Summary
Este manuscrito descreve o método de mancha e mergulho para congelar manualmente espécimes biológicos para microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas.
Abstract
Imagens de amostras biológicas com elétrons para determinação de estrutura de alta resolução por microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas (crioEM) requer uma fina camada de gelo vítreo contendo as biomoléculas de interesse. Apesar de numerosos avanços tecnológicos nos últimos anos que impulsionaram o crioEM de partículas únicas à vanguarda da biologia estrutural, os métodos pelos quais os espécimes são vitrificados para imagens de alta resolução muitas vezes permanecem o passo limitante da taxa. Embora numerosos esforços recentes tenham proporcionado meios para superar obstáculos frequentemente encontrados durante a vitrificação de espécimes, incluindo o desenvolvimento de novos suportes de amostras e instrumentação inovadora de vitrificação, o tradicional êmbolo operado manualmente continua sendo um grampo na comunidade crioem devido ao baixo custo de compra e facilidade de operação. Aqui, fornecemos métodos detalhados para o uso de um dispositivo padrão, no estilo guilhotina operado manualmente para a vitrificação de amostras biológicas para imagens de alta resolução por crioEM de uma única partícula. Além disso, problemas comumente encontrados e recomendações de solução de problemas para quando uma preparação padrão não produz uma amostra adequada também são descritas.
Introduction
Microscopia criogênica de elétrons de partículas únicas (crioEM) é uma técnica estrutural poderosa que pode ser usada para resolver estruturas de espécimes biológicos dinâmicos para resolução quase atômica1,2,3,4. De fato, os recentes avanços nas tecnologias diretas de detector de elétrons4,5,6,7,8,9,10, melhorias nas fontes de elétrons4,11,12,13,14, e estabilidade de lentes eletromagnéticas15, juntamente com o desenvolvimento contínuo da aquisição de dados 16,17 e pacotes de software de análise18,19, permitiram aos pesquisadores determinar rotineiramente estruturas de espécimes bem comportados para resolução de 3 Å ou melhor 4,11,13,14,20,21,22,23 . Apesar desses recursos aprimorados de imagem e processamento de dados, a preparação da rede crioEM continua sendo o maior impedimento para uma determinação bem-sucedida da estrutura de alta resolução e muitas vezes serve como um gargalo considerável no fluxo de trabalho EM24,25,26,27.
O CrioEM baseia-se na imagem de amostras biológicas em soluções aquosas que são congeladas para formar uma fina película de gelo "semelhante a vidro" - um processo conhecido como vitrificação - que preserva o estado bioquímico nativo. A vitrificação de amostras biológicas para crioEM remonta a mais de 40 anos28,29,30 e muitas técnicas e equipamentos que foram desenvolvidos para este processo dependem do método originalmente detalhado de blot-and-plunge31,32,33,34,35 , pelo qual um pequeno volume de amostra (por exemplo, 1-5 μL) é aplicado a uma grade EM especializada antes que a solução em excesso seja removida usando interação física da grade com papel de mancha. O tempo deste processo é geralmente empiricamente determinado para cada espécime como um componente crítico das amostras de congelamento é a espessura do filme de gelo vítreo - se o gelo é muito grosso, então a qualidade da imagem se deteriora dramaticamente devido ao aumento da dispersão do feixe de elétrons, enquanto o gelo que é muito fino pode restringir orientações proteicas e/ou excluir partículas do centro dos buracos de papel alumínio da grade36 . Essa dependência da espessura perfeita do gelo para crioEM de partículas únicas levou a uma ampla gama de técnicas e equipamentos que podem congelar amostras, incluindo robótica37,38, microfluidos42 e dispositivos ultrassônicos ou pulverizadores27,39,40,41,42,43,44 . Nos últimos anos, alguns dos dispositivos de preparação de amostras mais populares dependem do uso de robótica para congelamento automatizado de amostras usando a técnica de blot-and-plunge45. Embora esses dispositivos sejam projetados para criar de forma reprodutivelmente a espessura adequada do gelo para imagens, eles muitas vezes permanecem muito caros para laboratórios individuais comprarem e operarem e são geralmente encontrados dentro de instalações crioEM a taxas horárias para uso. Nos últimos anos, a técnica original de blot-and-plunge manual voltou a ser usada em aumento3,47,48,49,50,51,52. De fato, um dispositivo de blot-and-plunge operado manualmente pode alcançar grades crioEM de alta qualidade a uma fração do custo das contrapartes robóticas. Além disso, a mancha manual também oferece mais controle dos usuários sobre a mancha, pois os pesquisadores podem ajustar o tipo de mancha (ou seja, mancha traseira da grade, mancha frontal da grade, etc.), e tempo de mancha com base em cada amostra individual e questões de pesquisa.
Neste artigo, fornecemos detalhes sobre como congelar efetivamente amostras biológicas usando um dispositivo de vitrificação manual tradicional, juntamente com uma plataforma de guerra personalizada53. As melhores práticas, incluindo preparação do criogen, manuseio da grade, aplicação da amostra e manchas, bem como armadilhas e recomendações comuns sobre como superar esses obstáculos são fornecidas. São discutidos conselhos sobre como aumentar a reprodutibilidade da espessura do gelo entre as preparações da rede e como modificar a mancha de amostra com base no tipo de espécime biológico. Dado o baixo custo associado à compra e operação do êmbolo manual descrito neste manuscrito, laboratórios em todo o mundo podem preparar espécimes biológicos para crioEM de forma econômica e reprodutível.
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Protocol
1. Prepare o ambiente manual de mergulho
NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 5-30 minutos
- Localize o êmbolo manual em uma sala fria de 4 °C onde um umidificador possa ser co-localizado para manter a sala perto de 100% de umidade relativa (RH) (Figura 1A).
ATENÇÃO: Consulte as diretrizes de Saúde e Segurança Ambiental da instituição para a localização segura do êmbolo manual e as operações recomendadas. - Antes da preparação da grade, ligue o umidificador na sala fria para garantir que a RM da sala fria seja ≥ 95 %.
NOTA: A preparação da grade em baixa umidade pode resultar em desidratação de filmes finos, alteração de componentes tampão devido à evaporação e diminuição da reprodutibilidade grade-grade46. Não é recomendado congelar grades a <80 % RH. - Certifique-se de que a temperatura da sala fria está em 4 °C.
- Localize o êmbolo manual longe de fortes correntes de ar (ou seja, longe das aberturas da unidade de ar condicionado) pois elas podem levar à turbulência perto de grades e/ou acúmulo de gelo proeminente em superfícies frias.
2. Prepare materiais e acessórios de mergulho
NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 1-5 minutos
- Use uma tesoura limpa para cortar círculos de papel manchado em tiras de 1-1,5 cm de largura e ~9 cm de comprimento. Evite tocar no centro do papel manchador e descarte as peças finais menores. É importante garantir que as tiras de papel manchado estejam secas, limpas e livres de contaminantes. Separe as tiras e coloque-as em uma placa de Petri de 100 mm.
- Coloque uma tampa de vidro quadrado de 22x22 mm em uma placa de vidro de vidro separada de 60 mm. Esta placa de vidro contendo tampas de vidro será usada para armazenar, transferir e grades de descarga de brilho.
NOTA: Recomenda-se usar uma lata de espanador de ar para remover quaisquer detritos visíveis do slide antes de adicionar grades. Uma arma anti-estática também pode ser usada para remover qualquer eletricidade estática que se acumule. - Montar e rotular caixas de armazenamento de grade.
- Adquira 4 a 6 pinças de fixação limpas e secas e localize-as para o êmbolo manual. Inspecione visualmente cada pinça antes de mergulhar para garantir que elas não estejam danificadas e estejam livres de contaminantes.
3. Prepare o criogen dewar e o êmbolo manual
NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 5-15 minutos
- Instale a base da plataforma na parte inferior da dewar mergulhando. Coloque o navio de etano de guerra em cima da base da plataforma, adicione o vaso de etano de latão e, em seguida, instale a plataforma de armazenamento da grade giratória.
- Uma vez que o nitrogênio líquido (LN2) é adicionado ao dewar mergulhando, a altura da base da plataforma não pode mais ser ajustada. Certifique-se de que a base da grade está instalada corretamente e está nivelada para limitar danos na grade e/ou na pinça devido à altura inadequada do êmbolo.
- Antes de congelar, verifique o êmbolo manual e todos os equipamentos auxiliares para garantir que estejam funcionando corretamente para limitar a perda da amostra e/ou da grade.
- Antes de cada sessão de congelamento, substitua a fita no braço manual do êmbolo usado para segurar a pinça. A alta umidade da sala pode deteriorar o adesivo da fita e diminuir a capacidade da fita de segurar a pinça, aumentando a probabilidade de danos na pinça e/ou perda de grade.
- Ajuste a lâmpada perto do êmbolo manual para garantir que haja luz suficiente para monitorar a frequência da amostra e certifique-se de que a transferência da grade seja facilmente visualizada para evitar danos e/ou perdas na grade (ver etapa 3.7). Use uma lâmpada de anel diretamente atrás do êmbolo para visualizar o movimento líquido e uma luz flexível de tarefa de braço perto da dewar para iluminar as grades congeladas.
- Ajuste a tensão do pedal do pé para garantir que o braço de deguer seja bem retido no lugar enquanto estiver na posição elevada e esteja totalmente liberado quando o pedal estiver deprimido. Realize várias corridas "secas" antes da aplicação da amostra para garantir que o êmbolo esteja funcionando corretamente.
NOTA: O ajuste inadequado da tensão do pedal do pé resultará na liberação prematura do braço mergulhador (ou seja, a tensão é muito baixa) e a perda da grade ou a queda incompleta da grade no vaso de etano (ou seja, a tensão é muito alta). - Coloque o dewar mergulhando na base do êmbolo manual diretamente abaixo do braço mergulhando e fixá-lo no lugar. Coloque um par de pinças no braço de mergulho usando a fita adesiva. Ao segurar o braço de mergulho manual, pressione o pedal do pé para abaixar cuidadosamente o braço mergulhando e ajustar a viagem do braço mergulhador para garantir que a grade se localize no meio do vaso de etano.
- Use a parada de colisão na parte superior do braço mergulhando para determinar a posição final do braço mergulhando quando o pedal do pé estiver totalmente deprimido (Figura 1B). Ajuste a altura da parada de colisão no braço de mergulho para ajustar a localização da grade no vaso de etano (Figura 1C).
NOTA: A configuração inadequada da altura do braço pode levar à grade e/ou dano à pinça (por exemplo, a altura do braço mergulhando é muito baixa) ou a vitrificação inadequada (por exemplo, a altura do braço mergulhando é muito alta). - Localize o dewar fora da sala fria e prossiga para preparar o etano líquido (passo 4).
4. Prepare o criogen
NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 10-30 minutos
- Avalie o tanque de etano, regulador, tubulação e ponta de distribuição de etano para qualquer sinal de dano. Informe imediatamente e retifique quaisquer sinais de dano antes de prosseguir.
ATENÇÃO: As misturas de etano e etano comprimidos: as misturas de gás propano são inflamáveis e podem representar uma séria ameaça à vida e/ou resultar em ferimentos se manuseadas incorretamente. Consulte um especialista se não tiver certeza de como operar ou manusear tanques de gás comprimido. Consulte as diretrizes de Saúde e Segurança Ambiental da instituição ao manusear gases comprimidos inflamáveis. Além disso, o etano liquefeito é um poderoso criogen que pode representar uma séria ameaça à vida e/ou lesão se não for manipulado corretamente. Consulte as diretrizes de Saúde e Segurança Ambiental da instituição ao manusear criogens. - Adquira LN2 suficiente em um dewar de manuseio LN2 apropriado (ou seja, 3-4 L é típico para preparação e armazenamento de grade).
ATENÇÃO: LN2 é um criogen que pode representar uma séria ameaça à vida e/ou lesão se não for manipulado corretamente.- Certifique-se de que todos os equipamentos de proteção individual sejam utilizados para minimizar o risco de ferimentos. O vapor de LN2 é asfixiante e deve ser manuseado em áreas bem ventiladas. Consulte um especialista se não tiver certeza de como operar ou lidar com vasos criogênicos e criogens. Consulte as diretrizes de Saúde e Segurança Ambiental da instituição ao manusear criogens. Para situações em que o nitrogênio líquido não pode ser usado em uma sala fria, recomendamos mergulhar em um espaço fresco e bem ventilado.
- Fora da sala fria, esfrie a dewar mergulhando despejando LN2 diretamente no vaso de etano de latão até que o nível de nitrogênio líquido atinja o topo do vaso de etano (ou seja, logo acima da plataforma). Cubra o LN2 fora do vaso de etano, conforme necessário. Prossiga para o próximo passo quando o LN2 parar de borbulhar violentamente (aproximadamente 5 minutos).
- Adicione LN2 diretamente ao recipiente de etano de latão para resfriar suficientemente o vaso antes de condensar o gás de etano. A falha em resfriar adequadamente o vaso de etano de latão aumentará drasticamente o tempo necessário para condensar o etano.
- Uma vez que a dewar tenha atingido a temperatura LN2 , evite encher demais o dewar de tal forma que lN2 derrama no vaso de etano.
- O etano vem como um gás comprimido e precisa ser liquefeito para uso. O tanque de etano utiliza um regulador de dois estágios de alta pureza para controlar o fluxo de gás. Conecte a tubulação à válvula de saída reguladora e use uma ponta de distribuição de metal plana de calibre 14 conectada na extremidade para dispensar o etano.
- Antes de abrir a válvula principal do tanque de etano, certifique-se de que o botão de ajuste de pressão e a válvula de saída estejam fechados o tempo todo. Abra totalmente a válvula do tanque principal e, em seguida, abra a válvula de saída para ~50%. Abra lentamente o botão de ajuste da pressão até que seja observado um fluxo lento de gás. Use a válvula de saída para ajustar o fluxo de gás.
ATENÇÃO: Aponte sempre a ponta de distribuição metálica para longe de si mesmo ao abrir válvulas ou fazer ajustes de fluxo de gás. - Inicie lentamente o fluxo de gás e avalie a vazão inserindo a ponta da linha de gás etano em um pequeno béquer de água desionizada. Ajuste o fluxo de gás até que a vazão perturbe moderadamente a água.
- Ajuste a taxa de fluxo de gás para garantir que ocorra condensação adequada do etano - muito lenta de uma taxa de fluxo fará com que o gás de etano se solidifique na ponta de distribuição e muito rápido de uma taxa de fluxo resultará em borbulhamento intenso e evitará o congelamento.
- Antes de inserir a ponta da linha de gás etano no recipiente de etano de latão, limpe e limpe a ponta de distribuição com delicados lenços de tarefa para remover qualquer água.
- Em um movimento suave e rápido, localize a ponta de distribuição de gás na parte inferior do vaso de etano de latão e comece a mover a ponta de distribuição em um círculo lento ao redor da parte inferior do vaso de etano. O etano sólido se formará imediatamente, mas rapidamente liquefazerá à medida que mais gás de etano for adicionado/condensado.
- Continue a mover a ponta de distribuição de etano metálico na parte inferior do vaso de etano para liquefazer o etano sólido. Encha o recipiente de etano a 3/4 cheio de etano líquido (2-3 roscas do topo). Pare o fluxo de gás etano removendo cuidadosamente a ponta de distribuição de etano metálico do vaso de etano de latão e fechando a válvula de saída.
- Cubra o dewar mergulhando com LN2 derramando suavemente na lateral da dewar para evitar a adição de LN2 ao vaso de etano de latão, até que o nível líquido apenas toque o vaso de etano de latão. Coloque a tampa de espuma na dewar mergulhando para facilitar a solidificação do etano.
- O LN2 deve entrar em contato diretamente com o navio de etano de latão para auxiliar na solidificação do etano. Após aproximadamente 5 minutos, o etano dentro do vaso de latão ficará completamente congelado. Adicione mais LN2 até que ele apenas toque no vaso de etano e prossiga para o próximo passo.
- Se o etano não congelou sólido, então o vaso de etano de latão não é frio o suficiente para os passos restantes. Adicione mais LN2 até que ele apenas toque no vaso de etano e espere mais 5 minutos. Certifique-se de que o etano dentro do vaso de latão está completamente congelado.
- Abra a válvula de saída de gás para produzir um fluxo de gás etano a uma taxa semelhante à determinada na etapa 4.6. Coloque verticalmente a ponta de distribuição de etano metálico no etano sólido e continue a mover a ponta de distribuição de etano em um movimento circular para derreter o etano sólido.
- Continue adicionando etano até que esteja nivelado com o topo do vaso de etano de latão. Remova lentamente a ponta do vaso de etano e feche a válvula de saída do tanque de etano. Cubra a deguerra com a tampa por ~1-4 minutos(s) para deixar o etano solidificar ao redor das bordas do vaso de etano de latão.
NOTA: Um vaso de etano ideal terá um anel simétrico de 2-3 mm de etano sólido no perímetro do navio de etano de latão com etano líquido no centro (Figura 1D e Figura 2). - Certifique-se de que o etano seja o mais frio possível sem se solidificar para garantir a vitrificação adequada do espécime biológico. A não preparação adequada do etano líquido pode resultar em vitrificação inadequada da amostra, acúmulo de gelo e/ou perda de espécime, cada um contribuindo para a deterioração da qualidade da amostra para a imagem.
- Se um anel sólido de etano não se formar após 2-3 minutos, adicione mais LN2 ao dewar e cubra por mais 2-5 minutos.
- Se o etano estiver se solidificando muito rapidamente, use um grande par de pinças limpas para aquecer suavemente o vaso de etano e/ou etano sólido para evitar a solidificação completa do etano. Uma vez que o etano e lN2 estejam estáveis, feche todas as válvulas do tanque de etano e localize o dewar mergulhando no êmbolo manual. Fixar o dewar mergulhando no êmbolo manual.
ATENÇÃO: Tenha cuidado extra ao transferir o dewar, pois o LN2 pode derramar no vaso de etano e solidificar o etano líquido. Se necessário, um conjunto limpo de pinças pode ser usado para derreter qualquer etano sólido no meio do vaso.
- Continue adicionando etano até que esteja nivelado com o topo do vaso de etano de latão. Remova lentamente a ponta do vaso de etano e feche a válvula de saída do tanque de etano. Cubra a deguerra com a tampa por ~1-4 minutos(s) para deixar o etano solidificar ao redor das bordas do vaso de etano de latão.
- Teste a localização do dewar de etano com um par de pinças vazias para garantir que a ponta da pinça se localize no centro da nave de etano e haja espaço suficiente para a grade e ponta de pinça dentro do etano líquido (Figura 1D).
- Se o anel de etano sólido for muito grosso para facilitar o manuseio da grade, então use um par de temperatura ambiente, limpe pinças para derreter o etano sólido e crie mais área de congelamento no centro do vaso de etano.
5. Prepare grades EM
NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 1-5 minutos
- Adicione a caixa de armazenamento da grade(es) ao dewar, desaparafusar as tampas da caixa de armazenamento da grade e certifique-se de que cada tampa possa girar livremente para um novo slot de grade.
- Transfira cuidadosamente as grades da caixa de armazenamento da grade para a borda da tampa de vidro quadrado com ~30-40% da grade fora da borda de slides. Certifique-se de que a folha da grade está voltada para cima. Certifique-se de que as grades estão cobertas quando não estiverem em uso. Colocar as grades sobre a borda da tampa quadrada de vidro proporciona facilidade de manuseio da grade e diminui a chance de dobrar ou danificar a grade durante a transferência.
NOTA: As grades 4-6 são normalmente preparadas de cada vez. - Renderizar grades hidrofílicas usando um descarregador de brilho ou limpador de plasma.
NOTA: Consulte as diretrizes recomendadas para a limpeza da rede fornecidas pelo fabricante de limpador de descarga de brilho/limpador de plasma.- Use as redes dentro de 10 minutos após a limpeza do plasma à medida que as redes perdem hidrofilialidade e a reprodutibilidade da rede diminui após este tempo.
6. Prepare o espécime crioEM por mergulhar congelando
NOTA: Tempo estimado de operação: >10 minutos (~1-3 min por grade)
- Use uma pinça de fixação limpa e seca para pegar uma grade limpa, deslize o grampo plástico para baixo para fixar a grade no lugar e bata suavemente na pinça para garantir que a grade esteja bem presa.
- Manuseie as grades pelo anel externo para evitar danos à folha da grade.
- Aplique de 1 a 5 μL de amostra para o lado preparado (por exemplo, lado dianteiro ou de papel alumínio) da grade.
NOTA: O volume ideal e o tempo de mancha dependem da amostra e precisam ser otimizados para cada amostra; volumes maiores e amostras mais viscosas requerem tempos mais longos de manchas. - Fixar o conjunto de amostras de pinça-grade ao braço de mergulho manual, enrolando fita adesiva ao redor da alça da pinça.
- Encare a amostra em direção ao usuário para a mancha frontal tradicional. Se a amostra exigir manchas traseiras, localize a amostra longe do usuário.
- Segure um pedaço limpo, seco e cortado de papel manchador entre o polegar e o dedo indicador de cada mão.
- Apenas manuseie os papéis de manchas das bordas e nunca toque no centro, pois óleos e outros contaminantes das mãos/luvas podem alterar a qualidade da rede.
- Descanse as mãos na borda da dewar mergulhando para estabelecer uma posição estável. Localize o papel de mancha paralela à superfície da grade aproximadamente 1 cm de distância da superfície da grade.
- Use a parte central do papel de mancha para permitir a mobilidade completa do fluido e até mesmo a desarmamento através da superfície da grade.
- Deslize suavemente e gire os dedos do polegar e do anel em direção um ao outro para dobrar o papel manchado em direção à grade para iniciar a mancha. Mantenha contato entre o papel de mancha e a superfície da grade durante todo o processo de mancha.
- Entre em contato diretamente com o papel de mancha para a superfície da grade e mantenha contato consistente através da superfície da grade.
- Dobrar suavemente o papel de mancha diminui a dobra da grade e/ou dano à superfície da grade, e resulta em gelo mais consistente em toda a grade (Figura 3A).
- Observe a frente líquida móvel e uma vez que ele pare de progredir para o papel de mancha comece a contar por 4 a 6 segundos.
NOTA: A contagem pode ocorrer quando o papel de mancha entrar em contato com a superfície da rede, mas pode ocorrer reprodutibilidade de grade para grade mais baixa. O tempo total da mancha dependerá do tipo de grade, tipo de folha, concentração amostral e tipo de amostra (por exemplo, solúvel versus membrana versus proteínas filamentosas). Para mais amostras viscosas serão necessários tempos mais longos de manchas (por exemplo, de 5 a 7 segundos).- Importante: Desenvolver um esquema de contagem confiável e consistente para melhorar muito a reprodutibilidade durante o processo de congelamento.
- Mova os dedos esquerdo, polegar direito e indicador em direções opostas para remover o papel de mancha em um "movimento de estalo" para longe da superfície da grade. Imediatamente pressione o pedal do pé para soltar o braço mergulhando e mergulhe a grade em etano líquido.
- Remova simultaneamente o papel de mancha e pressione o pedal do pé para mergulhar a grade no etano o mais rápido possível para obter melhores resultados de congelamento. Quanto maior o tempo entre a remoção de papel e o mergulho, mais evaporação de filmes finos ocorrerá e diminuirá a reprodutibilidade de grade para grade.
- Use uma mão para estabilizar as pinças de fixação, desenrolar a fita cuidadosamente ao redor da pinça e braço de mergulho manual.
- Mantenha sempre contato com a pinça para evitar o movimento da grade da pinça e limitar os danos na grade que ocorrem de bater a grade contra o etano sólido.
- Uma vez que a pinça de fixação esteja livre do braço de mergulho manual, mantenha a pinça em uma mão descansando em cima da dewar mergulhando, certifique-se de que a grade permaneça no etano líquido. Deslize cuidadosamente o grampo plástico para longe da grade para que a grade possa ser transferida. Mantenha a pressão sobre as pinças para manter a grade.
- Com um movimento rápido, transfira rapidamente a rede da nave de etano para o reservatório LN2 . Coloque cuidadosamente a grade na caixa de armazenamento da grade.
NOTA: Alguns etanos podem se solidificar na superfície da rede. Abrir a pinça ligeiramente quebrará o etano e permitirá que a grade seja lançada na caixa da grade.
- Com um movimento rápido, transfira rapidamente a rede da nave de etano para o reservatório LN2 . Coloque cuidadosamente a grade na caixa de armazenamento da grade.
- Enrole a ponta da pinça em uma limpeza de tarefa delicada para evitar o acúmulo de geada. Reserve até que as pinças voltem à temperatura ambiente.
- Tenha de 4 a 6 pinças na mão para facilitar o uso. Cada pinça será usada para congelamento de amostras e aquecida antes do uso subsequente.
- Repetir as etapas 6.1-6.11 para cada grade.
- Uma vez que o congelamento culminou, feche com segurança a caixa da grade e transfira para um local de armazenamento adequado.
- Descarte cuidadosamente o etano líquido e o LN2 e armazene todos os materiais em local seco.
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Representative Results
A execução bem sucedida do protocolo de manchas e mergulho descrito aqui resultará em uma fina camada uniforme de gelo vítreo que está livre de qualquer gelo hexagonal, contaminantes e grandes gradientes de gelo inutilizável que podem ser observados sob o microscópio eletrônico (Figura 3). O contato inconsistente do papel de mancha com a superfície da grade, removendo prematuramente o papel de mancha, ou movendo o papel de mancha durante o contato com a rede pode diminuir a qualidade do gelo vítreo e levar a espessura de gelo inconsistente através da grade EM (Figura 4)
Figura 1: Sala de mergulho de espécimes e equipamento necessário. A) Sala fria encenada para o congelamento manual de espécimes biológicos usando um dispositivo tradicional de mancha e mergulho descrito neste artigo. Os equipamentos necessários são mostrados e rotulados em conformidade. B) Para ajustar a altura de trabalho do êmbolo manual, ajuste a parada de colisão deslizando-a para cima e para baixo no braço de mergulho manual e prendendo-o apertando o parafuso. C) Visão ampliada do vaso de etano e da plataforma de armazenamento da grade giratória para indicar a altura e a localização adequadas das pinças e grade de fixação dentro do vaso de etano de latão vazio. A pinça e a grade não devem entrar em contato com as laterais ou a parte inferior do etano de latão para evitar danos. D) Altura e localização adequadas da pinça de fixação e grade em etano líquido. A pinça e a grade devem entrar no etano líquido no centro, evitando o contato com o etano sólido no perímetro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Etano líquido preparado. Visão ampliada da dewar mergulhando mostrando o estado de etano líquido no vaso de etano de latão antes do congelamento do espécime. O anel de 2-3 mm de etano sólido dentro do vaso de etano de latão é claramente visível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas de apoferritina obtidas utilizando a técnica manual de blot-and-plunge. (A) Atlas representativo de uma grade crioEM mostrando a espessura do gelo e a qualidade dos quadrados de grade que podem ser obtidos usando a técnica manual de blot-and-plunge. (B) Micrografia corrigida por movimento de apoferritina de camundongos vitrificada adquirida usando um microscópio eletrônico de transmissão de 200 kV equipado com um detector de elétrons direto na Universidade da Califórnia, Instalação CrioEM de San Diego. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Atlas representativo de uma grade crioEM sub-ideal mostrando espessura de gelo inconsistente em toda a grade, numerosos quadrados quebrados e áreas em que o gelo é muito grosso para imagem do espécime. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A vitrificação de espécimes biológicos para imagem por microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas (crioEM) continua sendo um passo criticamente importante para a determinação bem sucedida da estrutura. O método manual de blot-and-plunge descrito neste protocolo representa um método econômico, confiável e robusto para congelar rapidamente amostras biológicas em filmes finos de gelo vítreo para imagens crioEM. Usando os métodos descritos no manuscrito, os pesquisadores poderão montar e operar o êmbolo manual, preparar criógen adequado para amostras biológicas de congelamento de flash e grades EM de bolhas e mergulhos manualmente contendo espécimes biológicos. Embora este método seja bastante robusto, deve-se tomar cuidado durante as etapas críticas deste procedimento para obter a espessura e qualidade ideal do gelo para imagens de alta resolução. Delineamos várias dessas etapas críticas abaixo e fornecemos recomendações sobre como solucionar essas etapas.
É imprescindível posicionar adequadamente o braço de mergulho manual para garantir que a grade se localize no centro do etano líquido dentro do navio de latão após a queda. A altura ou a posição inadequadas do braço mergulhando e/ou não fixar corretamente as pinças levarão a danos à pinça de fixação, à grade EM e, possivelmente, ao êmbolo manual. Como discutido acima, sempre realizamos pelo menos um teste antes de preparar espécimes biológicos para verificar se a grade EM se localizará no centro do navio de etano de latão após o mergulho bem sucedido (Figura 1C). Além disso, também fazemos pequenos ajustes na localização da dewar mergulhando após cada congelamento da grade para ajustar a colocação da grade dentro do navio de etano (Figura 1D).
A preparação adequada do criogen de etano é fundamental para a obtenção de filmes finos de espécimes biológicos em gelo vítreo. Observamos que a presença de um anel de 2-3 mm de etano sólido ao redor da borda interna do vaso de etano de latão garante que a temperatura do etano líquido seja ideal para vitrificação amostral (Figura 2). De fato, depois que cada rede foi congelada, monitoramos a qualidade do etano e fazemos pequenos ajustes - aquecendo ligeiramente o vaso se muito etano tiver solidificado ou resfriado o etano se o sistema se aqueceu - conforme necessário. Descobrimos que a borda de uma pinça de temperatura ambiente é suficiente para liquefazer o etano sólido enquanto cobre a de guerra com a tampa de espuma por 1-5 min é tempo suficiente para permitir que o etano esfrie. É importante ressaltar que fazemos esses ajustes antes de preparar a superfície da rede (ou seja, limpeza de plasma) e aplicar a amostra na rede, pois isso pode introduzir outra variável à preparação da grade que não é reprodutível.
Finalmente, recomendamos desenvolver uma rotina padronizada de blot-and-plunge - aplicação de amostra, mancha de amostra e tempo de mancha - para aumentar a reprodutibilidade grade-a-grade. Dobrar o papel de mancha em direção à grade EM permite o contato uniforme do papel com a grade e produz espessura de gelo mais consistente em toda a rede, resultando em distribuição de partículas mesmo dentro dos orifícios da grade (Figura 3A e Figura B, respectivamente). Este método de mancha é em contraste com dispositivos de manchas robóticos que interagem com o espécime em um ângulo que pode resultar em um gradiente de espessura de gelo através da grade. Além disso, essa dobra do papel de mancha também diminui a chance de danificar a grade EM após o contato com o papel de mancha, tamponando a força que está sendo aplicada pelo usuário. Após o tempo de manchas desejado, endireitar rapidamente o papel de mancha, realizando um movimento de estalo para mover rapidamente o papel de mancha para longe da superfície da grade antes de mergulhar para evitar danos à grade após a liberação do braço de mergulho manual. Encontramos este método de mancha e o movimento de estalo do papel de mancha, quando cronometrado com a liberação simultânea do braço de mergulho manual através do pedal do pé, limita a evaporação da película fina antes da vitrificação e aumenta a reprodutibilidade de grade para grade.
O método manual de blot-and-plunge descrito aqui é um método robusto e confiável que ajuda a diminuir parte da carga financeira que o CryoEM pode colocar em laboratórios emergentes. Embora este método seja reprodutível, criar gelo vítreo de alta qualidade adequado para crioEM conta com a experiência e habilidade do pesquisador individual. Embora os despensos robóticos e outras tecnologias emergentes automatizem vários aspectos do processo de congelamento, eles geralmente são limitados pelo quanto de controle oferecem aos pesquisadores e muitas vezes incorrem em um alto preço para comprar e operar. Com o método descrito neste protocolo, os pesquisadores poderão utilizar uma plataforma de preparação de grade EM acessível e versátil que ofereça flexibilidade para otimizar as condições de mergulho (ou seja, tipos de papel de mancha, ângulo de mancha, durações de manchas, direções de manchas, etc.) com base em tipos e características da amostra.
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Disclosures
Não temos nada para revelar.
Acknowledgments
Agradecemos aos membros do laboratório Herzik por pensarem criticamente e fornecerem feedback sobre este manuscrito e o conteúdo do vídeo. M.A.H.Jr. é apoiado pelo NIH R35 GM138206 e como um Estudioso searle. H.P.M.N é apoiado pelo Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). Também gostaríamos de agradecer a Bill Anderson, Charles Bowman e Dr. Gabriel Lander no Scripps Research Institute por ajudar a projetar, montar e testar o êmbolo manual mostrado no vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22x22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
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