Summary
단백질 티올 산화는 정상적인 생리적 및 병리생리학적 조건 하에서 중요한 의미를 갖는다. 자사는 수지 보조 포획, 등압 표지 및 질량분석법을 활용하여 단백질의 가역적으로 산화된 시스테인 잔기의 부위별 식별 및 정량화를 가능하게 하는 정량적 산화 환원 단백질체학 방법의 세부 사항을 설명합니다.
Abstract
단백질 티올에 대한 가역적 산화 변형은 최근 세포 기능의 중요한 매개체로 부상했습니다. 여기에서는 탠덤 질량 태그(TMT) 등압 라벨링 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)과 함께 수지 보조 포획(RAC)을 활용하여 프로테옴 수준에서 산화된 단백질 티올의 멀티플렉스 스토키오메트릭 정량화를 허용하는 정량적 산화 환원 단백질체학 방법의 자세한 절차를 설명합니다. 산화된 시스테인 잔기에 대한 부위별 정량적 정보는 이러한 변형의 기능적 영향에 대한 추가적인 통찰력을 제공합니다.
워크플로우는 배양된 세포(예: 포유류, 원핵생물) 및 전체 조직(예: 심장, 폐, 근육)을 포함한 많은 샘플 유형에 적용할 수 있으며, 이는 초기에 용해/균질화되고 인공 산화를 방지하기 위해 유리 티올이 알킬화됩니다. 산화된 단백질 티올은 티올 친화성 수지에 의해 환원 및 포획되며, 이는 단백질/펩타이드의 추가 전달 없이 진행된 소화, 라벨링 및 세척 절차를 수행할 수 있도록 하여 워크플로우 단계를 간소화하고 단순화합니다. 마지막으로, 표지된 펩타이드를 LC-MS/MS에 의해 용리 및 분석하여 전체 프로테옴에서 티올 산화와 관련된 포괄적인 화학량론적 변화를 나타냅니다. 이 방법은 단백질 티올 산화와 관련된 생리적 및 병리 생리 학적 상태 하에서 산화 환원 의존성 조절의 역할에 대한 이해를 크게 향상시킵니다.
Introduction
항상성 조건에서 세포는 대사 및 신호 전달 1,2,3과 같은 과정을 촉진하는 데 도움이 되는 반응성 산소, 질소 또는 황 종을 생성하여 원핵생물과 진핵생물 모두로 확장됩니다. 이러한 반응성 종의 생리학적 수준은 'eustress'라고도 하는 적절한 세포 기능에 필요합니다.1,4. 대조적으로, 산화제와 항산화제 사이의 불균형으로 이어지는 산화제의 증가는 산화 스트레스 또는 '고통'1을 유발하여 세포 손상을 유발할 수 있습니다. 산화제는 단백질, DNA, RNA 및 지질을 포함한 다양한 생체 분자를 변형시켜 신호를 생물학적 경로로 변환합니다. 특히, 단백질의 시스테인 잔기는 시스테인 상의 티올기로 인해 산화되기 쉬운 반응성이 높은 부위이며, 이는 상이한 유형의산화제에 대해 반응성이다5. 이는 니트로실화(SNO), 글루타티오닐화(SSG), 술페닐화(SOH), 과황화(SSH), 다황화(SSNH),아실화 및 이황화물을 포함하여 시스테인에 대한 다양한 범위의 가역적 산화 환원 기반 번역 후 변형(PTM)을 발생시킵니다. 시스테인 산화의 비가역적 형태는 술피닐화 (SO2H) 및 술포닐화 (SO3H)를 포함한다.
시스테인 잔기의 가역적 산화 변형은 더 이상의 비가역적 산화를 방지하는 보호 역할을 하거나 하류 세포 경로6,7에 대한 신호 분자로서 작용할수 있다. 일부 티올 산화 환원 PTM의 가역성은 시스테인 부위가 "산화 환원 스위치"8,9로 기능할 수 있도록 하며, 여기서 이러한 부위의 산화 환원 상태의 변화는 일시적인 과정에서의 역할을 조절하기 위해 단백질 기능을 변경합니다. 산화 환원 PTMs(10)의 조절 효과는 촉매작용(12), 단백질-단백질 상호작용(13), 형태 변화(14), 금속 이온 배위(15) 또는 약리학적 억제제 결합(16)을 포함하는 단백질 기능(11)의 많은 측면에서 관찰되었다. 또한, 산화 환원 PTM은 전사17, 번역 18 또는 대사19와 같은 경로를 조절하는 단백질의 시스테인 부위에 관여합니다. 산화 환원 PTM이 단백질 기능 및 생물학적 과정에 미치는 영향을 감안할 때, 산화 환원 상태의 섭동에 반응하여 시스테인 부위가 겪는 산화 정도를 정량화하는 것이 중요합니다.
산화 환원 상태가 변경된 시스테인 부위의 식별은 정상 조건과 교란 조건 사이의 부위 별 수준에서 산화 상태를 비교하는 데 중점을 둡니다. 폴드 변화 측정은 사용자가 연구에서 생리학적으로 중요할 수 있는 시스테인 부위를 해석하는 데 도움이 되기 때문에 어떤 부위가 크게 변경되었는지 결정하는 데 자주 사용됩니다. 또는 특정 샘플 유형에 걸친 가역적 티올 산화의 화학량론적 측정은 세포 산화와 관련된 생리적 상태의 일반적인 그림을 제공하며, 이는 종종 간과되고 활용도가 낮은 중요한 측정입니다. 변형 화학량론은 변형된 티올의 백분율을 총 단백질 티올(변형 및 변형되지 않음)에 대한 비율로 정량화하는 것을 기반으로 합니다.20,21. 결과적으로 화학량론적 측정은 특히 질량분석법을 사용할 때 접힘 변화보다 더 정확한 측정을 제공합니다. 산화 증가의 중요성은 특정 시스테인 부위의 PTM 점유를 결정하기 위해 화학량론을 사용함으로써 보다 쉽게 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 티올 산화의 3 배 증가는 1 %에서 3 %로 또는 30 %에서 90 %로 큰 전이로 인해 발생할 수 있습니다. 3 % 점유 인 부위의 산화가 1 배 증가하면 단백질 기능에 거의 영향을 미치지 않을 수 있습니다. 그러나 휴식 상태에서 30 %의 점유율을 가진 사이트의 경우 3 배 증가가 더 크게 영향을받을 수 있습니다. 총 산화된 티올과 단백질 글루타티오닐화(SSG) 및 니트로실화(SNO)를 포함한 특정 산화 변형 간에 화학량론적 측정을 수행하면 특정 변형 유형에 대한 비율 및 정량적 정보를 나타낼 수 있습니다.
가역적 티올 산화는 전형적으로 낮은 존재비의 번역 후 변형이기 때문에, 생물학적 샘플로부터 이러한 변형을 포함하는 단백질의 농축을 위한 여러 접근법이 개발되었다. Jaffrey와 다른 사람들이 고안 한 초기 접근법 인 비오틴 스위치 기술 (BST) 22는 변형되지 않은 티올이 알킬화를 통해 차단되고, 가역적으로 변형 된 티올이 초기 유리 티올로 환원되고, 초기 유리 티올이 비오틴으로 표지되고, 표지 된 단백질이 스트렙 타비딘 친화성 풀다운에 의해 풍부 해지는 여러 단계를 포함합니다. 이 기술은 많은 연구에서 SNO와 SSG를 프로파일링하는 데 사용되었으며 다른 형태의 가역적 티올 산화23,24를 프로브하는 데 적용할 수 있습니다. BST는 다양한 형태의 가역적 티올 산화를 조사하는 데 활용되었지만,이 접근법의 한 가지 우려는 농축이 비 비오틴 화 단백질과 스트렙타비딘의 비특이적 결합에 의해 영향을 받는다는 것입니다. 우리 실험실에서 개발된 수지 보조 포획(RAC)25,26(그림 1)이라는 대체 접근법은 비오틴-스트렙타비딘 시스템을 통한 티올 그룹의 농축 문제를 우회합니다.
가역적으로 산화 된 티올의 환원에 이어, 초기 유리 티올을 갖는 단백질은 유리 티올 그룹을 공유 적으로 포획하는 티올 친화성 수지에 의해 농축되어 BST보다 시스테인 함유 단백질의보다 특이적인 농축을 가능하게한다. RAC를 최근 등압 라벨링 및 질량분석법의 발전의 멀티플렉싱 능력과 결합하면 프로테옴 전체 수준에서 가역적으로 산화된 시스테인 잔기의 농축, 식별 및 정량화를 위한 강력하고 민감한 워크플로우가 생성됩니다. 질량 분석법의 최근 발전은 티올 산화 환원 프로테옴의 훨씬 더 깊은 프로파일 링을 가능하게하여 단백질 티올 산화27의 원인과 결과에 대한 이해를 높입니다. 부위별 정량적 데이터로부터 얻은 정보는 가역적 산화 변형의 기계론적 영향 및 다운스트림 효과에 대한 추가 연구를 가능하게 한다28. 이 워크 플로우를 활용하면 노화와 같은 정상적인 생리적 사건과 관련하여 가역적 시스테인 산화의 생리적 영향에 대한 통찰력을 얻을 수 있으며, SSG 수준은 연령과 관련하여 다릅니다. SSG에 대한 노화 효과는 미토콘드리아 기능을 향상시키고 노화 마우스의 SSG 수준을 감소시키는 새로운 펩타이드 인 SS-31 (elamipretide)을 사용하여 부분적으로 역전되어 어린 마우스29와 더 유사한 SSG 프로파일을 갖게되었습니다.
나노 입자 노출로 인한 병태 생리 학적 조건은 마우스 대 식세포 모델에서 SSG를 포함하는 것으로 나타났습니다. 질량 분석법과 결합 된 RAC를 사용하여 저자들은 SSG 수준이 산화 스트레스 및 대 식세포 식세포 기능의 손상 정도와 직접적인 상관 관계가 있음을 보여주었습니다. 데이터는 또한 서로 다른 정도의 산화 스트레스를 유발하는 서로 다른 조작 된 나노 물질에 대한 반응의 경로 별 차이를 밝혀 냈습니다30. 이 방법은 또한 원핵 생물 종에서 그 유용성을 입증했으며, 여기서 티올 산화와 관련하여 광합성 시아 노 박테리아에서 일주기의 영향을 연구하는 데 적용되었습니다. 전자 수송, 탄소 고정 및 해당 과정을 포함한 몇 가지 주요 생물학적 과정에서 티올 산화의 광범위한 변화가 관찰되었습니다. 또한, 직교 검증을 통해, 몇몇 주요 기능 부위가 변형되는 것으로 확인되었고, 이는 이러한 산화적 변형의 조절 역할을 시사한다6.
여기에서는 표준화된 워크플로우(그림 1)의 세부 사항을 설명하며, 단백질의 총 산화된 시스테인 티올의 농축과 후속 라벨링 및 화학량론적 정량화를 위한 RAC 접근법의 유용성을 보여줍니다. 이 워크플로우는 세포 배양27,30 및 전체 조직(예: 골격근, 심장, 폐)29,31,32,33을 포함한 다양한 샘플 유형의 산화 환원 상태 연구에서 구현되었습니다. 여기에 포함되지는 않았지만 RAC 프로토콜은 앞서 언급한25,29,34와 같이 SSG, SNO 및 S-아실화를 포함한 특정 형태의 가역적 산화 환원 변형의 조사에도 쉽게 적응할 수 있습니다.
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Protocol
동물 또는 인간 샘플 / 조직과 관련된 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 인간 및 동물 연구 윤리위원회의 기관 지침에 의해 승인되고 준수되었습니다.
1. 시료 균질화/용해
- 냉동 조직 샘플
- 냉동 조직 (~ 30mg)을 유리 현미경으로 다진 후 미리 냉각 된 면도날과 집게를 사용하여 드라이 아이스 슬라이드에 놓습니다. 다진 조직을 700μL의 완충액 A( 표 1 참조)가 포함된 냉각된 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 옮기고 빛으로부터 보호하면서 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
- 30초 동안 또는 휴대용 조직 균질화기로 완전히 균질화될 때까지 조직을 파쇄합니다. 샘플을 얼음 위에 놓고 거품이 10분 더 가라앉도록 합니다.
알림: 드라이 아이스 위에 놓인 알루미늄 베이킹 시트는 조직의 초기 처리 / 분쇄를위한 안정적인 작업 표면과 플랫폼을 제공합니다.
- 또는 100mm 배양 접시의 부착성 세포 배양을 출발 물질로 사용하십시오.
- 세포를 얼음 위에 유지하고 혈청학적 피펫을 사용하여 100mM NEM을 함유한 10mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 헹굽니다.
- 차가운 균질화/용해 완충액 1mL를 추가하고 단단한 세포 스크레이퍼로 격렬하게 긁어 세포를 용해시킵니다. 마이크로피펫을 사용하여 용해물을 2mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
알림: 헹굼 버퍼와 용해 버퍼는 다른 크기의 배양 용기에 따라 확장 될 수 있습니다. 일반적으로 2-5 백만 개의 세포가 필요합니다. 그러나 이는 특정 세포 유형에 대한 용해 효율 및 단백질 수율에 따라 다릅니다. 균질화 완충액은 총 티올에 대해 분석되는 샘플에 대해 NEM 없이 제조될 수 있다.
- 생성된 균질액(단계 1.1.2 또는 1.2.2)을 마이크로피펫을 사용하여 2mL 원심분리 튜브에 옮기고 4°C에서 10분 동안 전속력(≥16,000× g)으로 원심분리합니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 상청액(~700μL 또는 세포 배양의 경우 ~1mL)을 5mL 원뿔형 미세원심분리 튜브로 옮기고 850rpm으로 흔들면서 어두운 곳에서 55°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 유리 혈청학적 피펫을 사용하여 샘플에 얼음처럼 차가운 아세톤 4mL를 추가하고 단백질을 침전시키고 과량의 N-에틸말레이미드를 제거하기 위해 -20°C에서 밤새 배양합니다.
2. 수지 보조 캡처
- 침전된 단백질 펠릿을 4°C에서 20,500× g 에서 10분 동안 원심분리하여 아세톤으로 두 번 세척하고, 아세톤을 디캔팅하고, 마이크로피펫을 사용하여 남아 있는 아세톤을 제거하고, 유리 혈청학적 피펫을 사용하여 3mL의 신선한 얼음처럼 차가운 아세톤을 추가합니다. 혼합하려면 여러 번 뒤집습니다. 두 번째 세척 후 펠릿을 1-2분 동안 자연 건조시키고 재현탁이 어려워질 수 있으므로 과도하게 건조되지 않도록 주의하십시오.
- 마이크로 피펫을 사용하여 버퍼 B ( 표 1 참조)의 1mL를 추가하고 250W의 출력과 짧은 소용돌이를 가진 목욕 초음파 처리기를 사용하여 한 번에 15-30 초 동안 반복 된 초음파 처리를 사용하여 단백질을 가용화합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 비신코닌산(BCA) 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
- 추가 처리를 위해 샘플 전반에 걸쳐 단백질 농도를 표준화하고 NEM을 완전히 제거하려면 마이크로피펫을 사용하여 단백질 500μg을 0.5mL 10kDa 원심 필터로 옮기고 재현탁 버퍼를 사용하여 최종 부피 500μL로 조정합니다.
- 실온에서 14,000 × g 에서 원심 필터의 부피가 100 μL 미만이 될 때까지 원심분리합니다. 수집 튜브에서 필터를 뒤집어 샘플을 수집합니다. 1,000× g 에서 2분 동안 원심분리하고 버퍼 C를 사용하여 최종 부피 500μL로 조정합니다( 표 1 참조).
- 마이크로피펫을 사용하여 20 μL의 500 mM 디티오트레이톨(DTT)을 최종 농도 20 mM로 첨가하고 850 rpm으로 진탕하면서 37°C에서 30분 동안 샘플을 인큐베이션함으로써 단백질 티올을 감소시킨다.
- 환원 후, 샘플을 마이크로피펫을 사용하여 0.5 mL 10 kDa 원심 필터로 옮기고, 실온에서 또는 원심 필터의 부피가 100 μL 미만이 될 때까지 14,000 × g 에서 15분 동안 원심분리한다. 완충액 D( 표 1 참조)를 추가하여 원심 필터의 부피를 500 μL로 구성한다.
- 단계 2.6에서 500 μL까지 3회 원심분리를 반복하고, 4차 원심분리 후 수집 튜브에 필터를 뒤집어 1,000 × g 에서 2분 동안 원심분리하여 시료를 수집하였다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 BCA 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
- 이 완충액 교환 중에 마이크로 저울을 사용하여 적절한 양의 수지(30mg/샘플)를 칭량하고 50mL 원심분리 튜브로 옮겨 티올 친화성 수지를 준비합니다. 그런 다음 혈청학적 피펫을 사용하여 최종 농도 30mg/mL 레진에 물을 추가하고 레진의 적절한 수화를 위해 교반하면서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
참고: 위에서 언급한 티올 친화성 수지는 제조업체에서 단종되었습니다. 이러한 티올-친화성 수지에 대한 가능한 대체물은 시판되고 있다. 그러나 이 대체품은 바인딩 용량이 거의 5배 적습니다( 추가 정보 참조). 대안적으로, 티올-친화성 수지는 2-(피리딜디티오)에틸아민 염산염 및 N-히드록시숙신이미드-활성화 수지를 사용하여 합성될 수 있다(보충 정보 참조).- 수지를 수화시킨 후 스핀 컬럼을 진공 매니폴드 위에 놓고 마이크로피펫을 사용하여 500μL의 수지 슬러리를 각 컬럼으로 옮깁니다. 물 제거를 위해 진공을 적용하십시오. 이 단계를 한 번 반복하여 컬럼당 총 30mg의 수지를 얻습니다. 또는 이 단계와 모든 수지 세척 및 용리 단계에 진공 매니폴드를 사용하는 대신 1,000× g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
알림: 보어 크기를 늘리기 위해 1000μL 피펫 팁의 끝을 절단하면 수지가 전사되는 데 도움이 됩니다. 피펫팅 사이를 분쇄하여 레진이 부유 상태로 유지되고 균질하고 동일한 양의 레진이 각 컬럼으로 전달되도록 하는 것이 중요합니다. - 마이크로피펫으로 초순수 500μL를 첨가하고 물 제거를 위해 진공을 가하여 수지를 세척합니다. 이것을 5 번 반복하십시오. 이어서, 수지를 500 μL의 완충액 E로 5회 세척한다( 표 1 참조).
알림: 또는 모든 후속 세척 단계에서 진공 매니폴드 대신 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리를 사용할 수 있습니다. 진행되는 모든 세척 단계는 500 μL의 부피로 수행된다. 컬럼에 세척 버퍼를 추가할 때 수지가 튀거나 손실되는 것을 방지하면서 수지를 완전히 재현탁할 수 있도록 충분한 힘으로 조심스럽게 첨가하십시오. 이를 통해 수지를 완전하고 효율적으로 세척 할 수 있습니다.
- 수지를 수화시킨 후 스핀 컬럼을 진공 매니폴드 위에 놓고 마이크로피펫을 사용하여 500μL의 수지 슬러리를 각 컬럼으로 옮깁니다. 물 제거를 위해 진공을 적용하십시오. 이 단계를 한 번 반복하여 컬럼당 총 30mg의 수지를 얻습니다. 또는 이 단계와 모든 수지 세척 및 용리 단계에 진공 매니폴드를 사용하는 대신 1,000× g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 환원된 각 샘플에서 150μg의 단백질을 새 튜브로 옮기고 완충액 C의 최종 부피 120μL로 조정합니다( 표 1 참조). 마이크로피펫을 사용하여 단백질 용액을 수지가 포함된 플러그된 스핀 컬럼으로 옮기고, 컬럼에 캡을 놓고, 850rpm에서 흔들면서 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
- 수지를 25 mM hepes, pH 7.0으로 5회 세척하고; 8 M 우레아; 2 M NaCl로 5 회 이어서 이어 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)과 함께 80% 아세토니트릴(ACN)로 5회 복용; 최종적으로 단계 2.8.2에 기재된 바와 같이 25 mM HEPES, pH 7.7로 5회 플러그를 교체하였다.
참고: 샘플은 단계 4.1에 설명된 바와 같이 단백질 수준(예: SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 웨스턴 블롯)에서 분석을 위해 여기에서 용리될 수 있습니다.
3. 레진 트립신 분해 및 TMT 라벨링
- 최종 부피가 샘플당 최소 120μL가 되도록 완충액 C( 표 1 참조)에 0.5μg/μL 농도로 가용화하여 샘플당 6-8μg에 대해 충분한 시퀀싱 등급 변형 트립신 용액을 준비합니다. 마이크로피펫을 사용하여 이 트립신 용액 120μL를 샘플에 추가하고 850rpm에서 흔들면서 37°C에서 밤새 배양합니다.
알림: 소화 효율을 높이기 위해 다음날 트립신 용액을 제거하고 신선한 용액으로 교체하여 추가 분해 단계를 포함하고 2시간 동안 소화를 계속할 수 있습니다. - 수지를 25 mM hepes, pH 7.0으로 5회 세척하고; 이어서 5 회 2 M NaCl; 0.1 % TFA로 80 % ACN으로 5 회; 이어 25 mM 헤페스, pH 7.7로 3회 이어서 복용하였다. 마지막으로 50mM 트리에틸암모늄 중탄산염 완충액(TEAB)으로 수지를 두 번 세척하고 플러그를 교체합니다.
- TMT 라벨링 시약을 먼저 실온으로 데우고 16,000×g의 원심분리기를 사용하여 잠시 회전시켜 준비 합니다. 마이크로피펫을 사용하여 TMT 표지 시약의 각 바이알에 150μL의 무수 ACN을 추가합니다. 바이알을 실온에서 850rpm으로 설정된 써모믹서에서 5분 동안 인큐베이션하여 시약을 완전히 가용화합니다. 잠시 와동을 일으키고 16,000 × g 에서 스핀 다운하여 시약을 수집합니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 세척된 수지에 100mM TEAB 40μL를 추가한 다음 용해된 TMT 시약 70μL를 추가하고 850rpm에서 흔들면서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 남은 TMT 시약은 -80 °C에서 보관하십시오.
참고: 각 생물학적 샘플에 할당된 개별 TMT 라벨을 기록해 둡니다(그림 1). - 앞서 설명한 대로 수지를 0.1% TFA의 80% ACN으로 5회, 100mM 중탄산암모늄 완충액(ABC)으로 3회, pH 8.0으로 2회, 물로 2회 세척하고 플러그를 교체합니다.
4. 펩타이드 용출
- 표지된 펩티드를 마이크로피펫을 이용하여 각 컬럼에 100 mM ABC, pH 8.0의 20 mM DTT 중 100 μL를 첨가하여 용리시키고, 850 rpm으로 설정된 써모믹서 상에서 30분 동안 실온에서 배양한다.
알림: DTT를 추가하면 수지가 뭉칩니다. 수지는 피펫 팁으로 파쇄되어 덩어리를 분해하고 펩타이드의 완전한 용출을 보장할 수 있습니다. - 이 배양 후 고체상 추출(SPE)용 진공 매니폴드에 컬럼을 놓고 진공을 적용한 다음 샘플을 5mL 미세 원심분리 튜브에 용리합니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
- 마지막으로 0.1% TFA와 함께 80% ACN 100μL를 추가하고 실온에서 10분 동안 배양한 다음 동일한 5mL 원심분리 튜브에 용리합니다. 동일한 5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 모든 분획을 수집합니다.
참고: 샘플 손실을 방지하려면 용출에 낮은 결합 튜브를 사용해야 하며 단일 5mL 튜브의 경우 부피를 4.0mL 이하로 유지해야 합니다. - 용리된 샘플을 건조될 때까지 진공 농축기에 넣습니다. 건조 펩타이드를 -80°C에서 보관하고 나중에 재현탁합니다.
참고: 샘플은 별도로 용리될 수도 있으며, 샘플을 결합하기 전에 펩티드 수준에서 분석을 위해 분취량을 제거하고 SDS-PAGE로 분석할 수 있습니다.
5. 펩타이드 알킬화 및 탈염/클린업
- 마이크로피펫을 사용하여 소량의 100mM ABC 완충액, pH 8.0(500μL 이하)을 첨가하여 건조된 펩티드를 재현탁시킨다. 250 W의 출력과 와류를 가진 목욕 초음파 처리기를 사용하여 한 번에 15-30 초 동안 반복 초음파 처리를 사용하여 용해시키고 2 mL 튜브로 옮깁니다.
참고: 추가될 100mM ABC, pH 8.0의 부피는 150mM의 몰 농도에서 DTT를 재현탁하는 데 필요한 부피를 기준으로 합니다. 사용자는 4.1단계에서 원래 추가된 내용을 기반으로 샘플에 존재하는 DTT의 양을 결정해야 합니다. - DTT : IAA의 1 : 4 몰비를 달성하기 위해 마이크로 피펫을 사용하여 ABC에 용해 된 요오드 아세트 아미드 (IAA)의 충분한 농축 스톡 용액 (600mM)을 추가하고 샘플을 1 rpm에서 흔들면서 RT에서 850 시간 동안 배양합니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 농축 TFA(10%)를 추가하여 샘플을 pH < 3으로 산성화하고 제조업체의 지침에 따라 역상 세척을 사용하여 샘플 탈염을 수행합니다.
- 건조 될 때까지 깨끗한 펩타이드를 진공 농축기에 넣으십시오. 추가 분석이 있을 때까지 건조 펩티드를 -80°C에서 보관한다.
6. 액체 크로마토 그래피-탠덤 질량 분석법
- 250 W의 출력을 가진 목욕 초음파 처리기를 사용하여 한 번에 15-30 초 동안 초음파 처리를 반복하고 3 % ACN을 함유 한 물의 20-40 μL에서 vortexing하여 건조 된 펩타이드를 재현탁하십시오. 펩티드 농도는 제조사의 프로토콜에 따라 BCA 분석을 수행하여 결정한다.
- 앞서 설명한대로 역상 LC 및 MS/MS로 샘플을 분리하고 400-2000의 m/z 범위에서 MS1 스펙트럼을 기록합니다. 고에너지 충돌 해리(HCD)를 활용하여 등압 표지된 펩타이드 분석을 위한 리포터 이온 강도 정보를 얻을 수 있도록 합니다. 기기 작동 조건27,30 및 MS 데이터분석 27,31에 대한 자세한 내용은 이전 보고서의 분석법 섹션을 참조하십시오.
참고: 펩타이드 샘플을 분석하기 위해 다양한 LC-MS/MS 시스템 또는 설정을 사용할 수 있습니다. 펩타이드 식별의 적용 범위와 민감도는 사용되는 특정 시스템 및 설정에 따라 달라집니다.
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Representative Results
프로토콜의 완료는 종종 >95% 특이성 27,35,36을 갖는 이전에 산화된 시스테인-함유 펩티드의 고도로 특이적인 농축을 초래할 것이다. 그러나, 프로토콜의 몇몇 주요 단계들은 특별한 주의를 필요로 하는데, 예를 들어, 인위적으로 산화된 티올(25)의 인공 산화 및 비특이적 농축을 금지하는 샘플 용해/균질화 전에 유리 티올의 초기 차단이 필요하다. 샘플은 프로토콜의 여러 단계에서 그리고 단백질 및 펩티드 모두의 SDS-PAGE 분석을 포함하는 상이한 방법에 의해 분석될 수 있다. SDS-PAGE는 총 티올 샘플이 처리 / 자극으로 인한 다양한 산화 수준을 결정하기 위해 샘플 간의 비율 메트릭 비교를 가능하게하는 샘플의 정성 분석을 가능하게합니다 (그림 2A). 개별 단백질의 산화 수준을 추가로 조사하기 위해, SDS-PAGE 겔은 웨스턴 블롯팅(36)을 거칠 수 있다(도 2B). 이를 통해 모델 시스템을 더 자세히 분석하여 지원 데이터와 네트워크 및 생물학적 경로에 대한 추가 가설을 생성할 수 있습니다. 이러한 방법/지원 데이터는 LC-MS/MS와 같은 추가 심층 분석 전에 예상 반응을 확인하기 위한 품질 관리로도 활용될 수 있습니다. LC-MS/MS로 분석된 시스테인 함유 펩타이드의 리포터 이온 강도를 사용하여 개별 Cys 부위 수준에서 티올 산화 화학량론을 정량화할 수 있습니다(그림 2C,D).
그림 1: 샘플 처리 워크플로. 시료 처리 워크플로우는 다양한 시료 유형 및 생물학적 시스템에서 티올 산화를 조사하는 데 적용할 수 있습니다. 워크플로우를 통해 단백질 및 펩타이드 수준(예: SDS-PAGE, 웨스턴 블롯) 모두에서 산화를 조사할 수 있을 뿐만 아니라 질량분석법과 결합된 HPLC를 사용하여 개별 시스테인 부위의 정량적, 부위별 식별을 위한 심층 커버리지가 가능합니다. 샘플 처리는 고품질의 일관된 데이터 생성을 위한 몇 가지 중요한 단계의 완료를 포함하여 3일 이내에 완료될 수 있습니다. TMT 라벨링을 통한 시료 멀티플렉싱을 통해 여러 시료를 동시에 병렬로 처리할 수 있습니다. 대표적인 10-plex TMT 라벨링 방식은 총 티올 채널로부터의 잠재적인 누화를 고려하여 샘플을 배열할 수 있는 방법을 보여줍니다. TMT 시약의 동위원소 불순물과 함께, 고강도(예: 총-티올)를 갖는 한 채널의 신호 강도는 낮은 신호 강도를 갖는 다른 채널에 기여하고 그의 정량화에 영향을 미칠 수 있다(37). 상기 계획에서, 풀링된 총-티올 채널(대조군 및 실험 샘플의 조합)은 높은 수준의 Cys-펩티드를 함유할 것으로 예상되고, 채널 130N에 신호를 가질 131N으로 표지된다. 따라서, 채널(130N)은 실험에 사용되지 않는다. TMT 라벨에 의해 생성된 채널 누화의 양은 해당 시약 배치에 대한 제조업체의 분석 인증서에서 확인할 수 있습니다. 이 수치는 Guo et al., Nature Protocols, 201425에서 채택되었습니다. 약어: NEM = N-에틸말레이미드; DTT = 디티오트레이톨; SDS-PAGE = 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; SPE = 고체상 추출; LC-MS / MS = 액체 크로마토 그래피-탠덤 질량 분석법; TMT = 탠덤 질량 태그. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: RAC 농축으로부터의 펩티드 분석. (A) 화학적 산화제인 디아미드로 처리된 RAW 264.7 세포로부터 산화된 펩티드를 증가하는 농도(0.1 및 0.5 mM)에서 30분 동안 총 펩티드 티올로 분석하였다. 이 하위 그림 및 하위 그림 D는 Guo et al., Nature Protocols, 2014 25에서 채택되었습니다. 펩티드는 은 염색에 의해 가시화되었다. (B) RAW 264.7 세포를 증가 농도의 외인성 산화제 (과산화수소 및 디 아미드)로 처리하였다. 생성된 SSG-농축 단백질 용출액을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 이어서 개별 단백질 (GAPDH, TXN, PRDX3 및 ANXA1)에 대해 웨스턴 블롯에 의해 프로빙하였다. 이 하위 그림은 Su et al., 자유 라디칼 생물학 및 의학, 201436에서 채택되었습니다. (C) Xcalibur 소프트웨어에서 본 시스테인 함유 펩타이드의 대표적인 MS/MS 스펙트럼 데이터. 삽입 된 MS / MS 이미지는 각 TMT 채널에서 동일한 펩타이드에 대한 해당 리포터 이온 강도를 보여줍니다. 이 실험에서, 총-티올 샘플을 TMT 라벨 131N에 할당하였고, 이는 실험에 사용된 모든 채널 중 가장 높은 강도를 갖는다. (D) LC-MS/MS로 측정한 iTRAQ 표지, 농축, 산화된 펩타이드의 화학량론. 전체-티올 채널은 전체-티올 채널의 그것과 비교하여 각 샘플의 리포터 이온 강도의 비율에 기초하여 산화의 화학량론을 계산하기 위한 기준으로서 사용되었다. 약어 : RAC = 수지 보조 캡처; SDS-PAGE = 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; Ctrl = 제어; GAPDH = 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소; TXN = 티오레독신; PRDX3 = 티오레독신-의존성 과산화물 환원효소; ANXA1 = 아넥신 A1; LC-MS / MS = 액체 크로마토 그래피-탠덤 질량 분석법; MS / MS = 탠덤 질량 분석법; TMT = 탠덤 질량 태그; iTRAQ = 상대 및 절대 정량을 위한 등압 태그. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 버퍼 이름 | 목적 | 목차 |
| 버퍼 A | 용해/균질화 | 250 mM 2- (N- 모르 폴리 노) 에탄 술폰산 (MES), pH 6.0; 1 % 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS); 1% 트리톤 X-100; 및 100 mM N-에틸말레이미드 (NEM) |
| 버퍼 B | 단백질 침전과 첫 번째 완충액 교환 후 재현탁 | 250 mM 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), pH 7.0; 8 M 우레아; 0.1 % SDS |
| 버퍼 C | 시스테인 함유 단백질의 환원/농축/소화 | 25 mM 헤페스, pH 7.7; 1 M 요소; 0.1 % SDS |
| 버퍼 D | 감소 후 두 번째 버퍼 교환 | 25 mM 헤페스, pH 7.0, 8 M 우레아; 0.1 % SDS |
| 버퍼 E | 수화 후 수지 세척 | 25 mM hepes, pH 7.7 |
표 1. 버퍼 목록
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Discussion
수지 보조 포획은 시스테인 잔기25,29,30의 산화 변형을 조사하기 위해 다양한 샘플 유형 및 생물학적 시스템에 걸쳐 활용되었습니다. 이 방법을 사용하면 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 사용한 단백질 및 펩타이드뿐만 아니라 질량 분석법을 사용하는 개별 시스테인 부위를 포함한 여러 수준 및 판독 값에서 샘플을 평가할 수 있습니다. 샘플 유형 또는 최종 종점에 관계없이, 상기 방법은 궁극적으로 시스테인-함유 단백질 및 펩티드38의 매우 효율적이고 특이적인 농축을 허용한다. RAC를 사용하여 섭동 후 다양한 모델 시스템에서 최대 수천 개의 시스테인 부위의 산화 상태 변화를 확인했습니다.
피로한 근육 수축을 받은 마우스에서 2,200개의 S-글루타티오닐화 부위가 확인되었으며, 절반 이상이 S-글루타티오닐화 수준이 유의하게 변경되었습니다.32. RAC는 또한 광합성 억제제 또는 다른 조명 조건에 노출 된 후 시아 노 박테리아에서 >2,100 개 부위의 가역적 티올 산화를 프로파일 링하는 데 사용되었습니다6. 최근에, 우리는휴식 조건 27에서 RAW 264.7 대 식세포 세포에서 >4,000 개의 시스테인 부위의 총 가역적 티올 산화 및 S- 글루타티 오닐화를 프로파일 링했습니다. 유사하게, Behring et al. 표피 성장 인자 자극 후 A431 세포에서 ~4,200개의 시스테인 부위의 산화를 정량화했습니다39. 이 연구는 가역적 티올 산화를 겪는 많은 시스테인 부위 (적어도 수천 개)를 식별하는 RAC의 견고성을 보여줍니다. 또한 샘플의 분획은 실험에서 회수된 펩타이드의 적용 범위를 향상시킬 수 있습니다.
실험 대조군 외에, 여기서 양성 또는 음성 대조군 샘플이 모델 시스템의 생물학적 반응을 확인하기 위해 사용될 수 있고, 전체-티올 농축은 티올의 산화와 병행하여 수행될 수 있다. 이 총 티올 샘플은 화학량론적 비교와 실험 또는 처리된 샘플을 비교할 수 있는 기준선을 모두 제공합니다. 요컨대, 이 총-티올 샘플은 주어진 샘플에서 주어진 Cys 부위에 대한 시스테인 티올의 총 수의 측정을 제공한다. 이 개념은 산화된 시스테인40과 비교하기 위해 "총 시스테인 함량"을 나타내는 완전히 환원된 티올을 포함하는 샘플을 생성하는 OxiTMT 방법에서도 채택되었습니다.
OxiTMT와 달리 RAC는 iodoTMT의 플렉스 수에 의해 제한되지 않으므로 연구에 사용된 여러 샘플 유형의 티올 함량을 더 잘 나타내기 위해 더 많은 총 티올 채널을 통합할 수 있습니다. 또한 티올 산화 환원 단백질체학 워크플로우와 병행하여 글로벌 샘플(농축 대상이 아님)을 준비하여 단백질 풍부도가 다양한 샘플 유형에서 변경되는지 확인해야 할 수 있습니다. 이 방법은 여러 유형의 산화 환원 변형에 적용 할 수 있으므로 특정 관심 수정에 대한 적절한 제어를 고려해야합니다. 예를 들어, 자외선과 염화수은은 모두 단백질에서 SNO를 절단하는 데 효과적이므로 SNO 7,25 측정에 효과적인 음성 대조군을 생성합니다. SSG 변형 단백질을 조사하기위한 효과적인 대조군은 환원 단계 동안 환원 칵테일에서 글루타레독신 효소를 생략하는 것입니다. 글루타레독신의 상대적으로 높은 특이성으로 인해, 그것의 생략은 SSG-변형된 단백질의 환원을 제거하고 이들이 이황화 교환을 겪는 것을 방지하고 궁극적으로 최종 분석에서 농축되는 것을 방지한다(36).
RAC의 워크플로에는 고품질의 재현 가능한 데이터 생성을 위한 기본적인 몇 가지 단계가 있습니다. 첫 번째 중요한 단계 중 하나이자 가장 중요한 것은 넓은 pH 범위41,42에서 빠르게 반응하는 막 투과성 알킬화제인 N-에틸말레이미드(NEM)를 사용하여 유리 티올의 알킬화/차단입니다. 이 단계는 샘플 처리 중에 초기 티올이 산화되는 것을 방지하고 이황화물 교환 농축 동안 이러한 인위적으로 산화 된 티올의 비특이적 농축을 완화합니다. 부적절한 알킬화는 이전 보고서6에서 확인된 바와 같이 배경 및 위양성 신호를 증가시킵니다.
그러나 반응성이 높고 유리 티올을 차단하는 능력으로 인해 농축 전에 샘플에서 완전히 제거되도록 주의해야 하며, 여기서 남은 NEM은 수지 결합과 결합하여 방해하여 궁극적으로 단백질 결합의 감소로 인한 신호 손실을 초래할 수 있습니다. 이는 분자량 차단 필터를 사용하여 아세톤 침전 및 여러 차례의 완충액 교환을 수행함으로써 달성됩니다. 프로토콜 전반에 걸쳐 적절한 pH를 모니터링하고 유지하는 것도 중요합니다. 6.0의 pH는 농축 전에 이황화 셔플링 및 혼합 이황화물의 형성을 완화하기 위해 유지됩니다. 각별한 주의를 기울여야 하는 다른 단계로는 농축 및 용리 단계가 있으며, 여기서 적절한 농축 및 용리를 위해 각각 7.7 및 8.0의 pH 값이 필요합니다. 이 단계에서 잘못된 pH 값은 신호의 감소 또는 손실을 초래합니다.
현재까지, 가장 많이 사용되는 방법인 비오틴 스위치 기법43,44를 포함하여 시스테인 티올 산화를 연구하는데 널리 사용되는 RAC 외에도 많은 화학 기반 방법이 있다. RAC를 포함하여 이러한 모든 방법의 공통점은 산화된 시스테인 검출을 위한 간접적인 방법을 기반으로 한다는 것입니다. 그들은 검출을 위해 원래 산화 된 티올의 화학적으로 변형 된 중간체에 의존합니다. 그러나 RAC를 다른 방법과 차별화하는 핵심 속성은 산화된 티올의 특정 시스테인 부위에 대한 멀티플렉싱된 정량적 데이터를 수집하는 능력입니다.
상기 방법은 수지에 공유결합된 단백질/펩티드로 수행되며, 이를 통해 추가 취급 없이 진행 단계(예: 환원, 표지, 세척, 소화)를 수행할 수 있습니다. 멀티플렉싱된 샘플에 대해 LC-MS/MS를 수행하면 단백질 분해체 전체의 발견이 가능한 데이터 세트가 생성됩니다. 여러 샘플 그룹에 걸친 특정 치료 또는 자극의 효과는 글로벌 수준에서 관찰되며, 이를 통해 새로운 메커니즘과 경로를 발견할 수 있습니다. 기본 워크플로는 최종 사용자의 특정 요구 사항과 관심 영역에 맞게 조정할 수 있습니다. 질량 분석 데이터에서 관찰된 결과의 직교 검증은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 특정 부위의 부위 지향 돌연변이 유발과 그에 따른 효과를 조사하는 분석의 활용은 일반적이지만 노동 집약적인 접근 방식입니다.
생물학적으로 유의할 수 있는 후보 부위를 스크리닝하기 위해, 생물정보학적 연구는 활성 부위 또는 2차 구조물에 대한 부위의 근접성과 같은, 높은 수준의 산화를 갖는 부위의 특성에 대해 더 많이 학습하기 위해 사용될 수 있다(27). 분자 역학 시뮬레이션은 단백질 구조에 대한 산화 환원 변형의 영향을 모델링하고 단백질의 기능이 어떻게 영향을 받을 수 있는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있으므로 향후 연구에서 큰 가치가 있음이 입증될 수 있습니다13,45. 이 강력한 전략을 구현함으로써 과학계가이 방법을 고유 한 모델 시스템에 적용하고 다양한 모델 및 생물학적 시스템에 걸쳐 산화 환원 생물학에 대한 현재 지식을 확장함으로써 이익을 얻기를 바랍니다.
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Disclosures
저자는 재정적 또는 기타 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
작업의 일부는 NIH 보조금 R01 DK122160, R01 HL139335 및 U24 DK112349의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride | Med Chem Express | HY-101794 | Reagent for in-house resin synthesis |
| 2.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 22431048 | |
| 5.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 30108310 | |
| 5.0 mL round bottom tubes | Falcon | 352054 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Activated Thiol–Sepharose 4B | Sigma Aldrich | T8512 | Potential replacement for thiol-affinity resin |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC5010BK | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Bicinchonicic acid (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | Protein Assay Reagent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Homogenizer | BioSpec Products | 985370 | |
| Iodoacetimide (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma Aldrich | 4259 | |
| NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow | Cytiva | 17-0906-01 | Reagent for in-house resin synthesis |
| QIAvac 24 Plus vacuum manifold | Qiagen | 19413 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L6026 | |
| Sonicator | Branson | 1510R-MT | |
| Spin columns | Thermo Scientific | 69705 | |
| Strata C18-E reverse phase columns | Phenomenex | 8B-S001-DAK | Peptide desalting |
| Thermomixer | Eppendorf | 5355 | |
| Thiopropyl Sepharose 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details). |
| TMT isobaric labels (16 plex) | Thermo Scientific | A44522 | Peptide labeling reagent; available in multiple formats |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin | Promega | V5820 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Vacufuge Plus speedvac | Eppendorf | 22820001 | vacuum concentrator |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 |
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