Captura de compuestos orgánicos volátiles microbianos producidos activamente a partir de muestras asociadas con humanos con extracción de sorbente asistida por vacío

Este protocolo nos permite concentrar e identificar fácilmente metabolitos volátiles y volátiles producidos activamente a partir de organismos microbianos en una variedad de muestras biológicas. VASE es un método más fácil de usar para concentrar volátiles de baja abundancia. Todo lo que necesita es una muestra bajo casi vacío, y deje que la física haga el resto.

El acceso al análisis volátil de muestras clínicas tiene implicaciones importantes para el descubrimiento de biomarcadores metabólicos en varios estados de enfermedad diferentes. Por ejemplo, el patógeno que conduce y la infección o el éxito de la terapia antibacteriana podría detectarse con análisis volátiles de saliva, esputo o muestras de aliento. Para preparar muestras fecales, agregue un mililitro de agua desionizada a 100 miligramos de heces en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros y vórtice durante tres minutos.

Mantenga las muestras en hielo cuando no esté en uso. Añadir 485 mililitros de medio BHI con glucosa 13C 20 milimolar o BHI con 30%deuterio a 15 microlitros de mezcla fecal y de agua, asegurando que el volumen final de la muestra sea de 500 microlitros. Preparar muestras en triplicados técnicos.

Para preparar muestras de aguas residuales, agregue 500 microlitros de aguas residuales a 500 microlitros de medio BHI con glucosa 13C o 30% de deuterio para un volumen total de un mililitro. Preparar muestras por triplicado y mantenerlas en hielo. Para preparar muestras de saliva, agregue 50 microlitros de saliva a 500 microlitros de medio BHI con glucosa 13C o 30% de deuterio para un volumen total de 550 microlitros.

Preparar muestras por triplicado y mantenerlas en hielo. Para preparar muestras de esputo, agregue 15 microlitros de esputo en un vial. Preparar muestras por triplicado y mantenerlas en hielo.

Coloque los viales vacíos de VOA en la placa fría y coloque la placa fría sobre hielo en la campana de bioseguridad. Encienda el 5600 SPEU y ajústelo a la temperatura requerida. Etiquete los viales de VOA de 20 mililitros de acuerdo con las muestras, réplicas e identificaciones HSP utilizando un marcador resistente al agua que resiste el agua en caso de que se forme condensación en el exterior del vial mientras está en hielo.

Dentro de la campana de bioseguridad, desenrosque la tapa blanca del vial, inserte rápidamente la muestra de pipeta en el vial y ensamble el revestimiento de la tapa, la tapa negra y el HSP. Coloque el vial que contiene la muestra y la HSP de nuevo en la placa fría. Una vez que todas las muestras se hayan preparado en los viales de vidrio, encienda la bomba de vacío, coloque los viales al vacío y retire la fuente de vacío.

Verifique la presión después de colocar todas las muestras al vacío utilizando el manómetro. Si hay fugas en un vial, asegúrese de que la tapa esté bien atornillada y de que las juntas tóricas blancas del HSP y los revestimientos de la tapa estén correctamente en su lugar. Coloque los viales en el SPEU para el tiempo y la temperatura optimizados con agitación a 200 RPM.

Extraiga cultivos durante una hora a 70 grados Celsius y extraiga experimentos de sondeo de isotipos estables con muestras fecales, aguas residuales, saliva y esputo durante 18 horas a 37 grados Celsius. Coloque la placa fría a menos 80 grados centígrados para usarla después de que se complete el período de extracción. Cuando se complete la extracción, coloque las muestras en la placa fría durante 15 minutos para extraer el vapor de agua del HSP y el espacio de cabeza del vial, luego transfiera los HSP a sus mangas.

Configure la secuencia de muestras en el software Entech. Abra el programa y seleccione 5800 y Secuencia en las opciones a la derecha del menú desplegable Instrumento. Guarde la tabla de secuencia, seleccione Ejecutar en el lado izquierdo y, a continuación, Iniciar con espacio en blanco en desorber si el HSP en blanco no es el desorbente.

Tenga en cuenta que los HSP serán manejados por el SPR para cada muestra en la secuencia. Deje que el SPR se caliente. Permita que el SPR ejecute todas las muestras automáticamente.

La secuencia en el lado GC-MS registrará automáticamente los datos en archivos separados. Agregue un pico al método de procesamiento seleccionando Calibrar seguido de Editar compuesto, Nombre e Insertar compuesto en Compuesto estándar externo. Agregue el nombre de los compuestos, el tiempo de retención y el ion objetivo de la señal cuantitativa.

Agregue los tres picos más grandes, que incluyen compuestos con una probabilidad superior al 75%, asegurando que la alineación de cada ion identificativo del compuesto se encuentre dentro del centro del pico. Guárdelo seleccionando Aceptar, seguido de Método y Guardar. Una vez configurado el método de proceso, vaya a Cuantificar y calcular, luego Ver y QEDIT Quant Result para cuantificar los datos.

Aquí, la extracción de sorbentes asistida por vacío fue seguida por la desorción térmica en un GC-MS para estudiar los perfiles volátiles de mono y cocultivos bacterianos, e identificar volátiles producidos activamente con sondeo de isótopos estables a partir de heces humanas, saliva, aguas residuales y muestras de esputo. Los monocultivos y cocultivos consistieron en las especies bacterianas staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa y acinetobacter baumannii. Se detectaron 43 moléculas volátiles anotadas de los monocultivos y cocultivos en puntos de tiempo de 24 y 48 horas.

Hubo más incorporación de 13C en moléculas volátiles completamente marcadas en comparación con el deuterio. 13C se incorporó en 2-butanona, 3-hidroxi, 2, 3-butanediona diacetilo, ácido acético y fenol para todas las muestras fecales, residuales y saliva. La acetona, el ácido butanoico y el ácido propanoico se detectaron como etiquetados en la saliva y las aguas residuales.

mientras que el trisulfuro de dimetilo y el dimetilo disulfuro se enriquecieron en muestras fecales y de saliva. Los volátiles 1-propanol, 2-butanona, benzofenona, etanol y acetato de metiltiol se enriquecieron solo en aguas residuales y 2, 3-pentanediona en saliva. El deuterio se incorporó a los volátiles ácido acético, benzaldehído, trisulfuro de 4-metil-dimetilo y fenol de muestras de saliva o aguas residuales.

El ácido acético, el trisulfuro de dimetilo, la acetona y el propanol 2-metilo fueron más abundantes en las muestras de esputo cultivadas que en las muestras de esputo no cultivadas. Se realizó un análisis multivariante permutado de variantes, un PERMANOVA, en una matriz de distancia de Bray-Curtis de las abundancias volátiles de las muestras de esputo de fibrosis quística. Encontramos que el sujeto que donó la muestra explica el 51% de la variación en el esputo cultivado marcado con 13C y el 33% de la variación en el esputo no cultivado.

Aquí, se muestra el éxito del etiquetado de isótopos estables con glucosa 13C en volátiles a partir de muestras de esputo cultivadas recolectadas de siete personas con fibrosis quística. Los volátiles que tienen una mayor incorporación de 13C para la mayoría de las muestras se muestran en el panel 5A, aquellos con una incorporación de 13C de menor porcentaje en la mayoría de las muestras de esputo están en el panel 5B, y las moléculas con una conversión de 13C por ciento más baja en una minoría de las muestras de esputo se muestran en el panel 5C. Siempre verifique las presiones de su vial después de aproximadamente un minuto.

Un vacío roto derrota la sensibilidad y la velocidad del método VASE. Después de este procedimiento, si se realizó un sondeo de isótopos estables, el ADN se puede extraer del material restante para identificar organismos microbianos o especies que pueden haber contribuido a la producción de las moléculas volátiles. Este método también es útil para detectar volátiles de cualquier tipo de muestra sin sondeo de isótopos.

Con las ventajas de la sensibilidad y el bajo volumen de muestra, muchas aplicaciones pueden beneficiarse de esta técnica.