VLP, viruslignende partikler, PMA, phorbol myristatacetat. Nummererte stadier tilsvarer stadier i protokollen. Figur produsert ved hjelp av BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Skjematisk for retrovirale plasmider . (A) Emballasjevektorer (B) Overføringsvektorer (C) VSV-G konvoluttekspressor. Nøkkelkoding og regulatoriske elementer vises. For detaljer, se materialtabellen. CMV IE: cytomegalovirus umiddelbar-tidlig promotor, BGH: storfe veksthormon, pA: polyA, RRE: Rev Response Element, CMV-LTR: kompositt CMV-HIV-1 LTR promotor, Psi: HIV-1 emballasje signal, cPPT / CTS: sentral polypurin kanal / sentral terminering sekvens, SV40: simian vacuolating virus 40. Figur produsert ved hjelp av BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Gating-strategi for flowcytometrianalyse. (A) Kompensasjonskontroller: venstre panel viser FSC-A/SSC-A gating på taktceller for den uoversatte, uinfiserte kontrollen. Sentrale og høyre paneler viser skjermbilder av enkeltfargekompensasjonskontroller for YFP (midt) og RFP (høyre) med ukompenserte data i svart og kompensert i blått. (B) Tilsvarende kompensasjonsmatrise og tomter for kompensasjonskontroll ovenfor. (C) Gating strategi. Avfall elimineres gjennom analyse av alle celler av FSC-A/SSC-A (venstre panel). Doublets er utelukket ved gating på FSC høyde versus areal (sentralpanel). Høyre panel viser et eksempel på HIV-1-begrensning av villtype SAMHD1. Akser viser kompensert blå og gul laserfluorescens tilsvarende henholdsvis YFP (SAMHD1) og RFP (HIV)-positive celler. Kvadrantporter tegnes ved sammenligning av negative og ensfargede kontroller for RFP og YFP. Tall angir prosentandel av foreldrepopulasjonen. Kompensasjonsverdier for YFP med GFP vil være mye høyere, men mulig å diskriminere ved hjelp av passende filtersett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Forventede resultater: ideelle versus suboptimale data. (A) Representative YFP/RFP-plott for optimale (venstre) og suboptimale (høyre) data. Tall angir prosentandel av foreldrepopulasjonen. I det høyre panelet er HIV-infeksjonen for lav, noe som skaper vanskeligheter med kompensasjon og gating. Begrensningsgraden er høyere enn forventet på 0,5. (B) Plott av begrensningsforhold for varianter av SAMHD1 med hensyn til vill type (WT, rød) eller den negative kontrollen (HD206-7AA, svart) generert ved hjelp av statistisk programvare. Hvert punkt representerer en replikasjonsverdi. Gjennomsnitt og standardavvik vises. Parvise t-tester mellom hver gruppe var signifikante i alle tilfeller forventet der de ble vist. Venstre: Ideelle data - WT viser forventet begrensning på ca. 0,2, negativ viser 1,0. Varianten R372D (grå) er vesentlig forskjellig fra WT, men ikke signifikant fra den negative kontrollen og har dermed mistet evnen til å begrense. Høyre: Suboptimale data. Her oppfører det negative seg som forventet, men i alle seks replikasjonene viser WT bare et restriksjonsforhold på 0,5, på grunn av lav smitterate. Den lave variansen i gruppene betyr at R143H viser en mellomliggende fenotype statistisk forskjellig fra WT og den negative, mens G209S ikke begrenser; Dette bør imidlertid gjentas med friske celler, da den positive kontrollen ikke har gitt det forventede begrensningsforholdet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Som diskutert i notatene ovenfor, er de kritiske aspektene ved protokollen sentrert rundt å beholde riktig cellefenotype for VLP-produksjon og for å skape passende miljø for å observere SAMHD1-begrensning. For det første er den nøyaktige analysen av begrensning ved tofarget flowcytometri avhengig av å oppnå passende proporsjoner av transduserte og infiserte celler slik at det er nok celler i hvert område av plottet for analyse. Forskeren bør derfor sikte mot en MOI på mindre enn 1 (se protokoll). Transduksjon og infeksjonsrater som enten er for høye eller for lave, fører til problemer med analyse på grunn av mangel på uinfiserte eller dobbelt infiserte celler. På samme måte er en lignende transduksjonshastighet for SAMHD1-vektorer som skal sammenlignes, nøkkelen til at den samme kompensasjonsmatrisen og gating kan brukes på hele eksperimentet, noe som øker tilliten til den påfølgende analysen.
For det andre er alderen på U937-cellene som brukes en nøkkelfaktor for om de skiller vellykket. Vellykket differensiering kan overvåkes gjennom observasjon av etterlevelse, redusert forsuring av media over tid etter differensiering og adekvat begrensning av villtype positiv kontroll i analysen. Differensiering på opptil 5 dager har vært vellykket.
En av de viktigste fordelene med denne analysen er fleksibiliteten. En rekke modifiserte versjoner av SAMHD1 (domener, aminosyrer, artssekvenser) kan testes via enkel stedrettet mutagenese av vektoren eller kloningen. På samme måte kan varianter av testerviruset utforskes. Analysen har tidligere blitt brukt for å vise at HIV-1 reverstranskriptasemutanter med redusert kapasitet til å binde dNTP er mer følsomme for SAMHD1-begrensning. Det samme prinsippet kan brukes til å teste begrensningen av andre virus av SAMHD1. Videre kan varierende differensieringsbetingelser eller kunstig manipulering av intracellulære dNTP-konsentrasjoner brukes til å undersøke samspillet mellom intracellulære forhold og SAMHD1-aktivitet, et område med aktiv forskning i Bishop-laboratoriet. Interaksjonen mellom SAMHD1 og forskjellige nukleosid reverstranskriptasehemmere er også beskrevet, og effekten av SAMHD1 vist ved bruk av denne analysen modifisert for bruk i primære celler12,13,14,15.
Tilpasning av protokollen for bruk i primære celler overvinner begrensningen ved å undersøke metabolske fenotyper i transformerte celler. Det eksisterende formatet tillater imidlertid en praktisk og mindre teknisk utfordrende protokoll for høy gjennomstrømningsanalyse, spesielt ved bruk av et flowcytometer med en prøvetaker med høy gjennomstrømning. Ved tilpasning av protokollen bør følsomheten til de internt uoverførte cellene for tilskuereffekter (f.eks. immunsignalering) vurderes.
Som med mange aspekter av cellebiologi, er det viktig at slike analyser brukes som en del av en helhetlig tilnærming for å forstå et gitt fenomen. Den parallelle bruken av biokjemiske analyser for SAMHD1-aktivitet16, kvantifisering av intracellulære dNTP-bassenger og observasjon av SAMHD1 mutante fenotyper hos mennesker, ex vivo og i dyremodeller (utført av laboratorier rundt om i verden, noen beskrevet i dette nummeret) er nøkkelen til den utviklende forståelsen av dette komplekse proteinet.
Disclosures
For Open Access-formål har forfatterne brukt en CC BY offentlig opphavsrettslisens til enhver forfatterakseptert manuskriptversjon som følge av denne innsendingen. Synspunktene som uttrykkes er forfatterens og ikke nødvendigvis NIHRs eller Helse- og sosialdepartementets synspunkter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Francis Crick Institute, som mottar sin kjernefinansiering fra Cancer Research UK (FC001042 og FC001162), UK Medical Research Council (FC001042 og FC001162), og Wellcome Trust (FC001042 og FC001162) og av en Wellcome Trust Investigator Award til JPS (108012/Z/15/Z). Arbeidet ved University of Cambridge ble delfinansiert av NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) og UK Medical Research Council (MR/S009752/1). Den sistnevnte britiske finansierte prisen er en del av EDCTP2-programmet støttet av EU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
| 10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance |
| 12 well plates | Greiner | 665180 | |
| 24 well plates | Greiner | 662160 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
| DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
| DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Flowjo | BD Bioscience | - | alternative analysis software can be used |
| light microscope | - | - | Any bright field light microscope |
| p8.91 | - | - | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
| paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
| polybrene | Sigma | TR-1003 | |
| pKB4 | - | - | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
| pLGatewaySAMHD1eYFP | - | - | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
| pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
- | - | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
| Prism | Graphpad | - | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
| pVSV-G | - | - | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
| RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
| screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
| SCRPSY | - | - | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/ |
| stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
| stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
| TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
| Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
| U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |
References
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction. Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).
- Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).
- Arnold, L. H., et al. Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction. PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194 (2015).
- Groom, H. C. T., et al. Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome. Retrovirology. 7, 10 (2010).
- Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein. Cell. 103 (4), 679-689 (2000).
- Pietschmann, T., et al. Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export. Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bainbridge, J. W., et al. In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium. Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).
- Kane, M., et al. Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity. Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).
- Gao, Y., et al. Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method. Methods in Molecular Biology. 485, Clifton, N.J. 27-35 (2009).
- Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824 (2017).
- Ballana, E., et al. SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).
- Huber, A. D., et al. SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).
- Amie, S. M., et al. Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels. The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).
- Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).
