Artículo de método

Imágenes intravitales longitudinales a través de ventanas de silicona transparente

DOI:

10.3791/62757

⸱

5 de enero de 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presenta un enfoque para imágenes intravitales a largo plazo utilizando ventanas de silicona ópticamente transparentes que se pueden pegar directamente al tejido / órgano de interés y la piel. Estas ventanas son más baratas y versátiles que otras utilizadas actualmente en el campo, y la inserción quirúrgica causa inflamación y angustia limitadas a los animales.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopía intravital (IVM) permite la visualización del movimiento, la división y la muerte celular a resolución de una sola célula. La IVM a través de ventanas de imágenes insertadas quirúrgicamente es particularmente poderosa porque permite la observación longitudinal del mismo tejido durante días o semanas. Las ventanas de imágenes típicas comprenden una cubierta de vidrio en un marco de metal biocompatible suturado a la piel del ratón. Estas ventanas pueden interferir con el libre movimiento de los ratones, provocar una fuerte respuesta inflamatoria y fallar debido a vidrios rotos o suturas rotas, cualquiera de las cuales puede requerir eutanasia. Para abordar estos problemas, se desarrollaron ventanas para imágenes de órganos abdominales y glándulas mamarias a largo plazo a partir de una película delgada de polidimetilsiloxano (PDMS), un polímero de silicona ópticamente transparente utilizado anteriormente para ventanas de imágenes craneales. Estas ventanas se pueden pegar directamente a los tejidos, reduciendo el tiempo necesario para la inserción. PDMS es flexible, lo que contribuye a su durabilidad en ratones a lo largo del tiempo: se han probado hasta 35 días. Las imágenes longitudinales son imágenes de la misma región del tejido durante sesiones separadas. Se incrustó una rejilla de acero inoxidable dentro de las ventanas para localizar la misma región, lo que permitió la visualización de procesos dinámicos (como la involución de la glándula mamaria) en los mismos lugares, con días de diferencia. Esta ventana de silicona también permitió el monitoreo de células cancerosas diseminadas individuales que se convierten en micrometástasis con el tiempo. Las ventanas de silicona utilizadas en este estudio son más fáciles de insertar que las ventanas de vidrio con marco de metal y causan una inflamación limitada de los tejidos fotografiados. Además, las rejillas integradas permiten un seguimiento sencillo de la misma región del tejido en sesiones repetidas de imágenes.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopía intravital (IVM), la imagen de tejidos en animales anestesiados, ofrece información sobre la dinámica de eventos fisiológicos y patológicos a resolución celular en tejidos intactos. Las aplicaciones de esta técnica varían ampliamente, pero la IVM ha sido fundamental en el campo de la biología del cáncer para ayudar a dilucidar cómo las células cancerosas invaden los tejidos y hacen metástasis, interactúan con el microambiente circundante y responden a los medicamentos 1,2,3. Además, la IVM ha sido clave para avanzar en la comprensión de los complejos mecanismos que gobiernan las respuestas inmunes al proporcionar información complementaria a los enfoques de perfiles ex vivo (por ejemplo, citometría de flujo). Por ejemplo, los experimentos de imágenes intravitales han revelado detalles sobre las funciones inmunes en relación con la migración celular y el contacto célula-célula y han ofrecido una plataforma para cuantificar la dinámica espaciotemporal en respuesta a una lesión o infección 4,5,6,7. Muchos de estos procesos también se pueden estudiar a través de la tinción histológica, pero solo la IVM permite el seguimiento de los cambios dinámicos. De hecho, mientras que una sección histológica ofrece una instantánea del tejido en un momento dado, las imágenes intravitales pueden rastrear eventos intercelulares y subcelulares dentro del mismo tejido a lo largo del tiempo. En particular, el progreso en el etiquetado de fluorescencia y el desarrollo de reporteros moleculares han permitido que los eventos moleculares se correlacionen con comportamientos celulares, como la proliferación, la muerte, la motilidad y la interacción con otras células o la matriz extracelular. La mayoría de las técnicas de IVM se basan en la microscopía de fluorescencia, que debido a la dispersión de la luz, hace que las imágenes de tejidos más profundos sean un desafío. El tejido de interés, por lo tanto, a menudo necesita ser expuesto quirúrgicamente con un procedimiento a menudo invasivo y terminal. Por lo tanto, dependiendo del sitio del órgano, el tejido se puede visualizar continuamente durante un período que varía de unos pocos a 40 h8. Alternativamente, la inserción quirúrgica de una ventana de imagen permanente permite la obtención de imágenes del mismo tejido secuencialmente durante un período de días a semanas 7,9.

El desarrollo de nuevas ventanas de imagen se ha destacado como una necesidad tecnológica para mejorar aún más los enfoques de imagen intravital10. La ventana de imagen intravital prototípica es un anillo metálico que contiene una funda de vidrio asegurada a la piel con suturas11. La interferencia con el libre movimiento, la acumulación de exudado y el daño a la cubierta de vidrio son problemas comunes que se observan con el uso de tales ventanas. Además, la ventana prototípica requiere una producción especializada, y el procedimiento quirúrgico puede requerir una capacitación extensa. Para abordar estos problemas, el polidimetilsiloxano (PDMS), un polímero de silicona, que anteriormente se ha utilizado en ventanas craneales para imágenes a largo plazo en el cerebro12, se adaptó para su uso en imágenes de órganos abdominales y glándulas mamarias. Aquí, se presenta un método detallado para generar ventanas de silicona basadas en PDMS, que incluye cómo fundir la ventana alrededor de una rejilla de acero inoxidable para proporcionar puntos de referencia para imágenes repetidas de las mismas regiones de tejido. Además, se describe un procedimiento quirúrgico simple y sin puntos de sutura para insertar la ventana sobre los órganos abdominales o la glándula mamaria. Este nuevo enfoque supera algunos de los problemas más comunes con las ventanas de imágenes utilizadas actualmente y aumenta la accesibilidad de las imágenes intravitales longitudinales.

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Protocolo

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Todos los procedimientos descritos se realizaron de acuerdo con las Pautas Quirúrgicas del Laboratorio de Cold Spring Harbor y habían sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Laboratorio de Cold Spring Harbor.

1. Fundición de la ventana de silicona

  1. Prepare el polímero de silicona (PDMS) mezclando el elastómero base y el agente de curado en una proporción de 10: 1 (v / v).
  2. Funda una ventana depositando una pequeña cantidad de PDMS en una superficie estéril y lisa y ajusta la relación volumen-área al espesor deseado.
    NOTA: El uso de 200 mg de solución de polímero para un círculo de 22 mm de diámetro en la tapa de una tapa de 24 placas de pozo da como resultado un buen compromiso entre la robustez de la ventana y la claridad óptica.
  3. Opcional: Para proporcionar puntos de referencia para imágenes repetidas de las mismas regiones de tejido, presione ligeramente una rejilla de acero inoxidable en la silicona después de que el PDMS esté en la superficie de fundición deseada.
  4. Para eliminar las burbujas de aire, coloque la superficie recubierta en un desecador al vacío durante 45 minutos para desgasificar el polímero.
  5. Curar las ventanas de silicona en un horno a 80 °C durante 45 min.
  6. Puntúe el polímero en los bordes del molde y pele suavemente las ventanas curadas de la superficie utilizada para la fundición con fórceps.
  7. Antes de la cirugía, esterilice las ventanas en autoclave.

2. Preparación del ratón para la inserción de la ventana de silicona

  1. Anestesiar al ratón en una cámara de inducción utilizando isoflurano al 4% (v/v). Mueva el ratón a una almohadilla de calentamiento en la mesa quirúrgica, coloque el ratón en la máscara nasal de anestesia y reduzca la concentración de isoflurano al 2% para el mantenimiento durante toda la cirugía.
  2. Verifique la profundidad de la anestesia pellizcando los dedos de los pies de las extremidades posteriores. No proceda hasta que el ratón esté inactivo y no muestre una respuesta refleja de pellizco del dedo del pie.
  3. Aplique lubricante oftálmico en los ojos para evitar que se sequen y prevenir traumatismos.
  4. Administrar analgesia preventiva (buprenorfina 0,05 mg/kg) por vía subcutánea.
  5. Afeitar el sitio quirúrgico y eliminar completamente el vello con una crema depilatoria.
  6. Aplique la solución de povidona yodada (10% v / v) y etanol (70% v / v) consecutivamente 3 veces para prevenir la infección del sitio quirúrgico.

3. Inserción de una ventana ventral para la obtención de imágenes en el hígado; adaptable para otros órganos abdominales (Figura 1)

  1. Coloque el ratón en posición supina.
  2. Haga una incisión de 10 mm a partir de 3 mm hacia abajo del proceso xifoide con tijeras y fórceps estériles.
  3. Retire una sección de piel de 1–1,5 cm2 a lo largo de la línea media.
  4. Use un segundo par de tijeras y fórceps estériles para eliminar una sección del peritoneo ligeramente más pequeña que la sección de la piel.
  5. Opcional: Para visualizar una porción más grande del hígado, use hisopos de algodón estériles humedecidos con solución salina estéril para empujar el hígado hacia abajo desde el diafragma revelando el ligamento falciforme que conecta el hígado con el diafragma. Cortar el ligamento teniendo cuidado de no cortar la vena cava inferior.
  6. Retire el adhesivo quirúrgico con una jeringa de 31 G, aplique una pequeña cantidad de él en la superficie del hígado alrededor de los bordes del área a fotografiar. Este adhesivo crea un sello circular, dejando el área central intacta para la obtención de imágenes.
    PRECAUCIÓN: Limite el adhesivo a pequeñas gotas que formen un patrón circular alrededor del área de imágenes. No se puede obtener una imagen del tejido inmediatamente en contacto con el adhesivo. No es necesario secar el tejido antes de aplicar el adhesivo.
    NOTA: Cualquier adhesivo a base de cianoacrilato se puede utilizar con éxito para este procedimiento. El adhesivo quirúrgico asegura la esterilidad. Para los procedimientos terminales, los súper pegamentos de uso múltiple producen buenos resultados.
  7. Coloque la ventana con fórceps y manténgala firmemente contra el hígado hasta que el adhesivo se haya secado (~ 2 min).
  8. Dobla los bordes de la ventana debajo del peritoneo.
  9. Con una jeringa, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en los bordes de la ventana que ahora están debajo del peritoneo. Empuje hacia abajo el peritoneo con fórceps para asegurarlo a la ventana.
  10. Del mismo modo, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico sobre el peritoneo antes de empujar hacia abajo la piel con fórceps para asegurarlo al peritoneo.
    NOTA: Si se realiza correctamente, un área circular de tejido hepático ahora debe ser visible a través de la ventana.
  11. Aplique pegamento alrededor de los bordes de la ventana para crear un borde que ayudará a evitar que la piel vuelva a crecer sobre la ventana.
    PRECAUCIÓN: Si el procedimiento se lleva a cabo utilizando técnicas quirúrgicas estériles y la ventana se esteriliza antes de la inserción, el sellado de la herida con adhesivo quirúrgico es suficiente para evitar infecciones. Sin embargo, la falta de seguimiento de las técnicas asépticas adecuadas durante la inserción quirúrgica o el cierre imperfecto puede provocar una infección manifiesta o subclínica y la desecación del tejido.

4. Inserción de una ventana lateral para la obtención de imágenes en el hígado; compatible con la inyección simultánea de células cancerosas en la vena porta (Figura 2)

  1. Coloque el ratón en la posición del decúbito lateral izquierdo
  2. Haga una incisión de 10 mm en el flanco derecho 3 mm por debajo del arco costal usando tijeras y fórceps estériles.
  3. Retire una sección de piel de 1 cm2 .
  4. Use un segundo par de tijeras y fórceps estériles para eliminar una sección del peritoneo ligeramente más pequeña que la sección de la piel.
  5. Retire el adhesivo quirúrgico con una jeringa de 31 G, aplique una pequeña cantidad de él en la superficie del hígado alrededor de los bordes del área a fotografiar.
    PRECAUCIÓN: Limite el adhesivo a pequeñas gotas que formen un patrón circular alrededor del área de imágenes. No se puede obtener una imagen del tejido inmediatamente en contacto con el adhesivo.
    NOTA: Cualquier adhesivo a base de cianoacrilato se puede utilizar con éxito para este procedimiento. El adhesivo quirúrgico asegura la esterilidad. Para los procedimientos terminales, los súper pegamentos de uso múltiple producen buenos resultados.
  6. Coloque la ventana con fórceps y manténgala firmemente contra el hígado hasta que el adhesivo se haya secado (~ 2 min).
  7. Dobla los bordes de la ventana debajo del peritoneo.
  8. Con una jeringa, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en los bordes de la ventana que ahora están debajo del peritoneo. Empuje hacia abajo el peritoneo con fórceps para asegurarlo a la ventana.
  9. Del mismo modo, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico sobre el peritoneo antes de empujar hacia abajo la piel con fórceps para asegurarlo al peritoneo.
    NOTA: Si se realiza correctamente, un área circular de tejido hepático ahora debe ser visible a través de la ventana.
  10. Aplique pegamento alrededor de los bordes de la ventana para crear un borde que ayudará a evitar que la piel vuelva a crecer sobre la ventana.
  11. Si se requiere una inyección en la vena porta:
    1. Coloque el ratón en posición supina.
    2. Haga una incisión de 10 mm a partir del proceso xifoide en la piel.
    3. Usando un segundo par de tijeras y fórceps estériles, haga una incisión de 10 mm en el peritoneo.
    4. Sumerja dos hisopos de algodón en solución salina estéril.
    5. Use los hisopos de algodón para tirar suavemente del intestino sobre una gasa estéril humedecida con solución salina estéril, teniendo cuidado de no torcer o alterar la orientación.
    6. Siga desplazando el intestino de la cavidad abdominal hasta que la vena porta sea visible en el lado derecho del abdomen.
    7. Inserte una aguja de 31–33 G caudal de 5–7 mm hasta el punto de entrada de la vena porta en el hígado, asegurándose de proceder dentro del vaso sanguíneo y no a través de él.
    8. Inyecte lentamente las células cancerosas (resuspendidas en 100 μL de PBS estéril).
      NOTA: Para este experimento, la línea celular de cáncer de páncreas amurino (por ejemplo, KPC-BL/6-1199) se puede cultivar en medios DMEM completos y 1 x 105 células inyectadas en 100 μL de PBS estéril.
    9. Para prevenir el sangrado, inmediatamente después de retirar la aguja, aplique una presión suave en el sitio de la inyección con un pequeño trozo de esponja quirúrgica durante 1-2 min.
    10. Después de liberar la presión, controle el sitio durante 1-2 minutos para garantizar la hemostasia.
    11. Usando hisopos de algodón humedecidos, devuelva el intestino a la cavidad abdominal siguiendo la orientación fisiológica del órgano.
    12. Usando fórceps estériles, inserte la ventana inmediatamente debajo del peritoneo, en el lado izquierdo de la cavidad abdominal del ratón.
    13. Sutura con suturas de seda 4-0 y grapa la incisión de la línea media con clips enrollados de acero inoxidable de 7 mm.
    14. Mueva el ratón a la posición del decúbito lateral izquierdo
    15. Haga una incisión de 10 mm en el flanco derecho 3 mm debajo del arco costal a través de la piel usando tijeras y fórceps estériles.
    16. Retire una sección de piel de 1 cm2 alrededor de la incisión.
    17. Use un segundo par de tijeras y fórceps estériles para eliminar una sección del peritoneo ligeramente más pequeña que la sección de la piel.
    18. Tire de la ventana en su lugar sobre el hígado antes de pegarla en su lugar, como se describe en los pasos 4.8 a 4.10.

5. Inserción de la ventana para la obtención de imágenes en el páncreas (Figura 3)

  1. Coloque el ratón en la posición del decúbito lateral derecho.
  2. Haga una incisión de 10 mm en el flanco izquierdo 3 mm por debajo del arco costal usando tijeras y fórceps estériles.
  3. Retire una sección de piel de 1 cm2 alrededor de la incisión.
  4. Use un segundo par de tijeras y fórceps estériles para eliminar una sección del peritoneo ligeramente más pequeña que la sección de la piel.
  5. Usando hisopos de algodón estéril empapados con solución salina estéril, tire suavemente del bazo para visualizar el páncreas. Proceda a reposicionar el páncreas con los hisopos de algodón humedecidos para hacer visible más área de superficie a través de la incisión.
    NOTA: En este punto, las células de cáncer de páncreas se pueden inyectar ortotópicamente en el páncreas si es parte del diseño experimental.
  6. Retire el adhesivo quirúrgico con una jeringa de 31 G, aplique una pequeña cantidad de él en la superficie del páncreas alrededor de los bordes del área a fotografiar.
    PRECAUCIÓN: Limite el adhesivo a pequeñas gotas que formen un patrón circular alrededor del área de imágenes. No se puede obtener una imagen del tejido inmediatamente en contacto con el adhesivo.
  7. Coloque la ventana con fórceps y manténgala firmemente contra el páncreas hasta que el adhesivo se haya secado (~ 2 min).
  8. Dobla los bordes de la ventana debajo del peritoneo.
  9. Con una jeringa, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en los bordes de la ventana que ahora están debajo del peritoneo. Empuje hacia abajo el peritoneo con fórceps para asegurarlo a la ventana.
  10. Del mismo modo, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico sobre el peritoneo antes de empujar hacia abajo la piel con fórceps para asegurarlo al peritoneo.
    NOTA: Si se realiza correctamente, un área circular de tejido pancreático ahora debe ser visible a través de la ventana.
  11. Aplique pegamento alrededor de los bordes de la ventana para crear un borde que ayudará a evitar que la piel vuelva a crecer sobre la ventana.

6. Inserción de la ventana para la obtención de imágenes en la glándula mamaria (Figura 4)

  1. Coloque el ratón en posición supina.
  2. Haga una incisión medial de 10 mm en uno de los pezones inguinales con tijeras y fórceps estériles.
  3. Retire una sección de piel de 0,5 cm2 por encima de la glándula mamaria.
  4. Use un segundo par de tijeras estériles para separar cuidadosamente la glándula mamaria de la piel extendiendo las tijeras entre las dos superficies para interrumpir la adherencia.
    NOTA: Para facilitar la obtención de imágenes del área de la glándula mamaria inguinal, tenga cuidado de diseccionar una porción de piel por encima de la glándula mamaria pero superior a la pata trasera, de modo que la ventana no limite la movilidad del ratón.
  5. Retire el adhesivo quirúrgico con una jeringa de 31 G, aplique una pequeña cantidad de él en la superficie de la glándula mamaria alrededor de los bordes del área a fotografiar.
    PRECAUCIÓN: Limite el adhesivo a pequeñas gotas que formen un patrón circular alrededor del área de imágenes. No se puede obtener una imagen del tejido inmediatamente en contacto con el adhesivo.
  6. Coloque la ventana con fórceps y manténgala firmemente contra la glándula mamaria hasta que el adhesivo se haya secado (~ 2 min).
    NOTA: Un área circular de tejido de la glándula mamaria ahora debe ser visible a través de la ventana si se realiza correctamente.
  7. Dobla los bordes de la ventana debajo de la piel.
  8. Con una jeringa, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en los bordes de la ventana que ahora están debajo de la piel. Empuje hacia abajo la piel con fórceps para asegurar la piel a la ventana.
  9. Aplique pegamento alrededor de los bordes de la ventana para crear un borde que ayudará a evitar que la piel vuelva a crecer sobre la ventana.

7. Recuperación postquirúrgica

  1. Coloque el ratón en una jaula de recuperación limpia con abundante material de anidación, asegurándose de que parte de la jaula descanse sobre una almohadilla térmica.
  2. Monitoree el mouse continuamente hasta que esté consciente y móvil.
  3. Si es necesario, proporcione una dosis adicional de analgésico 12 h después de la dosis preventiva.
    NOTA: La analgesia adicional generalmente es innecesaria, pero consulte con un veterinario si el ratón muestra signos de angustia (como espalda encorvada, pelaje descuidado o pérdida de interés en la comida). Monitoree al ratón diariamente durante los primeros 3 días después de la cirugía para detectar signos de infección u otros efectos adversos. Menos del 2% de los ratones requieren atención veterinaria o eutanasia, generalmente debido al desprendimiento parcial de la ventana. Es importante tener en cuenta que para los ratones machos con ventanas de imágenes hepáticas ventrales, la lucha entre ratones puede provocar el desprendimiento de las ventanas. Esto se evita alojando a los ratones por separado.

8. Imágenes a través de la ventana

  1. Anestesiar al ratón en una cámara de inducción utilizando isoflurano al 4% (v/v).
  2. Aplique lubricante oftálmico en los ojos para evitar que se sequen y prevenir traumatismos.
  3. Mueva el ratón de la cámara de inducción a la etapa del microscopio. Coloque al ratón en la máscara nasal de anestesia y reduzca la concentración de isoflurano a aproximadamente 1-1.5% para la anestesia de mantenimiento durante todo el procedimiento de imágenes.
  4. Coloque un sensor de almohadilla de presión debajo del mouse para monitorear la frecuencia respiratoria y fije el mouse al escenario con cinta quirúrgica suave.
  5. Inserte un termómetro rectal para controlar la temperatura corporal durante toda la sesión de imágenes.
  6. Encienda la almohadilla térmica, monitoreando el mouse de cerca para asegurarse de que la temperatura corporal no exceda los 37 ° C.
  7. Utilice software para monitorear la frecuencia respiratoria del mouse. La velocidad óptima es de ~ 1 respiración / segundo. Ajuste la anestesia según sea necesario.
  8. Antes de cada sesión de imágenes, limpie la ventana de cualquier medio de inmersión residual de la lente y los desechos limpiándola suavemente con un hisopo de algodón sumergido en etanol al 70% (v / v).
  9. Cuando utilice una lente de inmersión en agua, aplique gel de ultrasonido en la ventana, evitando burbujas.
    NOTA: El agua destilada también se puede utilizar, pero puede requerir una nueva aplicación durante la toma de imágenes.
  10. Para encontrar la profundidad óptima para la obtención de imágenes, primero, ubique la cuadrícula y colóquela en foco.
  11. Determine la profundidad aproximada de las imágenes de tejido estableciendo la parte inferior de la cuadrícula en 0. Esta información es necesaria para localizar el plano z correspondiente en las sesiones de imagen posteriores.
  12. Para identificar la misma ubicación en varias sesiones de imágenes, utilice los cuadrados de la cuadrícula como punto de referencia. Durante la obtención de imágenes, observe la orientación de la cuadrícula y la ubicación dentro de la cuadrícula de cada campo de visión fotografiado (por ejemplo,2ª fila desde la parte superior,4ª cuadrada desde la izquierda).
  13. Durante las sucesivas sesiones de imágenes, use la cuadrícula para navegar de regreso a áreas de cuadrícula específicas y, por lo tanto, a campos de imágenes.
  14. Después de cada sesión de imágenes, retire cualquier medio de inmersión residual de la lente y los desechos limpiando suavemente la ventana con un hisopo de algodón sumergido en etanol al 70% (v / v).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las imágenes intravitales a través de ventanas de imágenes se pueden usar para observar, rastrear y cuantificar una amplia gama de eventos celulares y moleculares a resolución de una sola célula durante un período de horas a semanas. Las características ideales para una ventana de imágenes incluyen: a) impacto limitado en el bienestar del ratón y la fisiología del tejido; b) durabilidad; c) simplicidad de inserción; y d) puntos de referencia claros para imágenes repetidas de la misma región. El resultado es una ventana d...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las ventanas de imágenes intravitales son herramientas importantes para visualizar directamente los procesos fisiológicos y patológicos a resolución celular a medida que se desarrollan con el tiempo. El novedoso procedimiento descrito para fundir e insertar ventanas de imágenes de silicona flexibles en ratones supera algunos de los problemas más comunes con las ventanas de imágenes utilizadas actualmente (exudado, rotura e interferencia con la movilidad normal), proporciona seguridad adicional para el ratón y aumenta la ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E. es miembro del consejo asesor de investigación de brensocatib para Insmed, Inc.; miembro del consejo asesor científico de Vividion Therapeutics, Inc.; un consultor para Protalix, Inc.; y posee acciones en Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T. es cofundadora de Mestag Therapeutics, y forma parte del consejo asesor científico y posee acciones en Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology y Cygnal Therapeutics. Los otros autores no declaran intereses contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Rob Eifert por su ayuda en el diseño y optimización de las rejillas de acero inoxidable cortadas con láser. Este trabajo fue apoyado por el CSHL Cancer Center (P30-CA045508) y fondos para M.E. de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (1R01CA2374135 y 5P01CA013106-49); CSHL y Northwell Health; la Fundación de la Familia Thompson; Nadar a través de América; y una subvención de la Fundación Simons a CSHL. M.S. fue apoyado por el National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) y el National Cancer Institute of the NIH bajo el número de premio 1F30CA253993-01. L.M. cuenta con el apoyo de una beca postdoctoral de la Fundación James S. McDonnell. J.M.A. ha recibido una beca postdoctoral del Instituto de Investigación del Cáncer/Irvington (Premio CRI #3435). D.A.T. cuenta con el apoyo del Laboratorio Dedicado a la Investigación del Cáncer de Páncreas de la Fundación Lustgarten y la Fundación de la Familia Thompson. Los dibujos animados fueron creados con Biorender.com.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
3M Medipore Cinta Quirúrgica de Tela Suave3M70200770819
Sutura de seda 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2Ethicon Ratones N267H
ACTB-ECFP JacksonLaboratory22974
AEC Substrate Kit, Peroxidasa (HRP), (3-amino-9-etilcarbazol)Vector Laboratories SK-4200
Hisopos con alcoholBD 
Sistema de anestesiaProductos de imagen molecular Co.
Acqknowledge software y sensores BIOPACACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray LORIS109-08
c-fms-EGFP (MacGreen)ratones Laboratorio Jackson18549
ratones C57BL/6JLaboratorio Jackson664
Anticuerpo monoclonal CD45 (30-F11)Invitrogen14-0451-82
Anticuerpo CD68Abcamab125212
Esponjas de gasa Curity Covidien
Burro Anti-Cabra IgG H& L (HRP) Abcamab6885
Burro Anti-Conejo IgG H& L (HRP) Abcamab97064
Burro Anti-Rata IgG H& L (HRP) Abcamab102182
Dow SYLGARD 184 Encapsulante de siliconaMicroscopía electrónica clara Ciencias24236-10Dos partes, relación de mezcla 10:1
Vidrio de cubierta redondo, 8 mm de diámetro, espesor # 1.5  Ciencias de la microscopía electrónica72296-08
Ender-3 Pro Impresora 3DShenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Manta térmica de infrarrojo lejanoKent ScientificRT-0520
Fc Bloqueador de receptoresInnovex BiosciencesNB309
procesamiento de imágenes de Fijihttps://imagej.net/software/fiji/
Carboxilato FluoroSpheres, 0.04µ m, amarillo-verde (505/515)InvitrogenF8795
Sistema de compuerta:BIOPAC Systems Inc.Los componentes juntos permiten monitorear los signos vitales del ratón durante la obtención de imágenes y controlar la adquisición de imágenes en la respiración del ratón. Todos fueron adquiridos a los sistemas BIOPAC.
Acqconocimiento software ACK100W, módulo de
diferencia, serie C DA100C
Sistema de Doble Puerta para animalesDTU200 
MP160 para Windows - Sistema de análisisMP160WSW 
MouseOx Plus 120V MOX-120V; 015000 
Almohadilla de presión TSD110 
GelfoamPfizer9031508Esponja de gelatina absorbible
Tijeras finas endurecidasFine Science Tools14090-11Dos pares; acero inoxidable, puntas afiladas
, punta recta, filo de corte de 26 mm
, 11 cm de longitud
Anticuerpo Humano/Ratón Mieloperoxidasa/MPOR& D SystemsAF3667
Esterilizador de perlascalientes Fine Science Tools18000-45Encienda aproximadamente 30 min
antes de usar; Esterilizar las herramientas a >200
° C para 30 s
Imaris Bitplanewww.bitplane.com
Medio de inmersión Immersol W 2010Zeiss444969-0000-000 
Jeringas de insulina con aguja ultrafina BD 6 mm x 31 G 1 mL/ccBD324912
Isoflurano (Fluriso)VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (Tomate) Lectina (LEL, TL), DyLight® 594Vector Laboratories DL-1177-1
LysM-eGFPratones www.mmrrc.org012039-MU
Micro pinzas de disecciónRobozRS-5135Dentado, ligera curva, 0,8 mm de ancho de punta; 4" de longitud
Pinzas de microdisecciónRobozRS-51531 x 2 dientes, ligera curva, 0,8 mm de ancho de punta
, 4" de longitud
MTS Sistemas MiniBionix II 808MTSMáquina servohidráulica de prueba
de materiales Sonda de elastasa de neutrófilos 680 FASTPerkinElmerNEV11169
NitrogenGeneral Welding Supply Corp.
Suministrode soldadura general de oxígeno Corp.
Filamento de ácido polilácticoHatchbox1,75 mm de diámetro
ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36970
Pomada oftálmica PuralubeDechra NDC17033-211-38
Reflex 7 pinzas para heridasRoboz SurgicalRS-9255
Rejilla de acero inoxidableFotofabUna rejilla tiene 0,200 pulgadas de diámetro, con un total de 52 cuadrados de rejilla individuales de 0,016 x 0,016 pulgadas. Hay 0.003 pulgadas de espacio entre cada cuadrado.  
Placas de cultivo de tejidos estériles tratadas en superficieFisher ScientificFB012929Tapa utilizada como superficie de curado para ventanas de imagen
TriM Scope Microscopio multifotónico LaVision BioTecse realizaron en un microscopio vertical de 2 fotones (Trimscope, LaVision BioTec) equipado con dos láseres Ti:Sapphire (Mai Tai e InSight, Spectra-Physics) y un oscilador paramétrico óptico. Se utilizaron los siguientes divisores de haz dicroicos de paso largo (Chroma) para dirigir la señal hacia cuatro tubos fotomultiplicadores:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond3M70200742529
VWR micro cubreobjetos VWR48404-453
326895Paquete de amplificación de ACK100M pequeños Las imágenes de

Referencias

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