Describimos un protocolo detallado para la generación de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos y su uso en el modelado de enfermedades mitocondriales.
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Artículo de método
Generación de organoides cerebrales humanos para el modelado de enfermedades mitocondriales
En este artículo
Resumen
Resumen
Las enfermedades mitocondriales representan la clase más grande de errores congénitos del metabolismo y actualmente son incurables. Estas enfermedades causan defectos del neurodesarrollo cuyos mecanismos subyacentes aún no se han dilucidado. Un obstáculo importante es la falta de modelos efectivos que recapitulen el deterioro neuronal de inicio temprano observado en los pacientes. Los avances en la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) permiten la generación de organoides cerebrales tridimensionales (3D) que se pueden utilizar para investigar el impacto de las enfermedades en el desarrollo y la organización del sistema nervioso. Los investigadores, incluidos estos autores, han introducido recientemente organoides cerebrales humanos para modelar trastornos mitocondriales. Este artículo informa un protocolo detallado para la generación robusta de organoides cerebrales derivados de iPSC humanos y su uso en perfiles bioenergéticos mitocondriales y análisis de imágenes. Estos experimentos permitirán el uso de organoides cerebrales para investigar disfunciones metabólicas y de desarrollo y pueden proporcionar información crucial para diseccionar la patología neuronal de las enfermedades mitocondriales.
Introducción
Las enfermedades mitocondriales representan la mayor clase de errores congénitos del metabolismo1. Son causadas por mutaciones genéticas que interrumpen diferentes procesos mitocondriales, incluyendo la fosforilación oxidativa (OXPHOS)2, el ensamblaje de la cadena respiratoria, la dinámica mitocondrial y la transcripción o replicación del ADN mitocondrial3. Los tejidos con requerimientos energéticos se ven particularmente afectados por la disfunción mitocondrial4. En consecuencia, los pacientes con enfermedades mitocondriales suelen desarrollar manifestaciones neurológicas ....
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Protocolo
NOTA: El uso de iPSC humanas puede requerir una aprobación ética. Las iPSC utilizadas en este estudio se derivaron de individuos de control sanos después de la aprobación ética local (# 2019-681). Todos los procedimientos de cultivo celular deben realizarse bajo una campana de cultivo celular estéril, desinfectando cuidadosamente todos los reactivos y consumibles antes de transferirlos debajo del capó. Las iPSC humanas utilizadas para la diferenciación deben tener un número de paso inferior a 50 para evitar posibles aberraciones genómicas que puedan ocurrir en cultivos extensos. El estado pluripotente de las células debe validarse antes de la generación de organoides,....
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Resultados
El protocolo descrito aquí facilita la generación robusta de organoides redondos (Figura 1A). Los organoides generados contienen neuronas maduras que se pueden visualizar utilizando marcadores de proteínas específicos para axones (SMI312) y dendritas (proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2)) (Figura 1B).. Los organoides maduros contienen no solo células neuronales (MAP2-positivas) sino también células gliales .......
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Discusión
Este artículo describe la generación reproducible de organoides cerebrales derivados de iPSC humanos y su uso para el modelado de enfermedades mitocondriales. El protocolo aquí descrito se modifica en base a un trabajo publicado previamente20. Una ventaja importante del protocolo actual es que no requiere la incrustación manual de cada organoide en una matriz de andamios. De hecho, la solución matricial simplemente se disuelve en el medio de cultivo celular. Además, no hay necesidad de emplear bio.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses financieros o no financieros en competencia.
Agradecimientos
Agradecemos a Miriam Bünning por su apoyo técnico. Agradecemos el apoyo de deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 a A.P.), Spark y berlinesa Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), la United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.), y el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) (e: Bio joven investigador concede AZ 031L0211 a A.P.). El trabajo en el laboratorio de C.R.R. fue apoyado por el DFG (FOR 2795 "Sinapsis bajo estrés", Ro 2327/13-1).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoetanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Software de diseño; Editor de gráficos vectoriales | |
| Alexa Fluor 488 burro anti-conejillo de indias | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 burro anti-ratón | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimicina A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulina III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Láser de argón | Melles Griot | Cualquier otro láser, por ejemplo, láseres de diodo que emiten 488 también está bien | |
| Ácido ascórbico | Sigma | A92902 | |
| B-27 con vitamina A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% en PBS, almacene la solución a -20 & grados; C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Célula Célula Estrella Cultivo de células placa de 6 pocillos | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Concentrado de lípidos químicamente definido | Gibco | 11905031 | |
| Microscopio de barrido láser confocal C1 | microscopio Nikon | Microscopio confocal modular sistema | |
| Corning Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR) Matriz de membrana basal, sin fenol Libre de rojo, sin LDEV | Componente de la matriz | de 356231 | Corning |
| CyQUANT Kit de ensayo de proliferación celular | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Burro anticabra Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Burro anti-ratón Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Burro anti-conejo Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc Cámara | Nikon Microscopio Microscopio | ||
| de campo amplio vertical Eclipse 90i | Soluciones de microscopio Nikon | ||
| Microscopio vertical Eclipse E 600FN | de microscopio Nikon Microscopio | ||
| invertido Eclipse Ts2 | Microscopio Nikon | ||
| EZ-C1 Silver Versión 3.91 | microscopio Nikon | Software de imagen para microscopio confocal | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Suero fetal bovino | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Pipeta Pasteur de vidrio | Marca | 747715 | invertido |
| Gibco | 35050-061 | ||
| Láser de helio-neón | Melles Griot | Todos los demás láseres, por ejemplo, láseres de diodo que emiten 594 están bien, también | |
| Heparina | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubadora | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Imagen J 1.53c | Wayne Rasband Instituto Nacional de Salud | Software de procesamiento de imágenes | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Gibco | 10828010 | repuesto Knockout Serum | |
| (407 nm) | Coherente | Cualquier otro láser, por ejemplo, láseres de diodo que emiten 407 también está bien | |
| Map2 | Synaptic Systems | Nº 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medio |
| Multifuge X3R Centrífuga | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Kit de detección de micoplasma | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Suplemento | Gibco | 17502-048 | |
| Aguja de un solo uso (23G x 1" TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Software de imagen | |
| Oligomicina A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Agitador orbital Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pluma | Sigma | Z377821-1EA | Para dibujar una barrera hidrofóbica en diapositivas. |
| Kit del sistema de disociación de papaína | Worthington LK003150 | ||
| Paraformaldehído Merck | 818715 | 4% en PBS, solución de almacenamiento a -20 & grados; C | |
| Pipeta Pasteur 7 ml | VWR | 612-1681 | Graduada hasta 3 mL |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0,75 aire DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | microscopio seco Nikon | Objetivo de microscopio | |
| Apo VC 60x / 1.40 aceite DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Soluciones | de microscopio NikonMicroscopio de inmersión en aceite Objetivo Placa | |
| Petri de poliestireno (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Tubo de poliestireno de fondo redondo con tapón de filtro de celdas (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Cloruro de potasio | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Papel de filtro cualitativo | VWR | 516-0813 | |
| Inhibidor de rocas | Merck | SCM075 | |
| Rotenona | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Hojas de bisturí | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 Biolegend | 837904 | 1:500 | |
| Bicarbonato de sodio | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Cloruro de sodio | Roth | 3957 | |
| Sodio fosfato de dihidrógeno | Applichem | 131965 | |
| Piruvato de sodio | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Reactivo de disociación celular | Gibco/StemPro | A1110501 Reactivo A | |
| Glue Gel | UHU | 63261 | gel adhesivo |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Jeringa de un solo uso (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Placa 24 Pocillos | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Placa 6 Pocillos | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Campana | de cultivo de tejidosThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminado, cualquier otro micrótomo ajustable también está bien. | |
| Vibratome Wilkinson Hoja de afeitar clásica Espada | Wilkinson | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonista I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 analizador de flujo extracelular | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Ensayo DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Solución Calibrante | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (microplaca de 96 pocillos) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
Referencias
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K.
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Reimpresiones y permisos
