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Artículo de método

Generación de organoides cerebrales humanos para el modelado de enfermedades mitocondriales

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DOI:

10.3791/62756

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21 de junio de 2021

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1Department of General Pediatrics, Neonatology and Pediatric Cardiology, Duesseldorf University Hospital, Medical Faculty, Heinrich Heine University, 2Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University, 3Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC), 4Seaver Autism Center for Research and Treatment, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC)

En este artículo

Resumen

Describimos un protocolo detallado para la generación de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos y su uso en el modelado de enfermedades mitocondriales.

Resumen

Las enfermedades mitocondriales representan la clase más grande de errores congénitos del metabolismo y actualmente son incurables. Estas enfermedades causan defectos del neurodesarrollo cuyos mecanismos subyacentes aún no se han dilucidado. Un obstáculo importante es la falta de modelos efectivos que recapitulen el deterioro neuronal de inicio temprano observado en los pacientes. Los avances en la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) permiten la generación de organoides cerebrales tridimensionales (3D) que se pueden utilizar para investigar el impacto de las enfermedades en el desarrollo y la organización del sistema nervioso. Los investigadores, incluidos estos autores, han introducido recientemente organoides cerebrales humanos para modelar trastornos mitocondriales. Este artículo informa un protocolo detallado para la generación robusta de organoides cerebrales derivados de iPSC humanos y su uso en perfiles bioenergéticos mitocondriales y análisis de imágenes. Estos experimentos permitirán el uso de organoides cerebrales para investigar disfunciones metabólicas y de desarrollo y pueden proporcionar información crucial para diseccionar la patología neuronal de las enfermedades mitocondriales.

Introducción

Las enfermedades mitocondriales representan la mayor clase de errores congénitos del metabolismo1. Son causadas por mutaciones genéticas que interrumpen diferentes procesos mitocondriales, incluyendo la fosforilación oxidativa (OXPHOS)2, el ensamblaje de la cadena respiratoria, la dinámica mitocondrial y la transcripción o replicación del ADN mitocondrial3. Los tejidos con requerimientos energéticos se ven particularmente afectados por la disfunción mitocondrial4. En consecuencia, los pacientes con enfermedades mitocondriales suelen desarrollar manifestaciones neurológicas de inicio temprano.

Actualmente no existen tratamientos disponibles para los niños afectados con enfermedades mitocondriales5. Un obstáculo importante para el desarrollo farmacológico de enfermedades mitocondriales es la falta de modelos efectivos que recapitulen el curso de la enfermedad humana6. Varios de los modelos animales actualmente estudiados no presentan los defectos neurológicos presentes en los pacientes7. Por lo tanto, los mecanismos subyacentes a la patología neuronal de las enfermedades mitocondriales aún no se comprenden completamente.

Estudios recientes generaron iPSCs de pacientes afectados por enfermedades mitocondriales y utilizaron estas células para obtener células neuronales específicas del paciente. Por ejemplo, se ha encontrado que los defectos genéticos asociados a la enfermedad mitocondrial, el síndrome de Leigh, causan aberraciones en la bioenergética celular8,9, la síntesis de proteínas10 y la homeostasis del calcio9,11. Estos informes proporcionaron importantes pistas mecanicistas sobre el deterioro neuronal que ocurre en las enfermedades mitocondriales, allanando el camino para el descubrimiento de fármacos para estas enfermedades incurables12.

Las culturas bidimensionales (2D), sin embargo, no permiten la investigación de la complejidad arquitectónica y la organización regional de los órganos 3D13. Con este fin, el uso de organoides cerebrales 3D derivados de iPSCs específicas del paciente14 puede permitir a los investigadores obtener información adicional importante y, por lo tanto, ayudar a diseccionar cómo las enfermedades mitocondriales afectan el desarrollo y la función del sistema nervioso15. Los estudios que emplean organoides cerebrales derivados de iPSC para investigar enfermedades mitocondriales están comenzando a descubrir los componentes del neurodesarrollo de las enfermedades mitocondriales.

Los organoides de la médula espinal portadores de mutaciones asociadas con la enfermedad mitocondrial, la encefalopatía mitocondrial, la acidosis láctica y el síndrome de episodios similares a accidentes cerebrovasculares (MELAS), mostraron neurogénesis defectuosa y diferenciación retardada de la neurona motora16. Los organoides corticales derivados de pacientes con enfermedad mitocondrial, síndrome de Leigh, mostraron reducción de tamaño, defectos en la generación de brotes epiteliales neurales y pérdida de la arquitectura cortical17. Los organoides cerebrales de pacientes con síndrome de Leigh demostraron que los defectos de la enfermedad se inician a nivel de las células progenitoras neurales, que no pueden comprometerse con el metabolismo mitocondrial, causando ramificación neuronal aberrante y morfogénesis18. Por lo tanto, los progenitores neurales pueden representar un objetivo terapéutico celular para las enfermedades mitocondriales, y las estrategias que promueven su función mitocondrial pueden apoyar el desarrollo funcional del sistema nervioso.

El uso de organoides cerebrales podría ayudar a descubrir los componentes del neurodesarrollo de las enfermedades mitocondriales. Las enfermedades mitocondriales se consideran principalmente como neurodegeneración de inicio temprano5. Sin embargo, los defectos del neurodesarrollo también están presentes en pacientes afectados por enfermedades mitocondriales, incluyendo retraso en el desarrollo y deterioro cognitivo19. Los organoides cerebrales específicos del paciente pueden ayudar a abordar estos aspectos y dilucidar cómo las enfermedades mitocondriales pueden afectar el desarrollo del cerebro humano. La disfunción mitocondrial también podría desempeñar un papel patogénico en otras enfermedades neurológicas más comunes, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington4. Por lo tanto, dilucidar el impacto de los defectos mitocondriales en el neurodesarrollo utilizando organoides cerebrales también podría ser fundamental para el estudio de esas enfermedades. Este artículo describe un protocolo detallado para generar organoides cerebrales reproducibles que se pueden utilizar para realizar modelos de enfermedades mitocondriales.

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Protocolo

NOTA: El uso de iPSC humanas puede requerir una aprobación ética. Las iPSC utilizadas en este estudio se derivaron de individuos de control sanos después de la aprobación ética local (# 2019-681). Todos los procedimientos de cultivo celular deben realizarse bajo una campana de cultivo celular estéril, desinfectando cuidadosamente todos los reactivos y consumibles antes de transferirlos debajo del capó. Las iPSC humanas utilizadas para la diferenciación deben tener un número de paso inferior a 50 para evitar posibles aberraciones genómicas que puedan ocurrir en cultivos extensos. El estado pluripotente de las células debe validarse antes de la generación de organoides, por ejemplo, mediante la monitorización de la expresión de marcadores asociados a la pluripotencia como NANOG u OCT4. Las pruebas de micoplasma deben realizarse semanalmente para garantizar cultivos libres de micoplasma.

1. Generación de organoides cerebrales

  1. Cultura de las iPSC humanas
    1. Cultive iPSC humanas en condiciones libres de alimentador en medio iPSC (consulte la Tabla de materiales) en placas recubiertas de 6 pocillos y manténgalas en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados a 37 ° C y 5% de CO2.
      NOTA: El arrastre de células alimentadoras puede dificultar la diferenciación de los organoides. Pase las células al menos una vez en condiciones libres de alimentador.
    2. Pase las iPSC al 80% de confluencia utilizando un medio de desprendimiento libre de enzimas en proporciones que van desde 1: 4 a 1: 12. Para aumentar la supervivencia celular, agregue 10 μM inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) (Y27632) después de cada división.
  2. Disociar las iPSCs (80% de confluencia)-Día 0.
    1. Preparar el Medio de Diferenciación Cortical I (CDMI) (Tabla 1). Precalentar el medio CDMI a temperatura ambiente (22-25 °C) antes de añadirlo a las celdas.
    2. Lave los pocillos que contienen las iPSC con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar las células muertas y los desechos.
    3. Añadir 500 μL de reactivo precalentado A (Tabla de Materiales) a cada pozo e incubar durante 5 min a 37 °C. Verifique bajo el microscopio para asegurar el desprendimiento celular.
    4. Añadir 1 ml de medio iPSC para diluir el reactivo A y neutralizar su actividad.
    5. Utilice una pipeta de 1000 μL para disociar las células mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo y transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 ml.
    6. Centrifute suavemente las iPSC a 125 x g durante 5 min a temperatura ambiente (22-25 °C).
    7. Aspire cuidadosamente el sobrenadante para evitar perturbar la bolita celular.
    8. Resuspend el pellet con 1 mL de CDMI para obtener una suspensión unicelular, y contar el número de células.
    9. Preparar el medio de siembra con 9.000 iPSCs por 100 μL en CDMI suplementado con inhibidor de ROCK de 20 μM, inhibidor de WNT-catenina de 3 μM (IWR1) y 5 μM SB431542.
    10. Agregue 100 μL de medio de siembra por pocillo a una placa de fondo en V de 96 pocillos.
    11. Mantenga la placa en una incubadora de cultivo de tejido humidificado a 37 °C y 5% de CO2.
  3. Generación de neuroesferas
    1. En el día 1, observe que se están formando agregados de células redondas (neuroesferas) con bordes lisos definidos. Observe las celdas muertas alrededor de los agregados. Continuar cultivando en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
    2. El día 3, agita la placa golpeando los lados tres veces para separar las células muertas.
    3. Añadir 100 μL de CDMI suplementado con 20 μM de inhibidor de ROCK, 3 μM IWR1 y 5 μM SB431542 a cada pocillo.
    4. Devuelva la placa a la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
    5. El día 6, retire cuidadosamente 80 μL del medio sobrenadante de cada pocillo. Evite tocar el fondo del pozo.
    6. Añadir 100 μL de CDMI suplementado con 3 μM IWR1 y 5 μM SB431542 a cada pocillo. Devuelva la placa a la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
    7. Repita los pasos 5 y 6 cada 3 días hasta el día 18.
  4. Transferencia de neuroesferas
    1. El día 18, prepare cortical Differentiation Medium II (CDMII) (Tabla 1) y agregue 10 ml a una placa de cultivo celular de fijación ultrabaja de 100 mm.
    2. Use una pipeta de 200 μL con la punta cortada para transferir las neuroesferas redondas de la placa de 96 pocillos a la placa de cultivo celular de fijación ultra baja de 100 mm.
      NOTA: Sea suave para evitar dañar las neuroesferas asegurándose de que la abertura de la punta sea lo suficientemente ancha y que los agregados no se aspiren demasiado rápido.
    3. Retire 5 ml de medio de la placa que contiene las neuroesferas y agregue 5 ml de CDMII fresco.
      NOTA: Este procedimiento ayuda a reducir la cantidad de medio CDMI que puede haberse trasladado de la transferencia de neuroesferas.
    4. Coloque la placa en un agitador orbital a 70 rpm dentro de una incubadora de cultivo de tejidos humidificados a 37 °C y 5% de CO2.
      NOTA: Inspeccione visualmente las neuroesferas al día siguiente. Aumente la velocidad del agitador orbital si las neuroesferas están agrupadas o unidas a la parte inferior de la placa.
    5. Cada 3 días, aspire cuidadosamente el medio sobrenadante y reemplácelo con CDMII fresco. Deje una pequeña cantidad del medio para evitar que las neuroesferas se sequen.
    6. El día 35, preparar el Medio de Diferenciación Cortical III (CDMIII) (Tabla 1).
      NOTA: El componente de la matriz debe disolverse en CDMIII frío.
    7. Aspirar el medio de la placa y añadir 10 mL de CDMIII frío.
      NOTA: Es más efectivo usar medio frío para que el componente de la matriz pueda recubrir los organoides sin formar grumos.
    8. Después de cambiar el medio, coloque la placa de nuevo en un agitador orbital a 70 rpm dentro de una incubadora de cultivo de tejido humidificado a 37 ° C y 5% de CO2.
    9. Cambie el medio cada 3-5 días dependiendo de la tasa de crecimiento, según lo indique el color del medio.
    10. El día 70, preparar el Medio de Diferenciación Cortical IV (CDMIV) (Tabla 1). Use el medio CDMIV hasta que se alcance la edad deseada de los organoides. Durante este período, mantenga la placa en un agitador orbital a 70 rpm dentro de una incubadora de cultivo de tejido humidificado (37 ° C y 5% de CO2).
    11. Cambie el medio cada 3-5 días, dependiendo de la tasa de crecimiento.

2. Inmunotinción de organoides cerebrales

  1. Preparación de tejidos
    1. Prepare una solución de paraformaldehído al 4% (PFA) y colóquela debajo de una campana de seguridad.
      NOTA: Use equipo de seguridad personal cuando manipule PFA.
    2. Recoja los organoides cerebrales y transfiéralos suavemente con una pipeta Pasteur de plástico de punta roma de 3 ml a una placa de 6 pocillos llena de PFA.
      NOTA: Utilizar organoides de más de 40 días para permitir la visualización de estructuras con mayor complejidad celular.
    3. Mantenga los organoides en la solución de PFA durante 1 h a temperatura ambiente.
    4. Retire cuidadosamente el PFA con una pipeta Pasteur de plástico de 3 ml y lave los organoides fijos tres veces con PBS.
    5. Conservar los organoides fijos a 4 °C en PBS hasta su uso posterior.
  2. Preparación de rodajas de organoides cerebrales
    1. Prepare una solución de agar al 3% y caliente lentamente hasta que se licúe.
    2. Coloque el molde (el extremo cortado de una jeringa de 10 ml) sobre un trozo de papel de filtro absorbente (lado liso hacia arriba). Coloque una gota de agar sobre él.
    3. Saque rápidamente un solo organoide de la placa de 6 pocillos con una espátula y elimine el exceso de PBS con papel de filtro.
      NOTA: Tenga cuidado de no tocar el organoide directamente con papel de filtro.
    4. Coloque el organoide sobre la gota de agar.
    5. Repita este procedimiento con hasta tres organoides.
      NOTA: Trabaje rápido para evitar la solidificación del agar durante este paso.
    6. Rellene el molde con agar hasta que todos los organoides estén completamente cubiertos.
    7. Espere hasta que el agar comience a solidificarse y luego transfiera suavemente todo el molde que contiene los organoides, incluido el papel de filtro absorbente, a un elemento de enfriamiento.
      NOTA: Si un elemento refrigerante no está disponible, guarde los organoides durante unos minutos en un refrigerador a 4 °C.
    8. Mientras tanto, prepárese para el procedimiento de corte: coloque una cuchilla de afeitar (limpiada con acetona y lavada con agua de doble destilación) en el soporte del vibratomo, monte en el baño y llénela con PBS.
    9. Retire el molde del agar (solidificado) y use un bisturí para recortarlo y formar un cubo.
    10. Coloque el cubo de agar que contiene los organoides en la placa portadora del vibratomo con gel adhesivo (consulte la Tabla de materiales) y colóquelo en el baño que contenga PBS.
    11. Ajuste el vibratomo (consulte la Tabla de materiales) para cortar rodajas a un espesor de 150 μm.
      NOTA: Los ajustes del vibratomo (ángulo, amplitud, frecuencia y velocidad adecuados de la cuchilla) pueden ser similares a los utilizados para cortar tejido cerebral fijo derivado de animales postnatales tempranos. Sin embargo, los ajustes ideales dependen en gran medida del tipo de vibratomo y deben determinarse en un primer paso para evitar la distorsión o incluso la extracción del tejido durante el corte.
    12. Inicie el procedimiento de corte. Use una pipeta de vidrio o una espátula para transferir suavemente cada rebanada recién cortada a un plato de 24 pocillos lleno de PBS.
    13. Guarde la placa que contiene las rodajas a 4 °C (hasta por unos días) hasta su posterior procesamiento.
    14. Transfiera las rebanadas fuera de la placa con una pipeta de vidrio o una espátula a los portaobjetos del microscopio. Utilice un mínimo de 2 sectores por diapositiva.
    15. Retire con cuidado el agar y el exceso de PBS con una jeringa.
    16. Deje que las rodajas se sequen hasta que se adhieran a las diapositivas.
      NOTA: Si bien los portaobjetos de microscopio se pueden almacenar en cámaras de plástico llenas de PBS a 4 ° C, deben teñirse lo antes posible después del procedimiento de corte.
  3. Tinción inmunohistoquímica
    1. Preparar la solución de bloqueo (Tabla 1).
    2. Use una pluma PAP para dibujar un borde hidrofóbico alrededor de las rodajas en la diapositiva para ayudar a mantener todas las soluciones en las diapositivas.
    3. Agregue cuidadosamente la solución de bloqueo en el portaobjetos e incube durante 1 h a temperatura ambiente (22-25 ° C). Para evitar destruir el tejido, no agregue la solución directamente sobre las rodajas.
    4. Aspire la solución de bloqueo y aplique el anticuerpo primario deseado diluido en la solución de bloqueo.
    5. Incubar el portaobjetos durante la noche en una cámara humidificada a 4 °C.
    6. Enjuague la diapositiva tres veces con 1x PBS durante 10 minutos cada uno.
    7. Incubar las rodajas con el anticuerpo secundario específico diluido en la solución bloqueadora y realizar la tinción de Hoechst (1:2.500) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
      NOTA: Recuerde realizar controles negativos para confirmar que no hay unión no específica o autofluorescencia.
    8. Enjuague tres veces con 1x PBS durante 10 minutos cada uno en la oscuridad.
    9. Agregue una gota de medio de montaje a la rebanada, coloque una funda en el borde de la gota y coloque lentamente la hoja de cubierta hacia la rebanada para evitar burbujas de aire.
    10. Deje que el tobogán descanse durante la noche a temperatura ambiente. Aplique esmalte de uñas en el borde de la cubierta para sellar aún más la diapositiva. Para un almacenamiento a largo plazo, conservar a 4 °C.
  4. Documentación de la tinción
    1. Para escanear imágenes grandes para coser, utilice un microscopio vertical motorizado de campo amplio equipado con (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) un objetivo de alta calidad; Conjunto de filtros DAPI (por ejemplo, excitación (EX): 340-380 nm, espejo dicroico (DM): 400 nm, filtro de barrera (BA): 435-485 nm); conjunto de filtros de isotiocianato de fluoresceína (por ejemplo, EX: 465-495 nm, DM: 505 nm, BA: 515-555 nm); Conjunto de filtros Alexa594 (por ejemplo, ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); cámara digital; software de adquisición de alto rendimiento que permite puntadas automatizadas y operaciones de pila.
    2. Para el manejo de imágenes, use un programa de procesamiento de imágenes capaz de generar archivos tif de 8 bits, recortar puntos, ajustar el contraste y el brillo, fusionar los canales (por ejemplo, azul, verde y rojo) y agregar barras de escala.
    3. Para escanear detalles, utilice un microscopio de barrido láser confocal motorizado equipado con un objetivo de alta calidad, un láser UV (EX: 408 nm), un láser de argón (EX: 488 nm), un láser de helio-neón (EX: 543), software de imágenes para un microscopio confocal.
    4. Para el manejo de imágenes de detalles, utilice un programa de procesamiento de imágenes capaz de generar proyecciones de máxima intensidad de pilas z confocales (por ejemplo, secciones ópticas de 0,6 μm cada una), generar archivos tif de 8 bits, ajustar el contraste y el brillo, fusionar los canales (por ejemplo, azul, verde y rojo), agregar barras de escala.
    5. Utilice un editor gráfico para organizar las figuras.

3. Perfil bioenergético de organoides cerebrales

  1. Preparación de organoides para perfiles bioenergéticos
    1. Prepare la solución de papaína y DNasa siguiendo el protocolo del fabricante.
    2. Transfiera de 3 a 5 organoides a una placa de 6 pocillos. Lávelos dos veces con PBS precalentado.
    3. Añadir 2 ml de solución de papaína activada precalentada que contenga DNasa. Usando una cuchilla, corte los organoides en trozos pequeños.
    4. Coloque la placa en un agitador orbital a 27 rpm dentro de una incubadora de cultivo celular (a 37 °C, 5% de CO2) e incube durante 15-20 min.
      NOTA: El tiempo de incubación depende de la etapa organoide. Los organoides en etapa temprana se pueden usar tal como son. Para organoides mayores de 3 meses, se recomienda cortar los organoides en 2-3 piezas antes de la disociación e incubar las piezas a una velocidad de balanceo establecida a 27 rpm durante 15-20 min a 37 ° C. Este procedimiento puede ayudar a extirpar el tejido necrótico que puede estar presente en los organoides en etapa posterior.
    5. Recoger los tejidos digeridos en un tubo de 15 ml y añadir 5 ml de medio de cultivo organoide CDMIV (Tabla 1).
    6. Triture el tejido con una pipeta de plástico de 10 ml mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10-15 veces. Deje que el tejido no disociado se asiente hasta la parte inferior del tubo.
    7. Transfiera cuidadosamente la suspensión celular a un tubo de 15 ml, evitando cualquier trozo de tejido no disociado. Filtre la solución a través de un colador celular de 40 μm (por ejemplo, tubos de fondo redondo de poliestireno con tapas de colador celular).
    8. Pellet las células centrifugando a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    9. Evalúe el número de celda y la calidad utilizando el azul tripano.
    10. Coloque el número deseado (~ 20,000 / pozo) de células en microplacas recubiertas de 96 pocillos. Cambiar el medio 6-8 h después del recubrimiento a Medio Neuronal (Tabla 1).
    11. Incubar la microplaca recubierta de 96 pocillos en una incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2) durante 4 días.
  2. Perfiles bioenergéticos
    1. El día 3 después de volver a colocar las células disociadas, agregue 200 μL de solución de calibración en cada pozo de la parte inferior de la microplaca de 96 pocillos y coloque el cartucho del sensor verde superior sobre la microplaca hidratada.
      NOTA: Coloque el cartucho del sensor en la parte superior de la microplaca en la orientación correcta y asegúrese de que la solución de calibrante cubra todos los sensores.
    2. Incubar la microplaca hidratada de 96 pocillos en una incubadora sin CO2 a 37 °C durante la noche.
    3. Encienda el analizador para permitir que el instrumento se estabilice a 37 °C durante la noche.
    4. El día 4 después del replanteo, inspeccione el cultivo de organoides disociados en la microplaca de 96 pocillos bajo el microscopio para asegurarse de que las células aparezcan como una monocapa confluente.
    5. Preparar el medio de ensayo (Tabla 1).
    6. Retire neuronal Medium de todos los pocillos con una pipeta sin tocar el fondo del pozo para evitar daños celulares. Alternativamente, invierta cuidadosamente toda la placa y luego séquela en papel limpio. Trabaje rápidamente para evitar la muerte celular.
    7. Lave las células dos veces con 200 μL precalentados de medio de ensayo. Agregue assay medium a un volumen final de 180 μL por pozo. Incubar la microplaca de 96 pocillos en una incubadora sin CO2 a 37 °C durante 1 h.
    8. Preparar soluciones de 10 μM de inhibidores mitocondriales en medio de ensayo. Tenga en cuenta que la concentración final después de la inyección es de 1 μM.
    9. Cargue el cartucho del sensor colocado en la microplaca hidratada con 10x soluciones de los inhibidores mitocondriales.
      1. Añadir 18 μL de inhibidor mitocondrial 1 en el puerto A.
      2. Añadir 19,8 μL de inhibidor mitocondrial 2 en el puerto B.
      3. Añadir 21,6 μL de inhibidor mitocondrial 2 en el puerto C.
      4. Añadir 23,4 μL de inhibidor mitocondrial 3 en el puerto D.
    10. Coloque el cartucho cargado en la microplaca hidratada en una incubadora sin CO2 a 37 °C hasta el inicio del ensayo.
    11. Configure un protocolo en ejecución en el software del instrumento (Tabla 2).
    12. Presione START. Tome el cartucho cargado de la incubadora sin CO2 y colóquelo en el analizador para su calibración.
      NOTA: Asegúrese de que la placa esté insertada en la orientación correcta y sin la tapa.
    13. Una vez finalizado el paso de calibración, retire la placa de calibración. Tome la microplaca de 96 pocillos de la incubadora que no es de CO2 y colóquela en el analizador. Haga clic en CONTINUAR para iniciar las mediciones.
    14. Cuando termine la ejecución, retire la microplaca de cultivo celular de 96 pocillos del analizador y recoja el medio de todos los pocillos sin perturbar las células.
      NOTA: El medio puede almacenarse a -20 °C y utilizarse posteriormente para medir la cantidad de lactato liberado por las células en el medio utilizando un kit de ensayo de lactato apropiado.
    15. Lave las células con 200 μL de 1x PBS en cada pocillo.
    16. Después de retirar el PBS, congele la placa a -20 °C.
      NOTA: La placa congelada se puede utilizar para cuantificar células, proteínas o ADN en cada pocillo de la microplaca. Esta cuantificación será necesaria para normalizar las tasas bioenergéticas obtenidas. Siga las instrucciones del fabricante para los ensayos de cuantificación de células, proteínas o ADN.

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Resultados

El protocolo descrito aquí facilita la generación robusta de organoides redondos (Figura 1A). Los organoides generados contienen neuronas maduras que se pueden visualizar utilizando marcadores de proteínas específicos para axones (SMI312) y dendritas (proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2)) (Figura 1B).. Los organoides maduros contienen no solo células neuronales (MAP2-positivas) sino también células gliales ...

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Discusión

Este artículo describe la generación reproducible de organoides cerebrales derivados de iPSC humanos y su uso para el modelado de enfermedades mitocondriales. El protocolo aquí descrito se modifica en base a un trabajo publicado previamente20. Una ventaja importante del protocolo actual es que no requiere la incrustación manual de cada organoide en una matriz de andamios. De hecho, la solución matricial simplemente se disuelve en el medio de cultivo celular. Además, no hay necesidad de emplear bio...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses financieros o no financieros en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos a Miriam Bünning por su apoyo técnico. Agradecemos el apoyo de deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 a A.P.), Spark y berlinesa Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), la United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.), y el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) (e: Bio joven investigador concede AZ 031L0211 a A.P.). El trabajo en el laboratorio de C.R.R. fue apoyado por el DFG (FOR 2795 "Sinapsis bajo estrés", Ro 2327/13-1).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-mercaptoetanolGibco31350-010
Affinity DesignerSerif (Europe) LtdSoftware de diseño; Editor de gráficos vectoriales
Alexa Fluor 488 burro anti-conejillo de indiasSigma AldrichSAB4600033-250UL1:300
Alexa Fluor 488 burro anti-ratónThermo Fisher ScientificA-315711:300
Antimicina ASigma Aldrich1397-94-0
Anti-β-Tubulina III (TUJ-1)Sigma AldrichT85781:2000
Láser de argónMelles GriotCualquier otro láser, por ejemplo, láseres de diodo que emiten 488 también está bien
Ácido ascórbicoSigmaA92902
B-27 con vitamina AGibco17504044
Bacto AgarBecton Dickinson3% en PBS, almacene la solución a -20 & grados; C
BDNFMiltenyi Biotec130-093-0811
cAMPSigmaD0627
Célula Célula Estrella Cultivo de células placa de 6 pocillosGreiner-Bio-One657160
Concentrado de lípidos químicamente definidoGibco11905031
Microscopio de barrido láser confocal C1microscopio NikonMicroscopio confocal modular sistema
Corning Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR) Matriz de membrana basal, sin fenol Libre de rojo, sin LDEVComponente de la matrizde 356231Corning
CyQUANT Kit de ensayo de proliferación celularThermo FisherC7026
DMEM/F12ThermoFisher31330038
DMSOSigmaD2660-100ML
Burro anticabra Cy3Merck MilliporeAP180C1:300
Burro anti-ratón Cy3Merck MilliporeAP192C1:300
Burro anti-conejo Cy3Merck MilliporeAP182C1:300
DPBSGibco14190250
DS-Q1Mc CámaraNikon Microscopio Microscopio
de campo amplio vertical Eclipse 90iSoluciones de microscopio Nikon
Microscopio vertical Eclipse E 600FNde microscopio Nikon Microscopio
invertido Eclipse Ts2Microscopio Nikon
EZ-C1 Silver Versión 3.91microscopio NikonSoftware de imagen para microscopio confocal
FCCPSigma Aldrich370-86-5
Suero fetal bovinoGibco10270-106
GDNFMiltenyi Biotec130-096-291
Glasgow MEMGibco11710-035
Pipeta Pasteur de vidrioMarca747715invertido
Gibco35050-061
Láser de helio-neónMelles GriotTodos los demás láseres, por ejemplo, láseres de diodo que emiten 594 están bien, también
HeparinaMerckH3149-25KU
HERACell 240i CO2 IncubadoraThermo Scientific51026331
Hoechst 33342InvitrogenH35701:2500
Imagen J 1.53cWayne Rasband Instituto Nacional de SaludSoftware de procesamiento de imágenes
Injekt Solo 10 mL/ LuerBraun4606108V
Gibco10828010repuesto Knockout Serum
(407 nm)CoherenteCualquier otro láser, por ejemplo, láseres de diodo que emiten 407 también está bien
Map2Synaptic SystemsNº 1880041:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAAGibco11140-050
mTeSR PlusStemcell Technology85850iPSC medio
Multifuge X3R CentrífugaThermo Scientific10325804
MycoAlert Kit de detección de micoplasmaLonza# LT07-218
N2 SuplementoGibco17502-048
Aguja de un solo uso (23G x 1" TW)Neoject10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2NikonSoftware de imagen
Oligomicina ASigma Aldrich75351
Agitador orbital Heidolph Unimax 1010Heidolph543-12310-00
PAP PlumaSigmaZ377821-1EAPara dibujar una barrera hidrofóbica en diapositivas.
Kit del sistema de disociación de papaínaWorthington LK003150
Paraformaldehído Merck8187154% en PBS, solución de almacenamiento a -20 & grados; C
Pipeta Pasteur 7 mlVWR612-1681Graduada hasta 3 mL
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122
Plan Apo VC 20x / 0,75 aire DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0microscopio seco NikonObjetivo de microscopio
Apo VC 60x / 1.40 aceite DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13Solucionesde microscopio NikonMicroscopio de inmersión en aceite Objetivo Placa
Petri de poliestireno (100 mm)Greiner Bio-One664161
Tubo de poliestireno de fondo redondo con tapón de filtro de celdas (5 mL)Falcon352235
Cloruro de potasioRoth6781.1
ProLong Glass Antifade MoutantInvitrogenP36980
Papel de filtro cualitativoVWR516-0813
Inhibidor de rocasMerckSCM075
RotenonaSigma83-794
S100βAbcamAb111781:600
SB-431542Cayman Chemical Company13031
Hojas de bisturíHeinz Herenz Hamburq1110918
SMI312 Biolegend8379041:500
Bicarbonato de sodioMerck/Sigma31437-1kg-M
Cloruro de sodioRoth3957
Sodio fosfato de dihidrógenoApplichem131965
Piruvato de sodioGibco11360070
SOX2Santa Cruz BiotechnologySc-173201:100
StemPro Accutase Reactivo de disociación celularGibco/StemProA1110501 Reactivo A
Glue GelUHU63261gel adhesivo
SuperFrost PlusVWR631-0108
Jeringa de un solo uso (1 mL)BD Plastipak300015
TB2 ThermoblockBiometra
TC Placa 24 PocillosSarstedt83.3922
TC Placa 6 PocillosSarstedt83.392
TGFbeta3Miltenyi Biotec130-094-007
Campanade cultivo de tejidosThermoFisher51032711
TOM20Santa Cruz BiotechnologySC-114151:200
Triton-XMerckX100-5ML
UltraPure 0.5M EDTAInvitrogen15575020
Vibratome Microm HM 650 VThermo ScientificProduction terminado, cualquier otro micrótomo ajustable también está bien.
Vibratome Wilkinson Hoja de afeitar clásica EspadaWilkinson70517470
Whatman BenchkoteMerck/Sigma28418852
Wnt Antagonista IEMD Millipore Corp3378738
XF 96 analizador de flujo extracelularSeahorse Bioscience100737-101
XF Ensayo DMEM MediumSeahorse Bioscience103680-100
XF Solución CalibranteSeahorse Bioscience100840-000
XFe96 FluxPak (microplaca de 96 pocillos)Seahorse Bioscience102416-100
Soluciones de de Soluciones Soluciones de Soluciones de Glutamax Láser de Soluciones de de Super

Referencias

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