Summary
Este protocolo descreve a extração de compostos orgânicos voláteis de uma amostra biológica com o método de extração sorbent assistido a vácuo, cromatografia gasosa juntamente com espectrometria de massa usando o Entech Sample Preparation Rail e análise de dados. Também descreve a cultura de amostras biológicas e sondagem de isótopos estáveis.
Abstract
Compostos orgânicos voláteis (VOCs) de amostras biológicas têm origens desconhecidas. Os VOCs podem se originar do hospedeiro ou de diferentes organismos de dentro da comunidade microbiana do hospedeiro. Para desembaraçar a origem dos VOCs microbianos, foram realizadas análises voláteis do espaço da cabeça de monoculturas bacterianas e co-culturas de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, e testes estáveis de isótopos em amostras biológicas de fezes, saliva, esgoto e espito. Monoculturas foram utilizadas para identificar a produção volátil de espécies bacterianas individuais ou em combinação com a sondagem de isótopos estáveis para identificar o metabolismo ativo dos micróbios das amostras biológicas.
A extração sorbent assistida a vácuo (VASE) foi empregada para extrair os VOCs. O VASE é um método de extração de espaço livre de solventes fácil de usar, comercializado e livre de solventes para compostos semi-voláteis e voláteis. A falta de solventes e as condições de quase vácuo utilizadas durante a extração tornam o desenvolvimento de um método relativamente fácil e rápido quando comparado a outras opções de extração, como tert-butylation e microextração de fase sólida. O fluxo de trabalho descrito aqui foi usado para identificar assinaturas voláteis específicas de mono-e co-culturas. Além disso, a análise da sondagem estável de isótopos de amostras biológicas associadas humanas identificou CODs comumente ou exclusivamente produzidos. Este artigo apresenta o fluxo de trabalho geral e considerações experimentais do VASE em conjunto com a sondagem estável de culturas microbianas vivas.
Introduction
Compostos orgânicos voláteis (VOCs) têm grande promessa de detecção e identificação bacteriana porque são emitidos de todos os organismos, e diferentes micróbios têm assinaturas exclusivas de VOC. Moléculas voláteis têm sido utilizadas como uma medida não invasiva para a detecção de várias infecções respiratórias, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica1, tuberculose2 na urina3 e pneumonia associada ao ventilador4, além de distinguir indivíduos com fibrose cística (CF) de indivíduos de controle saudável 5,6. Assinaturas voláteis têm sido usadas até mesmo para distinguir infecções específicas de patógenos em CF (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 e S. aureus vs. P. aeruginosa10). No entanto, com a complexidade dessas amostras biológicas, muitas vezes é difícil identificar a fonte de VOCs específicos.
Uma estratégia para desembaraçar os perfis voláteis de micróbios infecciosos múltiplos é realizar a análise do espaço da cabeça de microrganismos tanto na mono-quanto na cocultura11. A análise do headspace examina os analitos emitidos no "headspace" acima de uma amostra em vez daqueles incorporados na própria amostra. Metabólitos microbianos têm sido frequentemente caracterizados em monoculturas devido à dificuldade em determinar a origem dos metabólitos microbianos em amostras clínicas complexas. Ao traçar perfis voláteis de monoculturas bacterianas, os tipos de voláteis que um micróbio produz in vitro podem representar uma linha de base de seu repertório volátil. A combinação de culturas bacterianas, por exemplo, a criação de co-culturas e o perfil das moléculas voláteis produzidas podem revelar as interações ou a alimentação cruzada entre as bactérias12.
Outra estratégia para identificar a origem microbiana de moléculas voláteis é fornecer uma fonte de nutrientes que é rotulada com um isótopo estável. Isótopos estáveis são formas não radioativas de átomos com um número diferente de nêutrons. Em uma estratégia que vem sendo utilizada desde o início da década de 1930 para traçar o metabolismo ativo em animais13, o microrganismo se alimenta da fonte de nutrientes rotulado e incorpora o isótopo estável em suas vias metabólicas. Mais recentemente, um isótopo estável na forma de água pesada (D2O) tem sido usado para identificar S. aureus metabolicamente ativo em uma amostra clínica de escarro CF14. Em outro exemplo, a glicose com 13C foi usada para demonstrar a alimentação cruzada de metabólitos entre os isolados clínicos cf de P. aeruginosa e Rothia mucilaginosa12 .
Com o avanço das técnicas de espectrometria de massa, os métodos de detecção de pistas voláteis passaram de observações qualitativas para medidas mais quantitativas. Usando espectrometria de massa cromatografia gasosa (GC-MS), o processamento de amostras biológicas tornou-se ao alcance da maioria dos ambientes laboratoriais ou clínicos. Muitos métodos para levantamento de moléculas voláteis têm sido usados para traçar o perfil de amostras como alimentos, culturas bacterianas e outras amostras biológicas, e ar e água para detectar contaminação. No entanto, vários métodos comuns de amostragem volátil com alto rendimento exigem solvente e não são realizados com as vantagens proporcionadas pela extração a vácuo. Além disso, volumes ou quantidades maiores (superiores a 0,5 mL) de materiais amostrados são frequentemente necessários para análisede 15,16,17,18,19, embora isso seja específico do substrato e exija otimização para cada tipo e método de amostra.
Aqui, a extração sorbent assistida a vácuo (VASE) seguida de desorção térmica em um GC-MS foi empregada para examinar os perfis voláteis de monoculturas bacterianas e coculturas e identificar voláteis produzidos ativamente com isótopos estáveis sondando de fezes humanas, saliva, esgoto e amostras de escarro (Figura 1). Com quantidades amostrais limitadas, os VOCs foram extraídos de apenas 15 μL de escarro. Experimentos de sondagem de isótopos com amostras humanas exigiram a adição de uma fonte estável de isótopos, como glicose de 13C, e mídia para cultivar o crescimento da comunidade microbiana. A produção ativa de voláteis foi identificada como uma molécula mais pesada pelo GC-MS. A extração de moléculas voláteis sob um vácuo estático permitiu a detecção de moléculas voláteis com maior sensibilidade 20,21,22.
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Protocol
1. Headspace Sorbent Pen (HSP) e considerações de análise de amostras
NOTA: O HSP contendo o sêrbent Tenax TA foi selecionado para capturar uma ampla gama de voláteis. Tenax tem uma menor afinidade com a água em comparação com outros sorbents, o que lhe permite capturar mais VOCs de amostras de maior umidade. Tenax também tem um baixo nível de impurezas e pode ser condicionado para reutilização. A seleção sorbent também foi feita em consideração com a coluna instalada no GC-MS (ver a Tabela de Materiais).
- Gerar controles negativos extraindo mídia e/ou amostrar em branco com as mesmas condições utilizadas para extração de amostras.
- Analise um HSP em branco (previamente confirmado como limpo e livre de fundo significativo) no GC-MS antes de analisar amostras extraídas. Passar em branco entre os tipos de amostra (por exemplo, três réplicas de bactérias monocultura, em branco, três réplicas de co-cultura de bactérias, em branco, etc.).
- Limitar o uso de itens de cuidados pessoais perfumados ou o consumo de alimentos fedidos antes da extração e análise da amostra. O ideal é preparar amostras em um capuz de biossegurança que não tenha sido limpo por álcool ou outros produtos de limpeza voláteis por pelo menos 30 minutos. Ligue o fluxo de ar no capô da biossegurança por 30-60 minutos antes da preparação da amostra.
- Mantenha amostras no gelo para limitar a liberação volátil durante a preparação da amostra.
2. Preparação mono e co-cultura
- No capô da biossegurança, culturas inoculadas de A. baumannii, S. aureus e P. aeruginosa na mídia de crescimento de Todd Hewitt. Incubar durante a noite a 37 °C com agitação de 200 rpm.
- Após a incubação da noite para o dia, realize o manuseio da cultura no capô da biossegurança. Diluir cada cultura à densidade óptica 0,05 a 500 nm.
- Misture co-culturas em partes iguais, e pipeta 200 μL de mídia de controle, mono-, ou co-cultura em cada poço de uma placa de 96 poços, e coloque em incubadora de 37 °C por 24 horas. Prepare uma segunda placa para uma incubação de 48 h.
- Ao final do período de incubação, prepare amostras para extração na seção 4. Culturas líquidas pipetas em tubos de microcentrifuuuagem e armazenam a -80 °C.
NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -80 °C para extrair mais tarde, se necessário.
3. Sondagem de isótopos estáveis na preparação de amostras biológicas
NOTA: As fezes e amostras de saliva foram doadas de doadores anônimos com aprovação do Conselho de Revisão Institucional irvine da Universidade da Califórnia (HS# 2017-3867). O esgoto veio de San Diego, CA. As amostras de escarro foram coletadas de sujeitos com fibrose cística como parte de um estudo maior aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Faculdade de Medicina da Universidade de Michigan (HUM00037056).
- Realize todas as preparações de amostras biológicas no capô da biossegurança.
- Para preparar amostras fecais, adicione 1 mL de água deionizada a 100 mg de fezes em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL e vórtice por 3 min. Coloque no gelo quando não estiver em uso.
- A 15 μL de mistura fecal e de água, adicione 485 μL de meio de Infusão cerebral (BHI) com 20 mM 13C de glicose, ou BHI com 30% de deutério (D2O). Certifique-se de que o volume final da amostra seja de 500 μL. Prepare amostras em triplicados técnicos.
- Para preparar amostras de esgoto, adicione 500 μL de esgoto a 500 μL de BHI com 20 mM 13C de glicose ou BHI com 30% D2O para um volume total de 1 mL. Prepare amostras em triplicado. Coloque no gelo quando não estiver em uso.
- Para preparar amostras de saliva, adicione 50 μL de saliva a 500 μL de BHI com 20 mM 13C de glicose ou BHI com 30% D2O para um volume total de 550 μL. Prepare amostras em triplicado. Coloque no gelo quando não estiver em uso.
- Para preparar amostras de escarro para comparar os voláteis presentes na amostra antes e depois da colheita, realize uma primeira extração com 15 μL de escarro. Prepare amostras em triplicado. Coloque no gelo quando não estiver em uso. Prossiga para a seção 4 para extração amostral e extraia por 18 h a 37 °C com agitação de 200 rpm.
- Após a conclusão da primeira extração das amostras de escarro nãoculturadas, salve os frascos com escarro. Adicione 500 μL de BHI com 20 mM 13C de glicose aos frascos com escarro de 3,5,1. Coloque no gelo quando não estiver em uso.
- Para preparar amostras fecais, adicione 1 mL de água deionizada a 100 mg de fezes em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL e vórtice por 3 min. Coloque no gelo quando não estiver em uso.
- Prossiga para a seção 4 para extração amostral.
4. Extração da amostra
- Coloque frascos de análise orgânica volátil vazio (VOA) (20 mL) na placa fria e coloque a placa fria no gelo no capô da biossegurança.
- Ligue a unidade de extração de caneta sorbent 5600 (SPEU) e ajuste à temperatura desejada conforme necessário para cada método.
NOTA: Para experimentos de sondagem de isótopos estáveis a 37 °C, atingir o ponto de setpoint pode levar até 15 min. Para experimentos mono e co-cultura a 70 °C, chegar ao setpoint pode levar até 60 min. - Colete HSPs limpos que sejam iguais ao número de amostras preparadas, incluindo HSPs para controles de mídia ou amostra.
- Rotular frascos VOA de 20 mL de acordo com amostras, réplicas e IDs HSP conforme necessário. Use um marcador que resista à água no caso de condensação se formar na parte externa do frasco enquanto estiver no gelo.
- Dentro do capô de biossegurança, desaparafusar a tampa branca no frasco, rapidamente tubos amostrado no frasco, e montar a tampa preta, forro de tampa e HSP.
NOTA: As amostras não devem entrar em contato com o HSP, e o volume da amostra dependerá do tipo de amostra. - Coloque o frasco contendo a amostra e o HSP de volta na placa fria.
- Repita as etapas 4.5 e 4.6 para cada amostra. Execute essas etapas por amostra em vez de todas de uma vez para evitar o aquecimento da amostra e, portanto, a liberação volátil prematura.
- Uma vez que todas as amostras tenham sido preparadas nos frascos de vidro, realize os seguintes passos fora do capô de biossegurança no banco. Ligue a bomba de vácuo, coloque os frascos sob vácuo até 30 mmHg e remova a fonte de vácuo.
NOTA: Os frascos não precisam estar na bandeja fria após a aplicação do vácuo ter sido concluída. - Verifique novamente a pressão depois de colocar todas as amostras sob vácuo usando o medidor de pressão. Se um frasco tiver um vazamento, certifique-se de que a tampa está aparafusada firmemente, e que os anéis O brancos do HSP e dos forros da tampa estejam corretamente no lugar.
NOTA: Um selo comprometido pode resultar em diminuição da detecção volátil em comparação com um frasco sob vácuo. - Coloque frascos na SPEU para o tempo e temperatura otimizados com agitação a 200 rpm. Extrair culturas por 1h a 70 °C. Extrair experimentos de sondagem de isótopos estáveis com amostras fecais, de esgoto, saliva e escarro por 18 h a 37 °C.
- Coloque a placa fria a -80 °C para uso após o período de extração estiver completo.
- Quando a extração estiver completa, coloque amostras na placa fria por 15 minutos para extrair vapor de água do HSP e do espaço para a cabeça do frasco.
- Transfira os HSPs para as mangas.
NOTA: O experimento pode ser pausado aqui por até ~1 semana em temperatura ambiente antes de perder os compostos mais altamente voláteis dos HSPs.
5. Analisar amostras na cromatografia gasosa - espectrômetro de massa (GC-MS)
- Use as seguintes configurações GC-MS (veja a Tabela de Materiais): 35 °C com uma carga de 5 minutos, rampa de 10 °C/min a 170 °C e uma rampa de 15 °C/min para 230 °C com uma proporção de 20:1 e um tempo total de execução de 38 min.
- Defina o método de desorção da seguinte forma: 2 min, 70 °C pré-aqueça; 2 min 260 °C desorção; 34 min, 260 °C bakeout; e 2 min, 70 °C pós assado.
- Configure a sequência de amostras e inicie a execução de acordo com a instrumentação.
- Para configurar uma sequência no Software Entech, abra o programa. Nas opções à direita do menu suspenso do instrumento, selecione 5800 | Sequência.
- Observe a tabela de sequência no software Entech semelhante ao do software GC-MS. Nomeie a coluna Sample ID de acordo com o número de date_vial atual. Tenha em mente que o nome é análogo ao nome na tabela de sequência GC-MS, e o método 5800 determina a taxa de rampa de temperatura, tempos de retenção, etc. (abre um menu para selecionar o método gerado na etapa 5.2).
- Tenha em mente que as colunas Bandeja e Posição determinam para onde o Trilho de Preparação de Amostras (SPR) irá para pegar os HSPs.
- Observe as duas bandejas com 30 pontos cada para a esquerda imediata, dispostas como seis colunas com cinco pontos cada. A posição da bandeja que é mais esquerda e mais próxima do usuário (frente) é a posição 1, enquanto a mais à direita, mais distante é a posição 30.
- Observe que essas bandejas são HSP A ou B, onde HSP B é a bandeja mais próxima da SPR (bandeja mais interna), e logo atrás do HSP B está HSP Blank. Coloque as amostras extraídas nas bandejas e selecione o local na sequência de acordo.
- Salve a tabela de sequência, selecione Executar no lado esquerdo e , em seguida, Comece com branco em desorber se o HSP em branco estiver no desorber (denotado por um HSP marcado por rótulo amarelo).
- Observe que os HSPs serão manipulados pelo SPR para cada amostra na sequência. Deixe o SPR aquecer, então uma mensagem aparecerá na parte superior da tela para confirmar se o espaço em branco está no desorber. Clique em Skip para confirmar se a caneta está lá. Permita que o SPR execute todas as amostras automaticamente, e a sequência no lado GC-MS gravará automaticamente os dados em arquivos separados.
6. Análise de dados
- Dados de filtro de qualidade no software GC-MS (Tabela de Materiais).
- Revise cada pico no cromatógrafo e anote picos que correspondem à biblioteca do Instituto Nacional de Padrões & Tecnologia (NIST) (ou com outra biblioteca disponível).
- Adicione picos de cromatograma anotados ao método de processamento. Defina os critérios para a seleção de picos para incluir compostos com maior probabilidade superior a 75%, e garantir que o alinhamento de cada íon identificador do composto esteja dentro do centro do pico.
- Para adicionar um pico ao método de processamento, selecione Calibrar | Editar | composto Nome | inserir composto sob composto padrão externo. Adicione o nome do composto, tempo de retenção, Quant Signal Target Ion. Adicione os três maiores picos. Para salvar, selecione ok | | de método Salve.
- Uma vez que o método de processo seja configurado, proceda a Quantitate | Calcule e veja | Resultado de QEdit Quant.
- Inspecione cada composto para garantir que os picos estejam alinhados com seus tempos de retenção esperados e estejam acima do ruído de fundo.
- Uma vez que o QEdit tenha sido concluído, selecione Saída | Sim , para salvar os QEdits e voltar ao cromatógrafo principal. Exporte as integrações da área abrindo o arquivo no lado esquerdo. Selecione | quantitato Gerar Relatório.
- Para exportar arquivos para uso no DExSI, selecione | de arquivos Dados de exportação para | de formato AIA Crie novo diretório e selecione um local para o arquivo ou use diretório existente.
- Observe uma nova janela se abrindo para selecionar arquivos para exportação. Mova os arquivos para o lado direito da janela e clique em Process. Aguarde alguns segundos a alguns minutos, dependendo do número de arquivos sendo convertidos.
- Corrija a abundância de isótopos no DExSI de acordo com as instruções para o software DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI) e realize a análise com um software ou programa favorito (por exemplo, R). Os scripts usados para gerar as figuras estão localizados em https://github.com/joannlp/
VOC_SIP .
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Representative Results
Mono-e co-culturas de S. aureus, P. aeruginosa, e A. baumannii
As monoculturas consistiam das espécies bacterianas S. aureus, P. aeruginosa e A. baumannii. Estes são patógenos oportunistas comuns encontrados em feridas humanas e infecções crônicas. Para identificar as moléculas voláteis presentes nas monoculturas e coculturas, foi realizada uma pequena extração de 1 h a 70 °C com agitação de 200 rpm. Das monoculturas e coculturas em pontos de tempo de 24 e 48 horas, foram detectadas 43 moléculas voláteis anotadas (Figura 2) entre as quais aldeídos, cetonas, álcoois, compostos sulfúricos, hidrocarbonetos, ácidos carboxílicos ou ésteres e aromáticos. Havia um pequeno número de moléculas voláteis que só foram detectadas em certas monoculturas ou co-culturas em determinados momentos. Por exemplo, acetoína e acetato de 3-hidroxi-2-butanona só foram detectados nas culturas S. aureus no ponto de tempo de 48h (Figura 2).
Volátil 1-propanol 2-metil foi detectado apenas na co-cultura P. aeruginosa e A. baumannii a 48 h (Figura 2). O acetato etílico esteve presente em co-culturas A. baumannii com S. aureus ou P. aeruginosa a 48 h (Figura 2). Os metabólitos heptano, 2,3-dimetila e pentano, 2-metil só foram detectados na cultura A. baumannii às 24 h (Figura 2). Acetaldeído e etanol apresentaram maiores abundâncias relativas na cocultura A. baumannii e S. aureus no ponto de tempo de 24h em comparação com 48 h e qualquer uma das cepas apenas na cultura (Figura 2). Alguns dos voláteis eram mais abundantes em culturas no ponto de tempo de 24 ou 48 h. Os ácidos graxos de cadeia curta, incluindo ácido acético, ácido butanoico e ácido propanoico, estavam em altas abundâncias relativas em culturas a 48 h, mas não foram detectados nas culturas 24h (Figura 2). A hexana foi mais abundante no controle de TH em 24 h em comparação com 48 h (Figura 2).
Rotulagem estável de isótopos de amostras fecais, de esgoto e saliva
Para identificar a produção ativa de moléculas voláteis de uma amostra biológica, uma fonte de nutrientes rotulada, 13C de glicose ou D2O, e mídia foram adicionadas para apoiar o crescimento da comunidade microbiana. Uma amostra única foi analisada de cada um dos diferentes tipos de amostras de amostras fecais, esgoto e saliva em triplicado. Houve mais incorporação dos 13C em moléculas voláteis totalmente rotuladas (Figura 3A-D) em comparação com a incorporação com deutério (Figura 3E). O 13C foi incorporado em 2-butanona, 3-hidroxi; 2,3-butanedione; ácido acético; e fenol para todas as amostras fecais, de esgoto e saliva (Figura 3A).
Os outros voláteis rotulados foram detectados em dois ou um tipos de amostra. Por exemplo, acetona, ácido butanoico e ácido propanoico foram detectados como rotulados em saliva e esgoto (Figura 3B). Os voláteis rotulados, trissulfeto de dimetila e dimetil dissulfeto, foram enriquecidos em amostras fecais e saliva (Figura 3C). Os voláteis, 1-propanol, 2-butanona, benzofenona, etanol e tiolacetato de metila, foram enriquecidos apenas no esgoto (Figura 3D). O volátil rotulado, 2,3-pentanedoine, foi enriquecido em saliva (Figura 3D). O deutério foi incorporado aos voláteis, ácido acético; benzaldeído, 4-metil; trissulfeto dimetil; e fenol, de amostras de saliva ou esgoto (Figura 3E). Além dos voláteis enriquecidos com isótopos, foram detectados voláteis que não continham isótopos estáveis incorporados. Por exemplo, compostos de pirazina, exceto a pirazina, 2,5-dimetila, foram detectados em amostras fecais, de esgoto e saliva, mas não foram totalmente enriquecidos com 13C (Figura Suplementar S1).
Rotulagem estável de isótopos de amostras de escarro
A estratégia estável de rotulagem de isótopos foi implementada para identificar voláteis produzidos ativamente com amostras de escarro de sete indivíduos humanos com fibrose cística. Os voláteis da amostra foram comparados com aqueles que emergiram de amostras cultivadas com rótulo de isótopo estável. Cada componente volátil de cada amostra foi analisado duas vezes: antes e depois de sondagem estável de isótopos com glicose e mídia de 13C. As amostras coletadas dos sujeitos abrangeram três pontos de tempo diferentes ou estados clínicos: linha de base, exacerbação e tratamento23. Os voláteis detectados como rotulados nas amostras de escarro cultivadas tinham diferentes abundâncias relativas em comparação com os voláteis não rotulados das amostras de escarro não cultivadas. As condições de cultivo nos experimentos de sondagem de isótopos estáveis com escarro podem favorecer o crescimento de certos micróbios, levando a diferenças em abundâncias relativas de voláteis em comparação com as amostras de escarro nãoculturadas.
Por exemplo, ácido acético, trissulfeto de dimetila, acetona e propanal, 2-metil foram mais abundantes nas amostras de escarro cultivada em comparação com as amostras de escarro não cultivadas (Figura 4). A detecção de 13etanol rotulados em C, que pode estar presente em quantidades variáveis no ar da sala de fundo, fornece evidências de que o etanol foi produzido ativamente pelo metabolismo microbiano a partir de 13C de glicose. A quantidade de variação foi explicada pelo sujeito avaliado pela Análise Multivariada Permutacional de Variância (PERMANOVA) e também foi diferente para os dois diferentes conjuntos de dados voláteis (Tabela 1 e Figura Suplementar S2). Para a escarro cultivada de 13C, 51% da variação foi explicada pelo sujeito, enquanto 33% da variação foi explicada pelo sujeito dos voláteis nas amostras de escarro não cultivadas (Tabela 1). A composição da comunidade de microbiomas determinada pelo sequenciamento de amplicon de 16S rRNA dos sete sujeitos foi única para cada sujeito (Figura Suplementar S3), e as assinaturas individuais também foram refletidas nas moléculas voláteis de escarro cultivadas e não cultivadas detectadas.
Em escarro cultivado, foram detectados 23 voláteis que foram totalmente rotulados com 13carbonos. Os voláteis enriquecidos com isótopos (ativos) detectados a partir das amostras de escarro foram diferentes para cada sujeito. Os voláteis com enriquecimento de isótopos detectados nas amostras de escarro de todos os sete indivíduos foram de 2,3 butanedione; ácido acético; acetona; trissulfeto dimetil; dissulfeto, dimetil; e pirazina, 2,5-dimetila (Figura 5). Embora esses voláteis tenham sido detectados em todos os sujeitos, o enriquecimento de isótopos para cada sujeito variou. Amostras do sujeito 7 apresentaram maior enriquecimento de isótopos de dimetil dissulfeto em comparação com os outros seis indivíduos (Figura 5B). A acetona foi maior nos sujeitos 4 e 6 (Figura 5). Alguns voláteis foram enriquecidos com 13C apenas em certos assuntos. Por exemplo, 1-butanol, 3-metil e ácido propanoico, 2-metil só foram enriquecidos em um subconjunto de amostras do sujeito 2 (Figura 5). Além dos voláteis enriquecidos com isótopos, havia voláteis também detectados como deslacredos da mesma escarro cultivada (Figura Suplementar S4). Voláteis 2-piperidina; benzaldeído, 4-metil; benzotiazol; ácido butanoico, 3-metil; hexanal; hexana; álcool isopropílico; fenol; ácido propanoico, 2-metil; e pirrolo 1,2-apyrazine-1,4-dione, hexahidro foram detectados nas amostras de escarro, mas não foram enriquecidos com isótopos (Figura Suplementar S4).
Figura 1: Esquema de protocolo. Uma amostra biológica é colocada em um frasco de vidro e montada com o forro da tampa e a caneta sorbent headspace. Um vácuo é aplicado no frasco até que uma pressão de aproximadamente 30 mmHg seja atingida. A fonte de vácuo é removida, e os frascos são colocados na unidade de extração de caneta sorbent onde uma extração estática é realizada com o auxílio de calor, agitação e tempo. Após a extração, os frascos são colocados em um bloco de metal frio para remover a água do espaço para a cabeça e do HSP. Os HSPs são coletados e executados via desorção térmica no GC-MS. Os dados são analisados com abreviaturas ChemStation, DExSI e R.: HSP = Headspace Sorbent Pen; GC-MS = espectrometria de massa cromatografia gasosa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Mapa de calor de monoculturas e co-culturas. OS VOCs detectados a partir de monoculturas em pontos de tempo de 24 e 48 h. As co-culturas são as combinações das letras que representam cada cepa. Todas as amostras foram extraídas por 1h a 70 °C com agitação de 200 rpm. Os valores de intensidade do mapa de calor são escores da coluna Z, normalizados por metabólito. O escore Z foi calculado pela diferença de valor da média dos valores, dividida pelo desvio padrão dos valores. O dendrograma foi gerado com a opção cluster_cols na função featmap de R. O dendrograma representa um agrupamento hierárquico no qual metabólitos que se agrupam têm pontuações Z mais semelhantes entre as amostras. Abreviaturas: A = A. baumanii; P = P. aeruginosa; S = S. aureus; TH = Mídia todd hewitt (controle). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Conversão percentual de 13C em massa de moléculas voláteis em amostras fecais, saliva e esgoto durante 18 h de incubação e extração simultâneas. A conversão % foi calculada para compostos totalmente rotulados, tomando a massa do composto totalmente rotulado (M+N) e dividindo-a por (M+N) + a massa da massa volátil sem rótulo (M), onde N é o número máximo de possíveis carbonos (em A-D) ou hidrogênios (em E) que podem ser rotulados em cada molécula volátil. Os compostos são considerados totalmente rotulados quando todos os carbonos do volátil são substituídos por 13C. Onde faltam dados, o volátil não foi detectado. Por exemplo, em (D), 1-propanol não foi detectado em amostras fecais ou saliva. Número de réplicas por amostra = 3. (A) Os voláteis com 13C detectados em todos os tipos de amostra (fezes, saliva e esgoto). (B) Os voláteis com 13C só detectados em amostras de saliva e esgoto. (C) Os voláteis com 13C detectados em fezes e amostras de saliva. (D) Os voláteis com 13C detectados em um dos três tipos de amostra diferentes. (E) As moléculas voláteis rotuladas por deutério. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Mapa de calor de 13voláteis rotulados por C de escarro cultivado e moléculas voláteis detectadas a partir de escarro não cultivado. Os voláteis rotulados vêm dos experimentos de sondagem de isótopos estáveis, onde 13C de glicose e meio de infusão cardíaca cerebral foram adicionados à escarro durante a etapa de extração para cultivar o crescimento microbiano e capturar a produção volátil ativa. As moléculas voláteis não rotuladas foram detectadas diretamente a partir de amostras de escarro. As intensidades do mapa de calor são pontuações Z como descrito na legenda da Figura 2. No entanto, os escores Z foram calculados dentro de cada experimento para os experimentos de escarro cultivados e não cultivados. O dendrograma foi gerado como descrito na Figura 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Conversão percentual de 13C em massa de moléculas voláteis em amostras de escarro de sete indivíduos com fibrose cística durante 18 h de incubação e extração simultâneas. A conversão % foi calculada conforme descrito na legenda da Figura 3. Os voláteis não detectados nas amostras são indicados pela ausência de dados. N = 1-3. (A) Os voláteis com 13C detectados em uma conversão percentual maior na maioria das amostras de escarro. (B) Os voláteis com 13C detectados em uma conversão percentual menor na maioria das amostras de escarro. (C) Os voláteis com 13C detectados em uma conversão percentual menor em uma minoria das amostras de escarro. Abreviaturas: B = linha de base; E = exacerbação; T = tratamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Graus de Liberdade | R2 | Valor P | ||
| Escarro não esculpido | Assunto | 6 | 0.33 | 0.001 |
| Estado Clínico | 2 | 0.01 | 0.46 | |
| Assunto: Estado clínico | 12 | 0.12 | 0.092 | |
| Escarro cultivado com glicose e mídia de 13C | Assunto | 6 | 0.51 | 0.001 |
| Estado Clínico | 2 | 0.02 | 0.095 | |
| Assunto: estado clínico | 12 | 0.11 | 0.194 |
Tabela 1: Análise multivariada permutada de variância (PERMANOVA) de amostras de escarro. A PERMANOVA foi gerada utilizando a função adonis do pacote vegano em R.
Figura Suplementar S1: As abundâncias relativas de voláteis rotulados (M+N(max)) e não rotulados (M+0) através de amostras fecais, saliva e esgoto. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S2: Dimensionamento multidimensional não métrico de escarro cultivado com sondagem estável de isótopos e escarro não cultivado. (A) O NMDS de escarro cultivado com glicose de 13C e mídia foi gerado com k = 3 dimensões. O valor do estresse foi de 0,07. (B) O NMDS de escarro nãocultado foi gerado com k = 3 dimensões. O valor do estresse foi de 0,13. Abreviaturas: NMDS = dimensionamento multidimensional não métrico; B = linha de base; E = exacerbação; T = tratamento. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura Suplementar S3: Composição comunitária microbiana de amostras de escarro de indivíduos com fibrose cística. Avaliado pelo sequenciamento de amplicon de rRNA 16S como parte de um estudo maior, mais informações sobre abordagem encontrada em Carmody et al. 202019. de sujeitos com fibrose cística. Cada barra empilhada é um ponto de tempo diferente. Abreviaturas: B = linha de base, E = exacerbação, T = tratamento. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S4: As abundâncias relativas de voláteis rotulados (M+N(max)) e não rotulados (M+0) em amostras de escarro de sete indivíduos com fibrose cística. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Para identificar a produção volátil em culturas in vitro e amostras associadas ao homem, foram realizadas análises voláteis de monoculturas de P. aeruginosa, S. aureus e A. baumanii e isótopos estáveis de diferentes amostras biológicas. Na análise para as monoculturas e coculturas, os voláteis foram detectados realizando uma extração curta por 1h a 70 °C. A análise volátil das monoculturas e coculturas permitiu o levantamento dos compostos produzidos tanto por espécies individuais quanto durante suas interações com outras espécies. Houve diferenças nas abundâncias relativas entre os diferentes tipos de cultura e pontos de tempo. Nos experimentos de sondagem de isótopos estáveis, as amostras biológicas incluíram fezes e saliva de indivíduos saudáveis, esgoto e escarro de indivíduos com fibrose cística. O perfil de isótopos estáveis permitiu a identificação de moléculas voláteis produzidas ativamente extraindo por 18 h a 37 °C. O longo tempo de extração com temperatura mais baixa possibilitou o crescimento e o metabolismo dos micróbios presentes nas amostras biológicas. Comparando os enriquecimentos de glicose de 13C e D2O mostraram que houve enriquecimento de isótopos mais extenso com 13C rotulados.
Ao extrair diferentes tipos de amostras, houve etapas iniciais de otimização tomadas antes de iniciar uma execução completa. Primeiro, teste diferentes volumes de uma amostra como um teste. Para alguns tipos de amostra, escarro, por exemplo, apenas pequenos volumes amostrais estavam disponíveis. Recomenda-se começar com um volume menor ou menor quantidade de amostra primeiro, dependendo do tipo de amostra e das quantidades de amostra disponíveis. Não extraia um grande volume ou muito da amostra porque pode sobrecarregar a coluna e contaminar o HSP. A sobrecarga da coluna pode ser evidente quando os picos do cromatógrafo estão saturados ou aparecem em corridas subsequentes. A contaminação por HSP ocorreu se a transferência estiver presente quando o HSP for re-executado no GC-MS. Nos experimentos de monocultura e cocultura, 200 μL de cultura foram suficientes para detectar uma variedade de voláteis. Nos experimentos de sondagem de isótopos estáveis, dependendo do tipo de amostra, o volume para cada experimento variou de 500 μL a 1 mL. Em segundo lugar, dependendo do tipo de amostra e dos compostos de interesse, o tempo e a temperatura da extração, bem como os métodos de deserção térmica e GC-MS, precisarão ser ajustados para otimizar a detecção volátil. Esses métodos foram determinados como adequados para os analitos de interesse e tipo de coluna.
Após a otimização do método, as etapas críticas do protocolo pertenciam às etapas anteriores e seguintes à extração. Durante a preparação da amostra, foram colocadas amostras no gelo para que os voláteis presentes na amostra não escapassem. Também era importante ter certeza de que o selo de vácuo estava apertado, e a tampa estava bem fechada. Caso contrário, haveria uma extração ineficiente e diminuição da detecção dos voláteis da amostra. Vazamentos podem surgir dos anéis O ao redor do forro da tampa ou do HSP. Para garantir que o frasco estivesse sob vácuo, um medidor foi usado antes da extração para garantir que os anéis O ainda estivessem funcionais. Além disso, após a extração, foram colocadas amostras no bloco de gelo para que a água fosse retirada do espaço da cabeça por um determinado período. A água na coluna pode levar a alterações nos tempos de retenção e supressão da resposta em MS, levando a resultados não quantitativos. A capacidade de retirar qualquer excesso de água dos HSPs antes da remoção da mmontagem da manga de vácuo/frasco é possível devido à natureza do sistema fechado do processo VASE, e à capacidade de extrair água de volta para o ponto mais frio dentro desse sistema de extração usando a placa fria de -80 °C.
Existem limitações e vantagens para esses métodos no que diz respeito a métodos alternativos. Avaliando os experimentos de monocultura e cocultura, foram detectadas assinaturas voláteis específicas para um micróbio ou cocultura particular. Houve também mudanças em abundâncias voláteis ao longo do tempo. Quanto aos experimentos de sondagem de isótopos estáveis nos diferentes tipos de amostras biológicas, a rotulagem deutério não resultou em tantos voláteis enriquecidos com isótopos quanto 13C de glicose. O metabolismo necessário para produzir voláteis enriquecidos com isótopos com deutério pode ser mais limitado. Além disso, a mídia foi adicionada às amostras biológicas para melhorar o crescimento microbiano, o que pode levar a mudanças na composição da comunidade microbiana. As condições culturais de experimentos de sondagem de isótopos estáveis podem estar selecionando para o crescimento favorecido de certos micróbios em uma amostra biológica. Isso se opôs à extração curta por uma hora a 70 °C projetada para detectar os voláteis na amostra da comunidade antes que um ou poucos dos micróbios comecem a assumir a comunidade. A complexidade das composições microbianas e químicas dos tipos de amostras fecais, de esgoto, saliva e escarro dificultam a atribuição de assinaturas químicas específicas a qualquer origem microbiana ou humana sem análises adicionais, como sequenciamento. Este método forneceu uma extração a vácuo de alto rendimento, sem solventes, que levou à detecção mais sensível de amostras de baixo volume. Os volumes utilizados para esses experimentos variaram de 200 μL a 1 mL de amostras biológicas cultivadas. Em outros casos (dados não apresentados), foram extraídas amostras biológicas (por exemplo, escarro e amostras fecais) tão baixas quanto 15 μL ou 10 μg.
Para aplicações futuras do método, uma ampla gama de tipos de amostras poderia ser analisada com volumes pequenos ou limitados. Dezenas de amostras poderiam ser extraídas simultaneamente, e o tempo de execução dependeria dos parâmetros do instrumento GC-MS específico. No caso da sondagem de isótopos estáveis, quando juntamente com sequenciamento metagenômico, há a possibilidade de identificar os micróbios responsáveis pela produção das moléculas voláteis. O metagenome da amostra biológica pode ser sequenciado antes e depois da extração com sondagem estável de isótopos para identificar alterações na composição da comunidade microbiana. O sequenciamento metagenômico permitiria a identificação de genes responsáveis pela produção do isótopo enriqueceu moléculas voláteis. Destacados aqui estão alguns exemplos dos tipos de amostra e abordagens que poderiam ser utilizadas como insumo para o protocolo apresentado, que já foi estabelecido em diferentes indústrias. Como moléculas voláteis são importantes indicadores diagnósticos, o uso desse protocolo poderia ser expandido para laboratórios biológicos e ambientes clínicos de saúde.
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Disclosures
V. L. V e S.J.B. D. foram ex-funcionários da Entech Instruments Inc., e K. W. é membro do Programa Universitário da Entech. J.P., J.K., e C.I.R. não têm conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Heather Maughan e Linda M. Kalikin pela edição cuidadosa deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo NIH NHLBI (grant 5R01HL136647-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) - blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
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