Ensayo in vitro de alto rendimiento utilizando organoides tumorales derivados del paciente

Las líneas celulares de cáncer humano son ampliamente aceptadas para estudiar la biología del cáncer y evaluar los agentes anticancerígenos. Sin embargo, estas líneas celulares no necesariamente conservan las características originales de su tejido fuente porque su morfología, mutación genética y perfil de expresión génica pueden cambiar durante el cultivo durante largos períodos. Además, la mayoría de estas líneas celulares se cultivan en una monocapa o se utilizan como xenoinjertos murinos, ninguno de los cuales representa físicamente el tejido tumoral^1,2. Por lo tanto, la eficacia clínica de los agentes anticancerígenos puede no ser la misma que la observada en las líneas celulares de cáncer. Por lo tanto, se han desarrollado sistemas in vitro, como ensayos ex vivo que utilizan xenoinjertos tumorales derivados del paciente u organoides tumorales derivados del paciente (PDO) y modelos de esferoides tumorales que reproducen con precisión la estructura y función de los tejidos tumorales. La creciente evidencia sugiere que estos modelos predicen la respuesta de los pacientes a los agentes anticancerígenos al ser directamente comparables al tejido canceroso correspondiente. Estos sistemas in vitro se han establecido para diferentes tipos de tejido tumoral, y también se han desarrollado sistemas de ensayo de alto rendimiento (HTS) asociados para el cribado de fármacos^3,4,5,6,7. Los cultivos organoides heterogéneos ex vivo de tumores primarios obtenidos de pacientes o xenoinjertos tumorales derivados de pacientes han ganado una tracción considerable en los últimos años debido a su facilidad de cultivo y capacidad para mantener la complejidad de las células en el tejido estromal^8,9,10. Se espera que estos modelos mejoren la comprensión de la biología del cáncer y faciliten la evaluación de la eficacia de los medicamentos in vitro.

Recientemente se crearon una serie de nuevas DOP a partir de diferentes tipos de tejido tumoral, designados como F-PDO, en el marco del Proyecto de Investigación Traslacional de Fukushima. Los DOP forman grandes grupos celulares con una morfología similar a la del tumor de origen y pueden cultivarse durante más de seis^{meses 11}. La histología comparativa y los análisis exhaustivos de expresión génica mostraron que las características de las DOP son cercanas a las de sus tejidos tumorales de origen, incluso después de un crecimiento prolongado en condiciones de cultivo. Además, se estableció un HTS adecuado para cada tipo de DOP en placas de 96 y 384 pocillos. Estos ensayos se utilizaron para evaluar varios agentes y anticuerpos moleculares dirigidos. Aquí, los quimioterapéuticos estándar (paclitaxel y carboplatino) utilizados para el cáncer de endometrio se evaluaron utilizando F-PDO derivados de un paciente que no respondió a paclitaxel y carboplatino. En consecuencia, la actividad inhibidora del crecimiento celular de paclitaxel y carboplatino contra esta DOP fue débil (IC₅₀: >10 μM). Además, investigaciones anteriores han reportado que la sensibilidad de algunos F-PDO a agentes quimioterapéuticos y agentes moleculares dirigidos es consistente con la eficacia clínica^11,12,13. Finalmente, se analizaron los cambios en la estructura de orden superior de los DOP causados por agentes anticancerígenos utilizando un sistema de análisis celular tridimensional^12,13. Los resultados de la evaluación de agentes anticancerígenos utilizando un HTS basado en DOP son comparables con los resultados clínicos obtenidos para estos agentes. Aquí, se presenta un protocolo para un HTS más simple y preciso que se puede utilizar para evaluar la potencia de los agentes anticancerígenos y la inmunoterapia utilizando los modelos de DOP.

Todos los experimentos con materiales derivados del ser humano se realizaron bajo la Declaración de Helsinki y fueron aprobados de antemano por el comité de ética de la Universidad Médica de Fukushima (números de aprobación 1953 y 2192; fechas de aprobación el 18 de marzo de 2020 y el 26 de mayo de 2016, respectivamente). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes que proporcionaron las muestras clínicas utilizadas en este estudio.

1. Cultura de las DOP

NOTA: Los F-PDO forman grupos celulares que exhiben una variedad de morfologías heterogéneas y crecen en cultivo en suspensión(Figura 1). Además, los F-PDO se pueden cultivar durante más de 6 meses y se pueden criopreservar para su uso futuro.

1. Descongelación de las DOP almacenadas (día 0)
   1. Descongelación y siembra de PDO (por ejemplo, RLUN007, adenocarcinoma de pulmón) el día 0(Figura 1). Primero, agregue 15 ml de medio para PDO (ver Tabla de materiales)que contengan 1% de suplemento de B-27 y 30 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml.
   2. Después de retirar el vial congelado del almacenamiento de nitrógeno líquido, agite suavemente los PDO en un baño de agua a 37 °C durante 2 min. A continuación, retire el vial del baño de agua, limpie el vial con etanol al 70% y luego mueva el vial a un gabinete de seguridad biológica.
   3. Transfiera el contenido del vial al tubo que contiene 15 ml de medio para las DOP. Mezcle los DOP y el medio canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo cinco veces con una pipeta de transferencia de 3 ml. Centrifugar el tubo a 200 x g durante 3 min a ~25 °C y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet DOP en 5 ml de medio fresco y transferir a un matraz de 25 cm² (ver Tabla de materiales)con pipeteo suave. Por último, cultivar las DOP en una incubadora a 37 °C en 5% de CO_2.
2. Cambie el medio dos veces por semana (días 3-7). Centrifugar la suspensión doP para precipitar los racimos celulares, y sustituir 4 mL del medio (80% de volumen). Resuspendir las células en el medio fresco.
   NOTA: La mayoría de RLUN007 aparecen como grupos celulares de 100-500 μm de diámetro. Cuando el color del rojo fenol en el medio cambia a amarillo como se muestra en la Figura 1A,reemplace el medio con más frecuencia. Si el medio se vuelve amarillo al día siguiente del reemplazo, y cada grupo de células se fusiona para formar grupos más grandes que tienen >500 μm de diámetro, pase a una relación de división de 1: 2.
3. Subcultura (días 8-28) de las DOP
   NOTA: Dada la dificultad de medir realmente el número de células individuales, el momento de paso se determina en función de una densidad de grupo celular adecuada y el tamaño del pellet de DOP después de la centrifugación(Figura 1B). En el caso de RLUN007, el volumen del pellet DOP alcanza los 30 μL (densidad saturada en matraces de 25 cm²⁾ aproximadamente 2 semanas después de la descongelación.
   1. Para la transferencia de un matraz de²⁵ cm 2 a dos matraces de²⁵ cm 2 (P1), transfiera la suspensión de la DOP a un tubo de centrífuga y centrífuga a 200 x g durante 2 min a aproximadamente 25 °C. Estime el volumen del pellet de DOP y deseche el sobrenadante. Resuspend el pellet DOP utilizando una pipeta de 5 mL en 5 mL de medio fresco. Pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo cinco veces a baja velocidad. Luego, transfiera la mitad del volumen de la suspensión de la DOP (2,5 ml) a dos matraces y agregue 2,5 ml de medio fresco a cada matraz. Cultivar las células a 37 °C en 5% de CO₂.
   2. Para la transferencia de dos matraces de²⁵ cm 2 a un matraz de 75 cm² (P2), transfiera la suspensión de DOP de dos matraces a dos tubos de centrífuga y centrífuga la DOP a 200 x g durante 2 min a aproximadamente 25 °C. A continuación, estime el volumen del pellet de DOP y resuspenda el pellet en 2,5 ml de medio fresco (por tubo). A continuación, combine la suspensión de la DOP en un tubo con la del otro y transfiérala a un matraz de 75 cm² que contenga 10 ml de medio fresco. Cultivar las células a 37 °C en 5% de CO₂. Transfiera las DOP subrecultivadas de dos matraces de²⁵ cm 2 a un matraz de 75 cm² aproximadamente 1 semana después del primer pasaje(Figura 1C).

2. Inhibición del crecimiento HTS

NOTA: La actividad inhibidora del crecimiento de los agentes anticancerígenos contra los DOP se evalúa midiendo el contenido intracelular de ATP, como se muestra en la Figura 2. Este paso se realiza utilizando un kit de ensayo de viabilidad celular disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales).

1. El día 0, cultive las DOP (por ejemplo, RLUN007) en matraces hasta que se disponga de un número adecuado de grupos celulares para el ensayo. Un día antes de la siembra, transfiera la suspensión de doP de un matraz de 75 cm² a un tubo de 15 ml y centrífuga a 200 x g durante 2 minutos para medir el volumen de pellets de DOP. Luego, vuelva a suspender el pellet de DOP en 15 ml de medio fresco y transfiéralo de nuevo a un matraz de 75 cm^2. Cultivar las células a 37 °C en 5% de CO₂.
   NOTA: El volumen de pellets de DOP requerido depende de la tasa de dilución de cada DOP y del número de placas de 384 pocillos utilizadas para el ensayo. Para RLUN007, se necesita un volumen de pellets celulares de 200 μL para la siembra en diez placas de 384 pocillos.
2. El día 1 (24 h después de cambiar el medio), picar las DOP utilizando equipos de fragmentación y dispersión celular (ver Tabla de Materiales)con un portafiltros que contenga un filtro de malla de 70 μm. Luego, diluya 15 ml de la suspensión de la DOP en 10x. Sembrar 40 μL de la suspensión de la DOP en microplacas de esferoides de fijación ultrabajas de 384 pocillos (fondo redondo) (ver Tabla de Materiales)utilizando un dispensador de suspensión celular (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Para picar grupos de células, se recomienda utilizar el equipo de fragmentación y dispersión celular disponible en el mercado (ver Tabla de Materiales).
3. A las 24 h después de la siembra (día 2), tratar los DOP con 0,04 μL de soluciones de agentes de ensayo en rangos de concentración final de 20 μM a 1,0 nM (10 diluciones en serie) utilizando un manipulador líquido (ver Tabla de Materiales).
4. El día 8 (144 h después del tratamiento con la sustancia de ensayo), agregue el reactivo de medición de ATP intracelular a los pozos de prueba. Mezclar las placas con un mezclador e incubar durante 10 min a 25 °C. Mida el contenido intracelular de ATP como luminiscencia utilizando un lector de placas (ver Tabla de Materiales).
5. Para calcular la viabilidad de la celda, divida la cantidad de ATP en los pozos de prueba por la de los pozos de control que contienen el vehículo, restando el fondo. Para calcular la tasa de crecimiento durante 6 días, divida la cantidad de ATP en los pozos de control del vehículo por la de los pozos de control del vehículo 24 horas después de la siembra.
6. Calcular los valores de concentración inhibitoria del 50% (IC₅₀₎y área bajo la curva (AUC) a partir de las curvas dosis-respuesta utilizando software de análisis de datos biológicos (ver Tabla de Materiales). El factor Z es un parámetro adimensional que oscila entre 1 (separación infinita) y <0, definido como Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, donde σc+, σc-, μc+ y μc- son las desviaciones estándar (σ) y medias (μ) de los controles alto (c+) y bajo (c−)^14,respectivamente.

3. HTS con un sistema de selección celular e imágenes para la inhibición del crecimiento

NOTA: Si hay una gran desviación (cuando el coeficiente de variación [CV] en el ensayo es superior al 20%) en los datos utilizando el protocolo 2, las DOP de un tamaño seleccionado pueden sembrarse en placas de 96 o 384 pocillos utilizando un sistema de recolección e imágenes celulares(Figura 2). El protocolo es el mismo que el descrito en los pasos 2.1 y 2.2 de la sección anterior. Este paso se realiza utilizando un sistema de selección de células e imágenes disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales).

1. El día 1, establezca una microplaca esferoide de fijación ultra baja de 384 pocillos con 40 μL de medio/pozo como una placa de destino en el sistema de selección de células e imágenes.
2. Llene la cámara de recolección (ver Tabla de Materiales)con 6 mL de medio de cultivo y centrífuga a 1.500 x g durante 2 min para eliminar las burbujas de aire. Añadir los DOP suspendidos en el medio (volumen de pellets DOP, 4 μL) a la cámara de picking y colocarlos en el sistema.
3. Coloque la cámara durante al menos 1 minuto, seguido de dispersión, de modo que los grupos de células se asienten en la parte inferior de la cámara; luego, realice un escaneo de la cámara.
4. Establezca el tamaño de recolección en 140-160 μm (área 15,386-20,000 μm²) en el sistema para la selección automática de grupos celulares. A continuación, verifique la calidad de los grupos de celdas seleccionados en las imágenes escaneadas y transfiera diez grupos de celdas por pozo utilizando consejos de selección (consulte la Tabla de materiales)a la placa de destino.
5. Realice los pasos del protocolo desde el paso 2.3 en adelante.

4. HTS para la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

NOTA: Este paso se realiza utilizando un sistema disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales),que es un instrumento de medición de impedancia eléctrica. Se utiliza para evaluar la citólisis de las DOP por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) con anticuerpos monoclonales y células asesinas naturales (NK)(Figura 3). Las células NK se producen a partir de células mononucleares de sangre periférica utilizando el kit de producción de células NK (consulte la Tabla de materiales),siguiendo las instrucciones del fabricante.

1. Medición de la actividad de ADCC
   1. El día 0, cubra una placa de 96 pocillos (ver Tabla de Materiales)con 50 μL de solución de fibronectina de 10 μg/ml (0,5 μg/pocillo) a 4 °C durante la noche.
   2. El día 1, después de retirar la solución de fibronectina, agregue 50 μL del medio de cultivo a cada pocillo para medir la impedancia de fondo.
   3. Antes de la siembra, añadir 5 ml de reactivo de disociación de cultivo celular (véase la Tabla de materiales)a las DOP (RLUN007: 100 μL del pellet de DOP en un matraz de 75 cm²⁾ e incubar en una incubadora de CO₂ a 37 °C durante 20 min para dispersar las DOP. Para detener la tripsinización, agregue 5 ml de medio, centrífuga y retire el reactivo de disociación. Enjuague los DOP con medio fresco y filtre a través de un colador de células de 40 μm (consulte la Tabla de materiales).
   4. Contar el número de celdas utilizando un analizador de viabilidad celular (consulte la Tabla de materiales).
   5. Transfiera la suspensión de la DOP a un depósito y mezcle con un pipettor multicanal. Agregue la suspensión de doP en pozos a 5 x 10⁴ celdas / pozo en una placa de 96 pocillos. Cada pozo contiene un volumen final de 100 μL. Luego, coloque la placa en un gabinete de seguridad biológica a aproximadamente 25 ° C durante 30 min.
   6. Transfiera la placa al instrumento en una incubadora de CO₂ a 37 °C. Registre los cambios en las señales de impedancia cada 15 minutos como índice celular.
   7. Descongelar las células NK en un baño de agua a 37 °C el mismo día de la siembra doP. Transfiera las células del vial a un tubo de 15 ml que contenga 10 ml de medio para células NK (consulte la Tabla de materiales)y centrífuga a 300 x g durante 5 min a aproximadamente 25 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 ml de medio fresco. Después del recuento de células, ajuste la densidad celular a 1 x^{10 6} celdas/ml y transfiérala a un matraz de 75 cm^2. Cultive las células NK en una incubadora de CO_{2 al 5%} a 37 °C.
   8. El día 2, prepare las soluciones de anticuerpos (solución salina tamponada con fosfato) a 10 veces la concentración final en placas estériles de 96 pocillos con fondo en V.
   9. Retire 60 μL de medio de cada pocillo y agregue 10 μL de trastuzumab o solución de cetuximab (10 μg/mL, 1 μg/mL y 0,1 μg/mL) a las PDO. Transfiera las placas de vuelta al instrumento en una incubadora y registre el índice de la célula durante 1 h.
   10. Transfiera la suspensión de la célula NK a un tubo de 50 ml y cuente el número de celda. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min y ajustar la densidad de células NK a 1 x 10⁶ celdas/ml y 2 x 10⁶ células/ml con el medio para las PDO.
   11. Agregue 50 μL de suspensión de células NK a las células efectoras (NK) en una proporción de células objetivo (RLUN007) de 1:1 o 2:1. Las concentraciones finales de los anticuerpos son 1 μg/mL, 0,1 μg/mL y 0,01 μg/mL. Mantenga la placa a aproximadamente 25 °C durante 15 minutos y devuelva las placas al instrumento.
2. Recopilación y análisis de datos
   1. Convierta el índice celular a valores porcentuales de citólisis utilizando un software de análisis (consulte la Tabla de materiales).
   2. El porcentaje de citólisis se refiere al porcentaje de células diana muertas por células NK frente a células diana (PDO) solas como control. Reste los índices celulares de los pozos que contienen solo células NK del índice de los pozos de muestra en cada punto de tiempo. Normalizar cada valor al índice celular inmediatamente antes de la adición de anticuerpos. Convierta el índice celular normalizado en porcentaje de citólisis utilizando la siguiente ecuación: % citólisis = (1 - índice celular normalizado [pocillos de muestra]) / índice celular normalizado (pozos objetivo solo) x 100.

Se desarrolló un HTS de alta precisión utilizando DOP y microplacas de 384 pocillos para evaluar los agentes anticancerígenos, y el desarrollo de un HTS para cada DOP se informó previamente10,11,12,13. El rendimiento del HTS se evaluó calculando los CV y el factor Z'. El factor Z es un método ampliamente aceptado para la validación de la calidad y el rendimiento del ensayo, y el ensayo es adecuado para HTS si este valor es >0,514. Los puntos de referencia de control en el ensayo de placa de 384 pocillos utilizando RLUN007 mostraron poca variabilidad, con valores CV de 5,8% y factores Z calculados de 0,83, como se muestra en la Figura 4. Estos resultados indican que este ensayo tiene un alto rendimiento para HTS. Para investigar la sensibilidad de los DOP a los agentes anticancerígenos mediante HTS, la inhibición del crecimiento se evaluó mediante RLUN007 tratado con ocho agentes anticancerígenos, específicamente, inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (afatinib, erlotinib, gefitinib, lapatinib, osimertinib y rociletinib) y paclitaxel, que son tratamientos clínicos estándar para el cáncer de pulmón de células no pequeñas, y la mitomicina C como control positivo. Los valores de IC50 y AUC de los agentes anticancerígenos para cada DOP se muestran en la Figura 4. El RLUN007 mostró alta sensibilidad (IC50 < 2 μM, AUC < 282) para todos los inhibidores de EGFR y otros agentes anticancerígenos. Las curvas sigmoides calculadas para todos los datos indicaron que la actividad inhibidora del crecimiento de los agentes anticancerígenos podría medirse con precisión.

El sistema de selección de células e imágenes se utiliza cuando los datos varían significativamente utilizando la metodología anterior. El sistema de selección e imágenes celulares, que selecciona los grupos celulares con precisión sin dañarlos, permite ensayos HTS precisos al alinear el tamaño del grupo celular para excluir los desechos celulares del sistema de ensayo. Cuando no se utilizó el sistema, el valor CV fue del 26,0% y el valor del factor Z fue de 0,23 (datos no mostrados). Sin embargo, los valores de los factores CV y Z se mejoraron en 6,4% y 0,81, respectivamente, utilizando el sistema.

Para investigar la citólisis de los DOP con actividad ADCC utilizando el instrumento de medición de impedancia eléctrica, que monitorea el número, la morfología y la unión de las células durante mucho tiempo, los cambios en las señales de impedancia se evaluaron utilizando RLUN007 tratado con los anticuerpos (trastuzumab y cetuximab) y células NK como células efectoras en una placa de 96 pocillos. En comparación con el control que consiste solo en células diana, el porcentaje de citólisis aumentó con el tiempo. Alcanzó el 45% o 75% después de 6 h en una relación E:T de 1:1(Figura 5A,C)o 2:1(Figura 5B,D)sin los anticuerpos. La citólisis mediada por células NK con trastuzumab fue de aproximadamente 60% y 90% en una proporción de 1:1(Figura 5A,1 μg/mL) y 2:1(Figura 5B,1 μg/mL), respectivamente, a 6 h. Por el contrario, cetuximab tuvo un impacto dependiente de la dosis en la citólisis mediada por células NK (Figura 5C,D). A la concentración más alta de cetuximab, RLUN007 se destruyeron al 90% y 100% en una proporción de 1:1 y 2:1, respectivamente (Figura 5C,D). El efecto de trastuzumab fue más débil que el de cetuximab, con sólo un 60% de citotoxicidad. Estos resultados indican que el sistema de ensayo PDO puede evaluar la actividad de ADCC utilizando tecnología basada en impedancia en tiempo real.

Figura 1: Puntos críticos para la cultura de la DOP. (A) Cambio de color en el medio. (B) Medición de la cantidad de DOP a partir del tamaño del pellet mediante el revestimiento de un tubo de centrífuga que contiene los DOP con tubos marcados a niveles de 50-200 μL. (C) Densidad de DOP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Resumen del protocolo utilizado para crear un sistema de ensayo de alto rendimiento utilizando microplacas de 384 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resumen del protocolo para el ensayo de alto rendimiento de la actividad de ADCC. ADCC: citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos; NK, asesino natural. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Sistema de ensayo de alto rendimiento para la inhibición del crecimiento con agentes anticancerígenos. Curva dosis-respuesta de RLUN007 a agentes anticancerígenos. Las DOP picadas se sembraron en placas de 384 pocillos. Estos fueron tratados durante 6 días con diez concentraciones diferentes de agentes anticancerígenos (entre 10 μM y 1,5 nM). Los datos representan la media ± desviación estándar de los experimentos triplicados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Ensayo de alto rendimiento para la actividad de ADCC. (A,B) Trastuzumab. (C,D) Cetuximab. (A,C) Una proporción de 1:1 de RLUN007 a las células efectoras. (B,D) Citólisis con una relación de RLUN007: células efectoras de 1:2. La actividad se midió 12 h después de la adición de las células efectoras. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres muestras replicadas. ADCC: citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fujifilm Wako Bio Solutions Corporation es una subsidiaria de Fujifilm Wako Pure Chemicals, el propietario comercial de medios F-PDO y F-PDO por transferencia de licencia.