Summary
यहां वर्णित सेलुलर निरोधात्मक प्रोटीन एसएएमएचडी 1 द्वारा एचआईवी -1 प्रतिबंध की सीमा निर्धारित करने के लिए एक स्थापित विधि है। मानव माइलॉयड वंश यू 937 कोशिकाओं को एसएएमएचडी 1 अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ ट्रांसड्यूस किया जाता है, जो वाईएफपी को सह-व्यक्त करता है, विभेदित होता है और फिर एचआईवी-आरएफपी के साथ चुनौती देता है। प्रतिबंध का स्तर प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जाता है।
Abstract
बाँझ α-आकृति / हिस्टिडाइन-एस्पार्टेट डोमेन युक्त प्रोटीन 1 (एसएएमएचडी 1) क्विसेंट माइलॉयड कोशिकाओं में एचआईवी -1 की प्रतिकृति को रोकता है। यू 937 कोशिकाओं को व्यापक रूप से एसएएमएचडी 1 आरएनए अभिव्यक्ति के निम्न स्तर के कारण एसएएमएचडी 1 गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए एक सुविधाजनक सेल सिस्टम के रूप में उपयोग किया जाता है, जिससे अज्ञात अंतर्जात प्रोटीन अभिव्यक्ति होती है। अन्य रेट्रोवायरल प्रतिबंध कारकों को चिह्नित करने के लिए स्टोय प्रयोगशाला में विकसित इसी तरह के परख के आधार पर, बिशप लैब ने यू 9 37 कोशिकाओं में एसएएमएचडी 1 का विश्लेषण करने के लिए दो-रंग प्रतिबंध परख विकसित की। एक आईआरईएस से व्यक्त वाईएफपी के साथ एसएएमएचडी 1 को व्यक्त करने वाले मुराइन ल्यूकेमिया वायरस जैसे कणों का उपयोग यू 937 कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए किया जाता है। कोशिकाओं को तब फोरबोल मायरिस्टेट एसीटेट के साथ इलाज किया जाता है ताकि एक क्विसेंट फेनोटाइप में भेदभाव को प्रेरित किया जा सके। भेदभाव के बाद, कोशिकाएं एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को व्यक्त करने वाले एचआईवी -1 वायरस जैसे कणों से संक्रमित होती हैं। 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा काटा और विश्लेषण किया जाता है। SAMHD1-व्यक्त आबादी में एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं के अनुपात की तुलना आंतरिक नियंत्रण कोशिकाओं में SAMHD1 की कमी से की जाती है। इस तुलना से एक प्रतिबंध अनुपात का पता चलता है। SAMHD1 अभिव्यक्ति एचआईवी संक्रमण में पांच गुना कमी की ओर ले जाती है, जो 0.2 के प्रतिबंध अनुपात के अनुरूप है। एचआईवी संक्रमण के लिए रिपोर्टर जीन के रूप में मूल जीएफपी के लिए आरएफपी के हमारे हालिया प्रतिस्थापन ने फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण की सुविधा प्रदान की है।
इस परख का उपयोग अभिव्यक्ति वेक्टर के साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस से प्राप्त परिवर्तित एसएएमएचडी 1 प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले वायरस के साथ ट्रांसड्यूस करके एसएएमएचडी 1 प्रतिबंध पर अमीनो एसिड प्रतिस्थापन के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। उदाहरण के लिए, उत्प्रेरक साइट प्रतिस्थापन एचडी 206-7एए 1 का प्रतिबंध फेनोटाइप दिखाता है, जो प्रतिबंध गतिविधि के नुकसान का संकेत देता है। समान रूप से, विभिन्न परीक्षक वायरस की संवेदनशीलता निर्धारित की जा सकती है। परख को एसएएमएचडी 1, सेल चयापचय स्थिति और वायरल प्रतिबंध के बीच संबंधों को बेहतर ढंग से समझने के लिए भेदभाव की स्थिति, चयापचय स्थिति और एसएएमएचडी 1 संशोधक के प्रभाव को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
बाँझ α-मोटिफ/हिस्टिडाइन-एस्पार्टेट डोमेन युक्त प्रोटीन 1 (एसएएमएचडी1) माइलॉयड वंश की क्विसेंट कोशिकाओं में मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस टाइप 1 (एचआईवी -1) की प्रतिकृति को बाधित करता है। SAMHD1 एक dNTP ट्राइफॉस्फोहाइड्रोलेस के रूप में अपनी एंजाइमेटिक गतिविधि के माध्यम से प्रतिकृति को अवरुद्ध करता है, जिसके परिणामस्वरूप इंट्रासेल्युलर डीएनटीपी के स्तर में कमी आती है। नतीजतन, एचआईवी -1 रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन की प्रक्रिया को कुशलतापूर्वक नहीं कर सकता है। इस प्रारंभिक अवलोकन के बाद से कुछ वर्षों में बहुत प्रगति हुई है, विशेष रूप से एसएएमएचडी 1 की एंटीवायरल गतिविधि के लिए विशिष्ट डोमेन और अमीनो एसिड के योगदान के बारे में। ये अंतर्दृष्टि जैव रासायनिक परख के साथ-साथ सेल सिस्टम का उपयोग करके बनाई गई है जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक क्विसेंट माइलॉयड वातावरण की नकल करती है। यू 937 कोशिकाएं1 व्यापक रूप से SAMHD1 गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए एक सुविधाजनक माइलॉयड सेल सिस्टम के रूप में उपयोग की जाती हैं। यह अंतर्जात SAMHD1 अभिव्यक्ति की कमी के कारण है, जिसे SAMHD1-व्यक्त कोशिकाओं (चल रहे शोध का एक क्षेत्र) की तुलना में कम आरएनए स्तर के कारण माना जाता है। यहां, प्रोटोकॉल एचआईवी -1 के एसएएमएचडी 1 प्रतिबंध के तंत्र की जांच करने के लिए वायरस जैसे कणों के साथ यू 937 कोशिकाओं के क्षणिक पारगमन का वर्णन करता है। रेट्रोवायरल प्रतिबंधों की जांच करने के लिए इस तरह के क्षणिक दो-रंग प्रवाह साइटोमेट्री परख पहली बार स्टोय प्रयोगशाला2 में विकसित किए गए थे और तब से त्रिपक्षीय आकृति (टीआरआईएम) प्रोटीन3 सहित अन्य प्रतिबंध कारकों की जांच के लिए अनुकूलित किया गया है। इन परखों से प्रेरित होकर, बिशप लैब ने यू 9 37 कोशिकाओं में एसएएमएचडी 1 प्रतिबंध का विश्लेषण करने के लिए दो-रंग परख विकसित की।
प्रयोग के लिए वर्कफ़्लो चित्र 1 में दिखाया गया है। मुराइन ल्यूकेमिया वायरस (एमएलवी) जैसे कणों में एक आईआरईएस से व्यक्त वाईएफपी के साथ एसएएमएचडी 1 को एन्कोडिंग करने वाला द्वि-सिस्ट्रोनिक संदेश होता है, जिसका उपयोग यू 937 कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए किया जाता है। कोशिकाओं को तब फोरबोल मायरिस्टेट एसीटेट (पीएमए) के साथ इलाज किया जाता है ताकि एक क्विसेंट फेनोटाइप में भेदभाव को प्रेरित किया जा सके। कोशिकाएं लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) व्यक्त करने वाले एचआईवी -1 वायरस जैसे कणों से संक्रमित होती हैं। 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं को दो-रंग प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा काटा और विश्लेषण किया जाता है। इस परख का उपयोग वाईएफपी और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के साथ भी किया जाता है, जिसमें फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए कम मानक फिल्टर संयोजन की आवश्यकता होती है। एचआईवी-आरएफपी का उपयोग अधिक सरल मुआवजे की अनुमति देता है और इस प्रकार परख कम अनुभवी प्रवाह साइटोमेट्री उपयोगकर्ताओं के लिए अधिक आसानी से सुलभ है, और अधिकांश साइटोमीटर के साथ प्राप्त करने योग्य है।
विश्लेषण के दौरान, एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं के अनुपात की तुलना SAMHD1-व्यक्त कोशिकाओं और कोशिकाओं के एक ही कुएं के भीतर SAMHD1 की कमी वाले लोगों के बीच की जाती है। यह वेल / फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब में एक आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता है, जो एक महत्वपूर्ण विशेषता है। ट्रांसड्यूस्ड और अनट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं में संक्रमण के स्तर की तुलना से एक प्रतिबंध अनुपात का पता चलता है। 1.0 का अनुपात इंगित करता है कि ट्रांसड्यूस्ड कारक का संक्रामकता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। जंगली प्रकार एसएएमएचडी 1 अभिव्यक्ति इस परख में एचआईवी संक्रमण में पांच गुना कमी की ओर ले जाती है, जो 0.2 के प्रतिबंध अनुपात के अनुरूप है। हालांकि यह प्रभाव टीआरआईएम 5 जैसे अधिक क्लासिक प्रतिबंध कारकों की तुलना में मामूली है, फिर भी प्रभाव प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और संशोधित एसएएमएचडी 1 एक्सप्रेसर्स के वर्गीकरण की अनुमति देता है जो जंगली प्रकार के प्रोटीन के बराबर तरीके से प्रतिबंधित करते हैं, जो प्रतिबंधित करने में विफल रहते हैं, और जो एक मध्यवर्ती फेनोटाइप वाले हैं।
इस परख का उपयोग एसएएमएचडी 1 डोमेन और एमिनो एसिड उत्परिवर्ती के प्रतिबंध फेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है, जो उत्परिवर्ती एसएएमएचडी 1 अनुक्रमों को एन्कोडिंग करने वाले वायरस के साथ ट्रांसड्यूस करके है। उदाहरण के लिए, उत्प्रेरक साइट प्रतिस्थापन एचडी 206-7एए इस परख में प्रतिबंधित करने में विफल रहता है। समान रूप से, विभिन्न परीक्षक वायरस की संवेदनशीलता निर्धारित की जा सकती है। उदाहरण के लिए, एचआईवी -1 रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस म्यूटेंट एसएएमएचडी 1-मध्यस्थता प्रतिबंध (जैसे, 151 वी4) के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। यह प्रोटोकॉल वायरस जैसे कण (वीएलपी) उत्पादन, एसएएमएचडी 1 अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ यू 937 के पारगमन, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को ले जाने वाले एचआईवी के साथ संक्रमण और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा बाद के विश्लेषण के विवरण को रेखांकित करता है। यह आलेख चर्चा करता है कि किस डेटा की अपेक्षा करें और उप-मानक परिणामों से कैसे बचें। अंत में, परख के लिए वैकल्पिक उपयोगों को रेखांकित किया गया है, एसएएमएचडी 1, डीएनटीपी स्तरों और वायरल संक्रमण के बीच परस्पर क्रिया को अधिक अच्छी तरह से समझने के लिए विभिन्न एसएएमएचडी 1 वेरिएंट की जांच करने के अलावा। सेल चयापचय के केंद्र में SAMHD1 की भूमिका को देखते हुए, कैंसर के अतिरिक्त लिंक के साथ, यह गहन रुचि का क्षेत्र बना हुआ है।
Protocol
इस प्रोटोकॉल में किसी भी लेखक द्वारा किए गए जानवरों या मानव प्रतिभागियों को शामिल करने वाला कोई अध्ययन शामिल नहीं है। इस प्रोटोकॉल के सभी चरणों को उन संस्थानों के दिशानिर्देशों और अभ्यास के कोड का पालन करते हुए किया गया था जहां वे किए गए थे।
1. वीएलपी उत्पादन के लिए 293 टी कोशिकाओं का अभिकर्मक (एसएएमएचडी 1-अभिव्यक्ति वैक्टर और परीक्षक एचआईवी कण दोनों)
नोट: वायरस कणों के सफल उत्पादन में सबसे महत्वपूर्ण योगदानकर्ता निर्माता 293 टी कोशिकाओं का स्वास्थ्य, अभिकर्मक पर स्थिरता और फसल का समय है। प्रयोगशालाओं में आमतौर पर रेट्रोवायरल कण उत्पादन के लिए उनके पसंदीदा अभिकर्मक अभिकर्मक और प्रोटोकॉल होंगे। निम्नलिखित प्रोटोकॉल अच्छी गुणवत्ता वाले संक्रामक कणों का उत्पादन करता है, लेकिन समकक्ष प्रोटोकॉल भी इस आवेदन के लिए उपयुक्त होंगे। अच्छी गुणवत्ता वाले 293 टी कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए, निरंतर विकास दर बनाए रखने के लिए प्रति सप्ताह कम से कम तीन बार पारित करें। कुशल अभिकर्मक के लिए कोशिकाओं को विकास के लॉग चरण में बीज दिया जाना चाहिए।
- दिन 1: 293 टी कोशिकाओं के निकट-कंफ्लुएंट डिश से 1/4 विभाजित 10 सेमी व्यंजनों की आवश्यक संख्या को बीज दें ताकि अगले दिन लगभग 60% संयोजन (लगभग 5 x 105 कोशिकाएं / एमएल) प्राप्त हो सके। एक नए सेल स्टॉक के साथ काम करते समय अगले दिन अभिकर्मक के लिए उपयुक्त घनत्व प्राप्त करने के लिए कई घनत्वों को बीज ति करने की आवश्यकता हो सकती है।
- दिन 2 (सुबह): माइक्रोस्कोपी द्वारा लगभग 60% कंफ्लुएंसी की जांच करें और धीरे से कोशिकाओं पर मीडिया को 10 एमएल ताजा डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) के साथ बदलें।
- दिन 2 (दोपहर, मीडिया परिवर्तन के कम से कम 4 घंटे बाद): वीएलपी उत्पादन के लिए ट्रांसफेक्ट।
- सीरम-मुक्त डीएमईएम के 600 μL में गैग-पोल एक्सप्रेसर प्लास्मिड, लॉन्ग-टर्मिनल रिपीट (LTR)-संचालित रिपोर्टर प्लास्मिड और वेसिकुलर स्टोमाटाइटिस वायरस जी प्रोटीन (VSV-G) एक्सप्रेसर प्लास्मिड (कुल 9 μg, नोट देखें) वाले डीएनए कमजोर पड़ने वाले मिश्रण को बनाएं। भंवर और सेंट्रीफ्यूज संक्षेप में (15 एस, >500 एक्स जी)।
- अभिकर्मक अभिकर्मक का 20 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), भंवर (सेंट्रीफ्यूज न करें) और 15-20 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अभिकर्मक मिश्रण को प्लेट में ड्रॉपवाइज जोड़ें, मिश्रण करने के लिए धीरे से घुमाएं, और इनक्यूबेटर पर लौटें।
नोट: SAMHD1 को व्यक्त करने वाले MLV VLP के लिए KB4 5,6 (gag-pol Expressor प्लास्मिड), pLGatewaySAMHD1IeYFP1 (LTR-संचालित रिपोर्टर प्लास्मिड) और pczVSV-G7 का उपयोग करें। एचआईवी-आरएफपी वीएलपी के लिए, पी 8.91 8,9 (गैग-पोल एक्सप्रेसर प्लास्मिड), एससीआरपीएसवाई10 (एलटीआर-संचालित रिपोर्टर प्लास्मिड), और पीसीजेडवीएसवी-जी का उपयोग करें। विकल्प सामग्री की तालिका में चर्चा की गई है। प्लास्मिड अनुपात को विभिन्न प्लास्मिड / अभिकर्मक प्रणालियों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
- दिन 3 (देर सुबह): पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं से मीडिया को सावधानीपूर्वक हटा दें, 5 एमएल ताजा डीएमईएम के साथ धो लें, और 5 एमएल ताजा डीएमईएम के साथ बदलें।
- दिन 4 (सुबह): कोशिकाओं से सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करके वायरस को काटें और 5 एमएल ताजा डीएमईएम के साथ बदलें। वीएलपी युक्त सुपरनैटेंट को 0.45 एनएम फिल्टर, एलिकोट के माध्यम से पास करें और भंडारण के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि एलिकोट नियोजित प्रयोगों के लिए उपयुक्त आकार के हैं (एक सुझाव के रूप में 250 μL) क्योंकि बार-बार फ्रीज-पिघलने चक्र के परिणामस्वरूप वायरल टिटर का नुकसान होगा।
- दिन 5 (सुबह): वायरस को 1.5 के रूप में काटें लेकिन सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करने के बाद प्लेटों को छोड़ दें।
2. उपयोग से पहले नई वीएलपी को टिटरिंग करना
- पहला दिन: बीज 293 टी पर 24-वेल प्लेट के प्रति कुएं 2 x 105 कोशिकाएं - प्रति वायरस 4 कुएं को टाइट किया जाना चाहिए, जिसमें प्रत्येक रीढ़ के लिए ज्ञात संक्रामकता का वायरस भी शामिल है। किसी दिए गए सेल स्टॉक के लिए सीडिंग घनत्व को अनुकूलित करें।
- दिन 2: कॉन्फ्लुएंसी (आदर्श रूप से ~ 70%) की जांच करने के लिए प्लेट का निरीक्षण करें। चरण 1.5 और 1.6 से वायरस युक्त-सतह पर तैरने वाले को पिघलाएं। प्रत्येक कुएं में 0, 10, 25, या 100 μL जोड़ें।
- दिन 4 (सुबह): फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को काटें।
- सावधानीपूर्वक पाइपिंग या आकांक्षा से मीडिया को हटा दें। कोशिकाओं को फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 250 μL के साथ धीरे से धोएं। 250 μL PBS के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके प्लेट से कोशिकाओं को हटा दें, और एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का 250 μL जोड़ें (अंतिम एकाग्रता को 2% तक ले जाएं)।
चेतावनी: पैराफॉर्मलडिहाइड विषाक्त है। इसे क्लोरीन आधारित कीटाणुनाशक के साथ नहीं मिलाया जाना चाहिए। - 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को छर्रों को छर्रों, सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और पीबीएस या वैकल्पिक प्रवाह साइटोमेट्री बफर के 200 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा उपयुक्त के रूप में आरएफपी या वाईएफपी के लिए विश्लेषण करें। ज्ञात संक्रामकता के स्टॉक के लिए मूल्यों के खिलाफ किसी दिए गए वायरस स्टॉक की संक्रामकता को सामान्य करें।
नोट: वीएलपी को पी 24 एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा भी सामान्यीकृत किया जा सकता है; हालांकि, यह आवश्यक रूप से वीएलपी संक्रामकता का एक अच्छा संकेतक नहीं है, खासकर जहां वीएलपी स्टॉक विभिन्न अभिकर्मकों में तैयार किए जाते हैं। प्रकाशित औसत ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक या संक्रमण की बहुलता (TCID50 / MOI) विधियां11 भी सापेक्ष मात्रा प्रदान कर सकती हैं, हालांकि ये एमएलवी के लिए अच्छी तरह से स्थापित नहीं हैं। सापेक्ष प्रतिदीप्ति वाणिज्यिक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस एलिसा विधियों के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प प्रदान करता है।
- सावधानीपूर्वक पाइपिंग या आकांक्षा से मीडिया को हटा दें। कोशिकाओं को फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 250 μL के साथ धीरे से धोएं। 250 μL PBS के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके प्लेट से कोशिकाओं को हटा दें, और एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का 250 μL जोड़ें (अंतिम एकाग्रता को 2% तक ले जाएं)।
3. SAMHD1 और YFP को व्यक्त करने वाले VLP के साथ U937 का पारगमन
नोट: चरण 3-6 प्रतिबंध प्रयोग का गठन करते हैं। योजना बनाने में आसानी के लिए दिन गिने जाते हैं।
- दिन 1 (दोपहर): एमएलवी-वाइल्ड-टाइप एसएएमएचडी1-वाईएफपी (पॉजिटिव कंट्रोल), एमएलवी-एसएएमएचडी1 (एचडी206-7एए)-वाईएफपी (निगेटिव कंट्रोल) और वेरिएंट एमएलवी-एसएएमएचडी1-वाईएफपी (प्रयोगात्मक नमूने) सहित ट्रांसडक्शन के लिए वीएलपी को पिघलाएं। सामान्यीकृत वीएलपी को एक माइक्रोफ्यूज ट्यूब में रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट 1640 मीडिया (आरपीएमआई) के साथ 500 μL की अंतिम मात्रा में पतला करें, पॉलीब्रीन (10 मिलीग्राम / एमएल) का 0.5 μL जोड़ें, और फ्लिक करके मिलाएं।
- यदि VLP को पहले से टाइट नहीं किया जा सकता है, तो पहले उदाहरण में 100 μL का उपयोग करें। वीएलपी-प्रेरित विषाक्तता को सीमित करने के लिए वीएलपी से आरपीएमआई के अधिकतम 1: 1 अनुपात का उपयोग करें। लगभग 30% पारगमन का लक्ष्य रखें।
- प्रत्येक पारगमन स्थिति के लिए एक बाँझ माइक्रोफ्यूज ट्यूब में एलिकोट 5 x 105 यू 9 37 कोशिकाएं। 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गोली, और सुपरनैटेंट को हटा दें (फ्लो साइटोमेट्री के लिए अपरिवर्तित नियंत्रण के रूप में दो अतिरिक्त ट्यूब शामिल करें)। सेल पेलेट को पतला वीएलपी (या अपरिवर्तित नियंत्रण के लिए आरपीएमआई) के 500 μL में पुन: निलंबित करें और 24-वेल प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें।
- 20 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 800 x g पर एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में स्पिनोकुलेट करें। कुएं में 37 डिग्री सेल्सियस आरपीएमआई का 1 एमएल जोड़ें और 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ठीक होने की अनुमति दें।
4. ट्रांसड्यूस्ड यू 937 का भेदभाव
- दिन 4 (सुबह): 12-वेल प्लेट के 4 कुओं में से प्रत्येक में धीरे-धीरे पाइपिंग और 350 μL स्थानांतरित करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 100 एनएम की अंतिम एकाग्रता देते हुए प्रत्येक कुएं में 150 एनएम पीएमए युक्त 37 डिग्री सेल्सियस आरपीएमआई का 700 μL जोड़ें और 3 दिनों के लिए अंतर करने की अनुमति दें।
नोट: पीएमए को पाउडर के रूप में खरीदा जाता है और इसे डीएमएसओ में 1 एमएम तक फिर से निलंबित किया जाना चाहिए और अंधेरे में संग्रहीत किया जाना चाहिए। डीएमएसओ के साथ 1 एमएम स्टॉक से 1/10 को पतला करके 100 μM का एक कार्यशील स्टॉक तैयार किया जाना चाहिए।
5. एचआईवी-आरएफपी के साथ विभेदित, SAMHD1-व्यक्त U937 का संक्रमण
- दिन 7: माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं का निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं अनुगामी हैं। सभी कुओं से मीडिया को उत्तेजित करें, 4 के प्रत्येक सेट के 1 में आरपीएमआई के 1 एमएल जोड़ें, जिससे अपरिवर्तित, असंक्रमित नियंत्रण के साथ-साथ एकल रंग नियंत्रण भी हो सके। अन्य सभी कुओं में लगभग 10 μL HIV-1-RFP (गाइड के रूप में लगभग 10 ng p24) युक्त RPMI के 0.5 mL को वापस जोड़ें। लगभग 50% संक्रमण का लक्ष्य रखें।
- दिन 8 (सुबह): प्रत्येक संक्रमित कुओं में आरपीएमआई का 0.5 एमएल जोड़ें।
6. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण
नोट: फ्लो साइटोमेट्री पाइपलाइनों में एक लाइव-डेड दाग शामिल करना अच्छा अभ्यास है। हालांकि, यदि यू 937 कोशिकाएं अच्छी गुणवत्ता की हैं, तो डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए नकारात्मक परिणामों के बिना इस कदम को छोड़ा जा सकता है। ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाओं के कोमल पाइपिंग के परिणामस्वरूप आसानी से एकल सेल निलंबन होना चाहिए।
- दिन 10 (सुबह): कुओं से मीडिया को शांत करें और पीबीएस के साथ एक बार धोएं। 5-10 मिनट के लिए सेल पृथक्करण एंजाइम (या ट्रिप्सिन) के 300 μL जोड़ें। पीबीएस का एक अतिरिक्त 300 μL जोड़ें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कोशिकाएं प्लेट से बाहर आ गई हैं, और प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
- 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का 300 μL जोड़ें (अंतिम एकाग्रता को 2% तक ले जाएं)। 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को छर्रों को छर्रों, सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और पीबीएस या वैकल्पिक प्रवाह साइटोमेट्री बफर के 200 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें।
नोट: नीचे दिए गए चरण फोर्टेसा विश्लेषक के लिए हैं, लेकिन आरएफपी और वाईएफपी प्रतिदीप्ति को पढ़ने में सक्षम किसी भी विश्लेषक का उपयोग करके समकक्ष विश्लेषण प्राप्त किया जा सकता है। किसी भी प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण को स्थापित करने से पहले स्थानीय प्रवाह साइटोमेट्री समर्थन या अन्य अनुभवी शोधकर्ता से परामर्श करें। जब कई नमूनों को एक ही समय में जांचने की आवश्यकता होती है, तो एक उच्च थ्रूपुट नमूना उपयुक्त हो सकता है। इस मामले में, एक बड़ी सेल संख्या और मात्रा की सलाह दी जाती है।
7. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण
- आवश्यक होने से 10 मिनट पहले साइटोमीटर चालू करें और कंप्यूटर को चालू करें। जांचें कि कचरा खाली है और शीथ टैंक भरा हुआ है।
- मशीन में लॉग इन करें और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें।
- बांह को साइड में ले जाएं, पानी की ट्यूब को बंद करें, प्रवाह दर को उच्च पर सेट करें और प्राइम दबाएं। प्रकाश के बाहर जाने की प्रतीक्षा करें और तीन बार दोहराएं।
- पानी को वापस चालू करें और 3 मिनट के लिए उच्च पर चलाएं और फिर लो पर स्विच करें और अधिग्रहण के लिए आगे बढ़ने तक स्टैंडबाय दबाएं।
- इस बीच सॉफ्टवेयर के भीतर प्रयोग स्थापित करें:
- नया प्रयोग चुनें (स्थानीय मार्गदर्शन के अनुसार नाम)। इंस्पेक्टर में, ब्लू लेजर 530/30 और येलो लेजर 610/20 या मशीन के लिए वाईएफपी और आरएफपी के लिए अनुशंसित लेजर और फिल्टर संयोजन छोड़कर, अनावश्यक फ्लोरोक्रोम को हटा दें।
- प्रयोग पर राइट क्लिक करें और साइटोमीटर सेटिंग्स/एप्लिकेशन सेटिंग्स/क्रिएट वर्कशीट चुनें। वर्कशीट पर, संबंधित आइकन पर क्लिक करके और अक्ष लेबल पर क्लिक करके अक्षों को बदलकर फॉरवर्ड स्कैटर-एरिया (एफएससी-ए)/साइड स्कैटर एरिया (एफएससी-ए) डॉट ब्लॉट और वाईएफपी हिस्टोग्राम, आरएफपी हिस्टोग्राम और जीएफपी / वाईएफपी डॉट ब्लॉट बनाएं।
- प्रयोग पर फिर से राइट क्लिक करें और नया नमूना जोड़ें। उचित के रूप में नाम बदलें। एक नई ट्यूब प्रकट करने के लिए प्लस चिह्न पर क्लिक करके नमूना खोलें।
- दृश्य से अधिग्रहण डैशबोर्ड खोलें, असंक्रमित, अपरिवर्तित नियंत्रण लोड करें और अधिग्रहण दबाएँ. निचले-बाएं क्वाड्रंट (अक्षों पर कोई कोशिका नहीं) में कोशिकाओं को स्थिति देने के लिए डैशबोर्ड में एफएससी और एसएससी वोल्टेज समायोजित करें। इस आबादी के चारों ओर गेट पी 1। अन्य भूखंडों पर राइट क्लिक करें और बाद के विश्लेषण से मलबे को हटाने के लिए पी 1 दिखाएं का चयन करें।
- YFP (केवल जंगली प्रकार SAMHD1) के लिए एकल-रंग नियंत्रण लोड करें और अधिग्रहण करें। डैशबोर्ड में वाईएफपी वोल्टेज को समायोजित करें ताकि अधिकांश फ्लोरोसेंट कोशिकाएं डिटेक्टर की सीमा के भीतर हों (अक्ष के किनारे पर नहीं)। एकल रंग आरएफपी नियंत्रण के लिए दोहराएं।
- अपरिवर्तित, असंक्रमित और एकल-रंग नियंत्रणों का उपयोग करके स्वचालित मुआवजा चलाएँ।
- किसी सामान्य कार्यपत्रक > टॉगल करने के लिए मेनू से प्रतिपूर्ति नियंत्रण बनाएँ > प्रयोग करें मुआवजा सेटअप का चयन करें. बिना दाग वाले सामान्य कार्यपत्रक का चयन करें, रन पर दबाएं और बिना दाग वाले नियंत्रण के लिए अधिग्रहण करें।
- बरकरार कोशिकाओं (पी 1) के चारों ओर एक गेट खींचें और रिकॉर्ड करें। ट्यूब को हटा दें और मशीन को स्टैंडबाय पर रखें। पी 1 पर राइट क्लिक करें, सभी मुआवजा नियंत्रणों पर लागू करें पर क्लिक करें।
- RFP सामान्य कार्यपत्रक पर स्विच करें, और चलाएँ दबाएँ. एकल-रंग आरएफपी नियंत्रण रिकॉर्ड करें, और मशीन को स्टैंडबाय पर रखें। सॉफ्टवेयर को स्वचालित रूप से सकारात्मक आबादी का चयन करना चाहिए।
- वाईएफपी एकल रंग नियंत्रण के लिए दोहराएं। मुआवजा > लिंक की गणना > और सहेजने के लिए प्रयोग > मुआवजा सेटअप का चयन करें।
- वैश्विक कार्यपत्रक पर स्विच करें. एचआईवी-आरएफपी से संक्रमित जंगली प्रकार एसएएमएचडी 1 के साथ ट्रांसड्यूस की गई कोशिकाओं का अधिग्रहण करें और जांचें कि क्वाड्रेंट्स के कोनों में चार अलग-अलग आबादी देखी जा सकती है जो क्रमशः वाईएफपी और आरएफपी के लिए लंबवत और क्षैतिज रूप से संरेखित हैं। ट्यूब निकालें और स्टैंडबाय दबाएं।
- अपरिवर्तित, असंक्रमित नमूने को फिर से लोड करें, रन दबाएं और स्टॉपिंग गेट के रूप में पी 1 के साथ 30,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें। शेष नमूने (अन्य नियंत्रणों सहित) के लिए दोहराएं। चलते समय या पोस्ट हॉक नमूने का नाम बदलें। एक बार निर्यात करने के बाद, फ़ाइलों का नाम नहीं बदला जा सकता.
- डेटा को .fcs फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें और स्थानीय निर्देशों के अनुसार द्रव को साफ करें।
8. डेटा विश्लेषण
नोट: निम्नलिखित चरण FlowJo v10 में विश्लेषण के अनुरूप हैं; हालांकि, समकक्ष चरण आसानी से अन्य विश्लेषण सॉफ्टवेयर में किए जा सकते हैं।
- सॉफ़्टवेयर खोलें और सभी .fcs फ़ाइलों को डैशबोर्ड में खींचें. मुआवजा नियंत्रण ों का चयन करें और उन्हें मुआवजा सबफ़ोल्डर में खींचें. डबल-क्लिक करके अपरिवर्तित, असंक्रमित ट्यूब के लिए फ़ाइल खोलें, जो एफएससी-ए / एसएससी-ए प्लॉट लाएगा।
- निचले-बाएं कोने में मलबे को छोड़कर, बरकरार सेल आबादी पर बहुभुज उपकरण और गेट का चयन करें। इस कक्ष का नाम दें. इस गेट को ऑल सैंपल बार में ट्यूबों की पूरी आबादी पर खींचें। क्षैतिज तीर बटन का उपयोग करके प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने के माध्यम से स्क्रॉल करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि गेटिंग प्रत्येक ट्यूब के लिए उपयुक्त है।
- अपरिवर्तित, असंक्रमित नमूने के लिए कोशिकाओं की आबादी पर डबल-क्लिक करें और अक्षों को एफएससी-ऊंचाई (एच) बनाम एफएससी-क्षेत्र (ए) में समायोजित करें। डबल्स को बाहर करने के लिए आयताकार गेट का उपयोग करके एकल बड़ी आबादी का चयन करें। सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से इस एकल कोशिकाओं का नामकरण करने का सुझाव देगा।
- इस गेट को सभी कोशिकाओं की आबादी पर खींचें और फिर से, जांचें कि गेटिंग सभी नमूनों के लिए उपयुक्त है। असंक्रमित, अपरिवर्तित नमूने के लिए एकल कोशिकाओं की आबादी का चयन करें, क्षतिपूर्ति किए गए नीले लेजर (वाई, वाईएफपी) बनाम क्षतिपूर्ति पीले लेजर (एक्स, आरएफपी) के लिए अक्षों को बदलें। अक्ष पर T दबाएँ और x और y के लिए द्विघातीय पैमाने का चयन करें।
- क्वाड्रंट गेटिंग टूल का चयन करें और नकारात्मक सेल आबादी के ऊपरी-दाएं चरम पर क्लिक करें। सभी नमूने पट्टी में खींचकर सभी एकल कोशिका आबादी के लिए इस प्रारंभिक गेटिंग को लागू करें। जहां क्वाड्रंट गेट आबादी को संतोषजनक रूप से अलग नहीं करते हैं, वहां बहुभुज उपकरण का उपयोग करके व्यक्तिगत चतुर्थांश को गेट करना आवश्यक हो सकता है, जैसा कि चित्र 2 में है।
- वाइल्ड-टाइप SAMHD1 केवल नमूने (केवल YFP) पर स्क्रॉल करें और जांचें कि अट्रांड्यूस्ड (YFP नकारात्मक) और YFP पॉजिटिव के बीच गेटिंग सही है। यह मंद वाईएफपी कोशिकाओं से नकारात्मक भेदभाव करने के लिए समोच्च दृश्य पर स्विच करने में मदद कर सकता है। यदि ऊपरी-सबसे अधिक वाईएफपी + वी कोशिकाएं व्यापक रूप से फैली हुई हैं, तो ऊपरी-ऊर्ध्वाधर गेट को दाईं ओर समायोजित करें।
- सभी नमूनों के माध्यम से स्क्रॉल करें और वाईएफपी सकारात्मकता के संबंध में गेटिंग की जांच करें। वाईएफपी नकारात्मक और सकारात्मक के बीच सबसे अच्छा विभाजन का उपयोग करें जो सभी नमूनों के लिए मान्य है।
नोट: मुआवजे की गणना जंगली प्रकार के SAMHD1 YFP अभिव्यक्ति स्तर के आधार पर की जाएगी। यदि संक्रमण का स्तर विभिन्न SAMHD1-YFP ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं के बीच बहुत भिन्न है, तो मुआवजे को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। इसलिए यह पसंद किया जाता है कि वाईएफपी वीएलपी को उपयोग से पहले सामान्यीकृत किया जाता है। - अपरिवर्तित, एचआईवी-आरएफपी संक्रमित ट्यूब पर स्क्रॉल करें और जांचें कि असंक्रमित आरएफपी नकारात्मक और संक्रमित आरएफपी पॉजिटिव के बीच गेटिंग सही है या नहीं। यदि आवश्यक हो तो समोच्च दृश्य का उपयोग करके उपयुक्त रूप से समायोजित करें और गेटिंग की जांच करने के लिए शेष नमूनों के माध्यम से स्क्रॉल करें जो सभी नमूनों के लिए मान्य है।
- प्रत्येक नमूने को डबल निगेटिव (Q4: निचला बाएं, अपरिवर्तित, असंक्रमित), YFP पॉजिटिव (Q1: ऊपरी बाएं, SAMHD1 व्यक्त, असंक्रमित), RFP-पॉजिटिव (Q3: निचला दायां, अपरिवर्तित, एचआईवी संक्रमित), और डबल पॉजिटिव (Q2: ऊपरी दाएं, SAMHD1 एचआईवी संक्रमित व्यक्त) की आवश्यकता होती है। आइकन पर क्लिक करके टेबल एडिटर खोलें और डैशबोर्ड में चार क्वाड्रंट गेट खींचें। Excel निर्यात का चयन करें और तालिका बनाएँ पर क्लिक करें. जेनरेट की गई स्प्रेडशीट को स्थानीय फ़ाइल नामकरण सम्मेलनों के अनुसार सहेजें.
- प्लॉट और गेटिंग रणनीतियों के प्रतिनिधित्व निर्यात करने के लिए, लेआउट संपादक आइकन पर क्लिक करें। प्रत्येक जनसंख्या का चयन करें और आवश्यक अक्षों, लेबलिंग और रिक्ति के साथ संपादक में खींचें।
- सभी नमूनों के लिए दिखाए गए समान भूखंडों के साथ एक लेआउट बनाने के लिए, एक कॉलम का चयन करें और बैच पर दबाएं। स्केल से चौड़ाई पर दबाएँ और तब पेज ब्रेक से बचें. आवश्यक फ़ाइल स्वरूप में सहेजें.
- निर्यात की गई स्प्रेडशीट में, YFP-ves (RFP+ve/(डबल नेगेटिव + RFP+ve)) के प्रतिशत RFP के कॉलम उत्पन्न करके प्रतिबंध अनुपात की गणना करें और YFP+ves के प्रतिशत RFP (डबल पॉजिटिव / (डबल पॉजिटिव + YFP +ve)) और फिर (YFP+ve का%RFP का%RFP+YFP-ve)) का अंतिम कॉलम तैयार करें, चित्र 1 देखें। प्रत्येक SAMHD1 निर्माण के लिए प्रतिकृति डेटा का औसत निकालें और गणना करें कि क्या परीक्षण किए गए SAMHD1 वेरिएंट के लिए प्रतिबंध मान उचित डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके वाइल्ड-टाइप और / या 206-7एए से काफी अलग हैं।
Representative Results
उपरोक्त विश्लेषण के परिणामों को जंगली-प्रकार एसएएमएचडी 1 सकारात्मक नियंत्रण के लिए 0.25 या उससे कम का प्रतिबंध अनुपात और नकारात्मक नियंत्रण के लिए 1.0 का अनुपात प्राप्त करना चाहिए। यदि ये दो गुणवत्ता नियंत्रण जांच मान्य हैं, तो परिणामों के सांख्यिकीय महत्व पर विचार करें। SAMHD1 वेरिएंट जो जंगली प्रकार से कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाते हैं, इसलिए प्रतिस्थापन लेते हैं जो इस संदर्भ में SAMHD1 प्रतिबंध को प्रभावित नहीं करते हैं। जंगली प्रकार से काफी अलग लोग बिगड़ा हुआ प्रतिबंध दिखाते हैं। यदि ये नकारात्मक नियंत्रण से काफी अलग नहीं हैं, तो उनके पास इस संदर्भ में प्रतिबंधित करने की क्षमता की कमी है (चित्रा 4 बाएं पैनल)।
यदि वाइल्ड-टाइप SAMHD1 प्रतिबंध मान 0.3 से अधिक है, तो परीक्षक वायरस के परिणाम सांकेतिक हो सकते हैं लेकिन उन पर भरोसा नहीं किया जा सकता है। जंगली प्रकार के प्रोटीन द्वारा अप्रभावी प्रतिबंध के परिणामस्वरूप यू 937 कोशिकाओं का उपयोग पुनर्गठन (2 सप्ताह के भीतर) से वसूली के बाद बहुत जल्दी किया जा सकता है, या जब वे बहुत पुराने होते हैं (>2-3 महीने)। इन मापदंडों को किसी दिए गए सेल स्टॉक के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है। आमतौर पर, मार्ग जितना कम होता है, उतनी ही मज़बूती से कोशिकाएं अंतर करती हैं और इसलिए SAMHD1 प्रतिबंध के लिए उपयुक्त वातावरण प्रदान करती हैं। SAMHD1-YFP या HIV-RFP के साथ अनुचित संक्रमण स्तर के परिणामस्वरूप मुआवजे और प्रतिबंध अनुपात के डाउनस्ट्रीम निर्धारण दोनों के साथ कठिनाइयों का सामना करना पड़ सकता है। एक उदाहरण चित्र 4 के दाहिने हाथ के पैनलों में चित्रित किया गया है।
यदि नकारात्मक नियंत्रण 1.0 (0.9-1.2 की सीमा के बाहर) से विचलित होता है, तो यह विश्लेषण के साथ एक समस्या का संकेत दे सकता है, या तो संक्रमित कोशिकाओं का अनुपात, गेटिंग रणनीति, या कोशिकाओं का स्वास्थ्य परख को प्रभावित कर रहा है। ऊपर नोट्स देखें।
चित्रा 1: योजनाबद्ध रूपरेखा प्रोटोकॉल। वीएलपी, वायरस जैसे कण, पीएमए, फोरबोल माइरिसिट एसीटेट। क्रमांकित चरण प्रोटोकॉल में चरणों के अनुरूप हैं। BioRender.com का उपयोग करके निर्मित चित्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: रेट्रोवायरल प्लास्मिड का योजनाबद्ध। (ए) पैकेजिंग वैक्टर (बी) ट्रांसफर वैक्टर (सी) वीएसवी-जी लिफाफा एक्सप्रेसर। प्रमुख कोडिंग और नियामक तत्व दिखाए गए हैं। विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। सीएमवी आईई: साइटोमेगालोवायरस तत्काल-प्रारंभिक प्रमोटर, बीजीएच: गोजातीय विकास हार्मोन, पीए: पॉलीए, आरआरई: रेव रिस्पांस एलिमेंट, सीएमवी-एलटीआर: कम्पोजिट सीएमवी-एचआईवी -1 एलटीआर प्रमोटर, पीएसआई: एचआईवी -1 पैकेजिंग सिग्नल, सीपीपीटी / सीटीएस: सेंट्रल पॉलीप्यूरिन ट्रैक्ट / सेंट्रल टर्मिनेशन सीक्वेंस, एसवी 40: सिमियन वैक्यूलेटिंग वायरस 40। BioRender.com का उपयोग करके निर्मित चित्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति। (ए) मुआवजा नियंत्रण: बायां पैनल एफएससी-ए/ एसएससी-ए को अपरिवर्तित, असंक्रमित नियंत्रण के लिए इन-टैक्ट कोशिकाओं पर गेटिंग दिखाता है। केंद्रीय और दाएं पैनल वाईएफपी (मिड) और आरएफपी (दाएं) के लिए एकल-रंग मुआवजा नियंत्रण के स्क्रीनशॉट दिखाते हैं, जिसमें काले रंग में क्षतिपूर्ति डेटा होता है और नीले रंग में क्षतिपूर्ति की जाती है। (बी) उपरोक्त मुआवजा नियंत्रण के लिए संबंधित मुआवजा मैट्रिक्स और भूखंड। (ग) गेटिंग रणनीति। एफएससी-ए/एसएससी-ए (बाएं पैनल) द्वारा सभी कोशिकाओं के विश्लेषण के माध्यम से मलबे को समाप्त किया जाता है। डबल्स को एफएससी ऊंचाई बनाम क्षेत्र (केंद्रीय पैनल) पर गेटिंग करके बाहर रखा जाता है। दाहिना पैनल जंगली प्रकार के SAMHD1 द्वारा एचआईवी -1 प्रतिबंध का एक उदाहरण दिखाता है। अक्ष क्रमशः वाईएफपी (एसएएमएचडी 1) और आरएफपी (एचआईवी) पॉजिटिव कोशिकाओं के अनुरूप क्षतिपूर्ति नीले और पीले लेजर फ्लोरेसेंस दिखाते हैं। क्वाड्रंट गेट आरएफपी और वाईएफपी के लिए नकारात्मक और एकल-रंग नियंत्रणों की तुलना के माध्यम से तैयार किए जाते हैं। संख्याएं माता-पिता की आबादी के प्रतिशत को इंगित करती हैं। जीएफपी के साथ वाईएफपी के लिए मुआवजा मूल्य बहुत अधिक होगा लेकिन उपयुक्त फ़िल्टर सेट का उपयोग करके भेदभाव करना संभव है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: अपेक्षित परिणाम: आदर्श बनाम उप-मानक डेटा। (A) इष्टतम (बाएं) और उप-मानक (दाएं) डेटा के लिए प्रतिनिधि वाईएफपी / आरएफपी प्लॉट। संख्याएं माता-पिता की आबादी के प्रतिशत को इंगित करती हैं। दाएं पैनल में, एचआईवी संक्रमण बहुत कम है जो मुआवजे और गेटिंग के साथ कठिनाइयों का कारण बनता है। प्रतिबंध अनुपात 0.5 पर अपेक्षा से अधिक है। (बी) सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी, लाल) या नकारात्मक नियंत्रण (एचडी 206-7एए, काला) के संबंध में एसएएमएचडी 1 के वेरिएंट के लिए प्रतिबंध अनुपात के प्लॉट। प्रत्येक बिंदु एक प्रतिकृति मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। माध्य और मानक विचलन दिखाए गए हैं। प्रत्येक समूह के बीच युग्मित टी-परीक्षण सभी मामलों में महत्वपूर्ण थे, जहां दिखाया गया था। बाएं: आदर्श डेटा - डब्ल्यूटी लगभग 0.2 का अपेक्षित प्रतिबंध दिखाता है, नकारात्मक 1.0 दिखाता है। वेरिएंट आर 372 डी (ग्रे) डब्ल्यूटी से काफी अलग है लेकिन नकारात्मक नियंत्रण से महत्वपूर्ण नहीं है और इस प्रकार प्रतिबंधित करने की क्षमता खो दी है। दाएं: सबऑप्टिमल डेटा। यहां, नकारात्मक अपेक्षा के अनुसार व्यवहार करता है लेकिन सभी छह प्रतिकृतियों में डब्ल्यूटी केवल 0.5 का प्रतिबंध अनुपात दिखाता है, कम संक्रमण दर के कारण। समूहों के भीतर कम भिन्नता का मतलब है कि आर 143 एच डब्ल्यूटी और नकारात्मक से सांख्यिकीय रूप से अलग एक मध्यवर्ती फेनोटाइप दिखाता है, जबकि जी 209 एस प्रतिबंधित नहीं करता है; हालांकि, इसे ताजा कोशिकाओं के साथ दोहराया जाना चाहिए क्योंकि सकारात्मक नियंत्रण ने अपेक्षित प्रतिबंध अनुपात नहीं दिया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
जैसा कि ऊपर दिए गए नोट्स में चर्चा की गई है, प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलू वीएलपी उत्पादन के लिए सही सेल फेनोटाइप को बनाए रखने और एसएएमएचडी 1 प्रतिबंध का पालन करने के लिए उपयुक्त वातावरण बनाने के आसपास केंद्रित हैं। सबसे पहले, दो-रंग प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रतिबंध का सटीक विश्लेषण ट्रांसड्यूस्ड और संक्रमित कोशिकाओं के उचित अनुपात को प्राप्त करने पर निर्भर करता है ताकि विश्लेषण के लिए प्लॉट के प्रत्येक क्षेत्र में पर्याप्त कोशिकाएं हों। इस प्रकार शोधकर्ता को 1 से कम के एमओआई के लिए लक्ष्य रखना चाहिए ( प्रोटोकॉल देखें)। पारगमन और संक्रमण दर जो या तो बहुत अधिक या बहुत कम हैं, असंक्रमित या दोगुना संक्रमित कोशिकाओं की कमी के कारण विश्लेषण के साथ समस्याएं पैदा करते हैं। समान रूप से, SAMHD1 वैक्टर की तुलना के लिए एक समान पारगमन दर एक ही मुआवजा मैट्रिक्स की अनुमति देने और पूरे प्रयोग पर लागू करने की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे बाद के विश्लेषण में विश्वास बढ़ जाता है।
दूसरे, उपयोग की जाने वाली यू 937 कोशिकाओं की उम्र एक महत्वपूर्ण कारक है कि क्या वे सफलतापूर्वक अंतर करते हैं। पालन के अवलोकन के माध्यम से सफल भेदभाव की निगरानी की जा सकती है, भेदभाव के बाद समय के साथ मीडिया का कम अम्लीकरण और परख में जंगली प्रकार के सकारात्मक नियंत्रण द्वारा पर्याप्त प्रतिबंध। 5 दिनों तक का विभेदन सफल रहा है।
इस परख के प्रमुख लाभों में से एक इसका लचीलापन है। एसएएमएचडी 1 (डोमेन, अमीनो एसिड, प्रजाति अनुक्रम) के विभिन्न प्रकार के संशोधित संस्करणों का परीक्षण वेक्टर या क्लोनिंग के सरल साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस के माध्यम से किया जा सकता है। समान रूप से, परीक्षक वायरस के रूपों का पता लगाया जा सकता है। परख का उपयोग पहले यह प्रदर्शित करने के लिए किया गया है कि डीएनटीपी को बांधने की कम क्षमता वाले एचआईवी -1 रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस म्यूटेंट एसएएमएचडी 1 प्रतिबंध के प्रति अधिक संवेदनशील हैं। SAMHD1 द्वारा अन्य वायरस के प्रतिबंध का परीक्षण करने के लिए एक ही सिद्धांत का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, इंट्रासेल्युलर डीएनटीपी सांद्रता के अलग-अलग भेदभाव की स्थिति या कृत्रिम हेरफेर का उपयोग इंट्रासेल्युलर स्थितियों और एसएएमएचडी 1 गतिविधि के बीच बातचीत की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जो बिशप लैब में सक्रिय अनुसंधान का एक क्षेत्र है। विभिन्न न्यूक्लियोसाइड रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस इनहिबिटर के साथ एसएएमएचडी 1 की बातचीत का भी वर्णन किया गया है, और प्राथमिक कोशिकाओं में उपयोग के लिए संशोधित इस परख का उपयोग करके दिखाए गए एसएएमएचडी 1 के प्रभावको 12,13,14,15।
प्राथमिक कोशिकाओं में उपयोग के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन रूपांतरित कोशिकाओं में चयापचय फेनोटाइप की जांच करके उत्पन्न सीमा को दूर करता है। हालांकि, मौजूदा प्रारूप उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए एक सुविधाजनक और कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण प्रोटोकॉल की अनुमति देता है, खासकर उच्च-थ्रूपुट सैंपलर के साथ फ्लो साइटोमीटर के उपयोग के साथ। प्रोटोकॉल को अनुकूलित करते समय, आंतरिक रूप से अपरिवर्तित कोशिकाओं की संवेदनशीलता को दर्शक प्रभाव (जैसे, प्रतिरक्षा संकेतन) के लिए माना जाना चाहिए।
सेल जीव विज्ञान के कई पहलुओं के साथ, यह आवश्यक है कि इस तरह के परख का उपयोग किसी दिए गए घटना को समझने के लिए समग्र दृष्टिकोण के हिस्से के रूप में किया जाए। SAMHD1 गतिविधि16 के लिए जैव रासायनिक परख का समानांतर उपयोग, इंट्रासेल्युलर dNTP पूल का परिमाणीकरण, और मनुष्यों, पूर्व विवो और पशु मॉडल में SAMHD1 उत्परिवर्ती फेनोटाइप का अवलोकन (दुनिया भर की प्रयोगशालाओं द्वारा किया जा रहा है, कुछ इस मुद्दे में वर्णित हैं) इस जटिल प्रोटीन की विकसित समझ के लिए महत्वपूर्ण हैं।
Disclosures
ओपन एक्सेस के उद्देश्य से, लेखकों ने इस सबमिशन से उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए एक सीसी बीवाई सार्वजनिक कॉपीराइट लाइसेंस लागू किया है। व्यक्त किए गए विचार लेखक (ओं) के हैं और जरूरी नहीं कि वे एनआईएचआर या स्वास्थ्य और सामाजिक देखभाल विभाग के हों।
Acknowledgments
इस काम को फ्रांसिस क्रिक इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित किया गया था, जो कैंसर रिसर्च यूके (एफसी001042 और एफसी001162), यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एफसी001042 और एफसी001162), और वेलकम ट्रस्ट (एफसी001042 और एफसी001162) और जेपीएस (108012 / जेड / जेड / जेड) के लिए वेलकम ट्रस्ट इन्वेस्टिगेटर अवार्ड द्वारा अपना मुख्य वित्त पोषण प्राप्त करता है। कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय में काम एनआईएचआर कैम्ब्रिज बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर, द एवलिन ट्रस्ट (16/21), द रोजट्रीज ट्रस्ट (एम 590), और यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एमआर / एस 009752/1) द्वारा सह-वित्त पोषित था। बाद में यूके वित्त पोषित पुरस्कार यूरोपीय संघ द्वारा समर्थित ईडीसीटीपी 2 कार्यक्रम का हिस्सा है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
| 10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance |
| 12 well plates | Greiner | 665180 | |
| 24 well plates | Greiner | 662160 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
| DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
| DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Flowjo | BD Bioscience | - | alternative analysis software can be used |
| light microscope | - | - | Any bright field light microscope |
| p8.91 | - | - | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
| paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
| polybrene | Sigma | TR-1003 | |
| pKB4 | - | - | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
| pLGatewaySAMHD1eYFP | - | - | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
| pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
- | - | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
| Prism | Graphpad | - | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
| pVSV-G | - | - | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
| RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
| screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
| SCRPSY | - | - | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/ |
| stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
| stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
| TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
| Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
| U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |
References
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