Summary
Este manuscrito describe el método de blot-and-plunge para congelar manualmente especímenes biológicos para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula.
Abstract
La obtención de imágenes de especímenes biológicos con electrones para la determinación de la estructura de alta resolución mediante microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (cryoEM) requiere una capa delgada de hielo vítreo que contenga las biomoléculas de interés. A pesar de los numerosos avances tecnológicos en los últimos años que han impulsado el crioEM de una sola partícula a la vanguardia de la biología estructural, los métodos por los cuales los especímenes se vitrifican para imágenes de alta resolución a menudo siguen siendo el paso limitante de velocidad. Aunque numerosos esfuerzos recientes han proporcionado medios para superar los obstáculos que se encuentran con frecuencia durante la vitrificación de muestras, incluido el desarrollo de nuevos soportes de muestra e instrumentación de vitrificación innovadora, el émbolo tradicional operado manualmente sigue siendo un elemento básico en la comunidad crioEM debido al bajo costo de compra y la facilidad de operación. Aquí, proporcionamos métodos detallados para el uso de un dispositivo estándar de blot-and-plunge operado manualmente estilo guillotina para la vitrificación de especímenes biológicos para imágenes de alta resolución mediante crioEM de una sola partícula. Además, también se describen los problemas más comunes y las recomendaciones de solución de problemas para cuando una preparación estándar no produce una muestra adecuada.
Introduction
La microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (crioEM) es una poderosa técnica estructural que se puede utilizar para resolver estructuras de especímenes biológicos dinámicos a una resolución casi atómica1,2,3,4. De hecho, los recientes avances en las tecnologías de detectores directos de electrones4,5,6,7,8,9,10, las mejoras en las fuentes de electrones4,11,12,13,14 y la estabilidad de las lentes electromagnéticas15, junto con el desarrollo continuo de la adquisición de datos 16,17 y los paquetes de software de análisis18,19, han permitido a los investigadores determinar ahora rutinariamente estructuras de especímenes de buen comportamiento a una resolución de 3 Å o mejor4,11,13,14,20,21,22,23 . A pesar de estas capacidades mejoradas de procesamiento de imágenes y datos, la preparación de la red cryoEM sigue siendo el mayor impedimento para la determinación exitosa de la estructura de alta resolución y, a menudo, sirve como un cuello de botella considerable en el flujo de trabajo de EM24,25,26,27.
CryoEM se basa en la obtención de imágenes de muestras biológicas en soluciones acuosas que se congelan para formar una película delgada de hielo "similar al vidrio", un proceso conocido como vitrificación, que preserva el estado bioquímico nativo. La vitrificación de muestras biológicas para crioEM se remonta a más de 40 años28,29,30 y muchas técnicas y equipos que se han desarrollado para este proceso se basan en el método de blot-and-plunge originalmente detallado31,32,33,34,35 , mediante el cual se aplica un pequeño volumen de muestra (por ejemplo, 1-5 μL) a una rejilla EM especializada antes de eliminar el exceso de solución mediante la interacción física de la rejilla con papel secante. El momento de este proceso generalmente se determina empíricamente para cada espécimen, ya que un componente crítico de las muestras de congelación es el grosor de la película de hielo vítreo: si el hielo es demasiado grueso, la calidad de la imagen se deteriora dramáticamente debido al aumento de la dispersión del haz de electrones, mientras que el hielo que es demasiado delgado puede restringir las orientaciones de las proteínas y / o excluir partículas del centro de los orificios de la lámina de la rejilla36 . Esta dependencia del espesor de hielo perfecto para la crioEM de una sola partícula ha dado lugar a una amplia gama de técnicas y equipos que pueden congelar muestras, incluida la robótica37,38, la microfluídica42 y los dispositivos ultrasónicos o de pulverización27,39,40,41,42,43,44 . En los últimos años, algunos de los dispositivos de preparación de muestras más populares se basan en el uso de la robótica para la congelación automatizada de muestras utilizando la técnica de blot-and-plunge45. Si bien estos dispositivos están diseñados para crear de manera reproducible un espesor de hielo adecuado para las imágenes, a menudo siguen siendo demasiado caros para que los laboratorios individuales los compren y operen y generalmente se encuentran dentro de las instalaciones de crioEM a precios por hora para su uso. En los últimos años, la técnica manual original de blot-and-plunge ha vuelto a ser un uso cada vez mayor3,47,48,49,50,51,52. De hecho, un dispositivo de blot-and-plunge operado manualmente puede lograr rejillas crioEM de alta calidad a una fracción del costo de las contrapartes robóticas. Además, el blotting manual también ofrece a los usuarios más control sobre el blotting, ya que los investigadores pueden ajustar el tipo de blotting (es decir, el back-blotting de la cuadrícula, el front-blotting de la cuadrícula, etc.), y el tiempo de blotting en función de cada muestra individual y preguntas de investigación.
En este artículo, proporcionamos detalles sobre cómo congelar eficazmente muestras biológicas utilizando un dispositivo de vitrificación manual tradicional de borrado y inmersión junto con una plataforma dewar diseñada a medida53. Se proporcionan las mejores prácticas, incluida la preparación del criógeno, el manejo de la rejilla, la aplicación de muestras y el borrado, así como las trampas comunes y las recomendaciones sobre cómo superar estos obstáculos. Se discuten consejos sobre cómo aumentar la reproducibilidad del espesor del hielo entre las preparaciones de rejilla y cómo modificar el borrado de muestras en función del tipo de muestra biológica. Dado el bajo costo asociado con la compra y operación del émbolo manual descrito en este manuscrito, los laboratorios de todo el mundo pueden preparar especímenes biológicos para crioEM de una manera rentable y reproducible.
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Protocol
1. Prepare el entorno de inmersión manual
NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 5-30 minutos
- Ubique el émbolo manual en una cámara frigorífica de 4 °C donde se pueda ubicar un humidificador para mantener la habitación cerca del 100% de humedad relativa (HR) (Figura 1A).
PRECAUCIÓN: Consulte con las pautas de Salud y Seguridad Ambiental de la institución para la ubicación segura del émbolo manual y las operaciones recomendadas. - Antes de la preparación de la rejilla, encienda el humidificador en la cámara frigorífica para asegurarse de que la HR de la cámara frigorífica esté ≥ 95 %.
NOTA: La preparación de la rejilla a baja humedad puede resultar en la deshidratación de las películas delgadas, la alteración de los componentes tampón debido a la evaporación y una disminución en la reproducibilidad de la rejilla a la rejilla46. No se recomienda congelar las rejillas a <80 % HR. - Asegúrese de que la temperatura de la cámara frigorífica esté a 4 °C.
- Ubique el émbolo manual lejos de las fuertes corrientes de aire (es decir, lejos de las rejillas de ventilación de la unidad de aire acondicionado), ya que pueden provocar turbulencias cerca de las rejillas y / o acumulación de hielo prominente en superficies frías.
2. Prepare materiales y accesorios de inmersión
NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 1-5 minutos
- Use tijeras limpias para cortar círculos de papel secante en tiras de 1-1.5 cm de ancho y ~ 9 cm de largo. Evite tocar el centro del papel secante y deseche las piezas finales más pequeñas. Es importante asegurarse de que las tiras de papel secante estén secas, limpias y libres de contaminantes. Separe las tiras y colóquelas en una placa de Petri de 100 mm.
- Coloque una funda de vidrio cuadrada de 22x22 mm en una placa de Petri de vidrio de 60 mm separada. Esta placa de Petri de vidrio que contiene un capa se utilizará para almacenar, transferir y descargar rejillas de descarga de resplandor.
NOTA: Se recomienda usar una lata de aire para eliminar cualquier residuo visible de la diapositiva antes de agregar rejillas. Una pistola antiestática también se puede utilizar para eliminar cualquier electricidad estática que se acumule. - Montar y etiquetar cajas de almacenamiento en rejilla.
- Adquiera de 4 a 6 pinzas de sujeción limpias y secas y ubíquelas en el émbolo manual. Inspeccione visualmente cada pinza antes de sumergirse para asegurarse de que no estén dañadas y libres de contaminantes.
3. Prepara el dewar criógeno y el émbolo manual
NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 5-15 minutos
- Instale la base de la plataforma en la parte inferior del dewar de hundimiento. Coloque el recipiente de etano dewar en la parte superior de la base de la plataforma, agregue el recipiente de etano de latón y luego instale la plataforma de almacenamiento de rejilla giratoria.
- Una vez que se agrega nitrógeno líquido (LN2) al dewar de inmersión, la altura de la base de la plataforma ya no se puede ajustar. Asegúrese de que la base de la rejilla esté instalada correctamente y esté nivelada para limitar el daño de la rejilla y / o pinza debido a una altura de émbolo inadecuada.
- Antes de la congelación, verifique el émbolo manual y todos los equipos auxiliares para asegurarse de que funcionan correctamente para limitar la pérdida de muestras y / o rejillas.
- Antes de cada sesión de congelación, reemplace la cinta adhesiva del brazo del émbolo manual utilizado para sujetar las pinzas. La alta humedad de la habitación puede deteriorar el adhesivo de la cinta y disminuir la capacidad de la cinta para sostener las pinzas, lo que aumenta la probabilidad de daños en las pinzas y / o pérdida de la rejilla.
- Ajuste la(s) lámpara(s) cerca del émbolo manual para asegurarse de que haya suficiente luz para monitorear la absorción de muestras y asegurarse de que la transferencia de la red se visualice fácilmente para evitar daños y/o pérdidas de la red (consulte el paso 3.7). Use una lámpara de anillo directamente detrás del émbolo para visualizar el movimiento del líquido y una luz de tarea de brazo flexible cerca del dewar para iluminar las rejillas congeladas.
- Ajuste la tensión del pedal para asegurarse de que el brazo de inmersión de dewar se mantenga firmemente en su lugar mientras está en la posición elevada y se suelte completamente cuando se presiona el pedal. Realice varias ejecuciones "secas" antes de la aplicación de la muestra para asegurarse de que el émbolo funcione correctamente.
NOTA: El ajuste inadecuado de la tensión del pedal dará lugar a la liberación prematura del brazo de inmersión (es decir, la tensión se establece demasiado baja) y la pérdida de la rejilla o el hundimiento incompleto de la rejilla en el recipiente de etano (es decir, la tensión se establece demasiado alta). - Coloque el dewar de inmersión en la base del émbolo manual directamente debajo del brazo de inmersión y asegúrelo en su lugar. Conecte un par de pinzas al brazo de inmersión con la cinta adhesiva. Mientras sostiene el brazo de inmersión manual, presione el pedal para bajar cuidadosamente el brazo de inmersión y ajuste el recorrido del brazo de inmersión para asegurarse de que la rejilla se ubique dentro del medio del recipiente de etano.
- Utilice el tope de choque en la parte superior del brazo de inmersión para determinar la posición final del brazo de inmersión cuando el pedal está completamente presionado (Figura 1B). Ajuste la altura del tope de choque en el brazo de inmersión para ajustar la ubicación de la rejilla en el recipiente de etano (Figura 1C).
NOTA: El ajuste incorrecto de la altura del brazo de inmersión puede provocar daños en la rejilla y / o pinzas (por ejemplo, la altura del brazo de inmersión se establece demasiado baja) o una vitrificación inadecuada (por ejemplo, la altura del brazo de inmersión se establece demasiado alta). - Localice el dewar fuera de la cámara frigorífica y proceda a preparar etano líquido (paso 4).
4. Preparar el criógeno
NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 10-30 minutos
- Evalúe el tanque de etano, el regulador, el tubo y la punta de dispensación de etano para detectar cualquier signo de daño. Informe y rectifique inmediatamente cualquier signo de daño antes de continuar.
PRECAUCIÓN: Las mezclas de gas etano comprimidos y etano son inflamables y pueden representar una seria amenaza para la vida y / o provocar lesiones si se manejan incorrectamente. Consulte a un experto si no está seguro de cómo operar o manejar los tanques de gas comprimido. Consulte las pautas de salud y seguridad ambiental de la institución al manipular gases comprimidos inflamables. Además, el etano licuado es un poderoso criógeno que puede representar una grave amenaza para la vida y / o lesiones si no se maneja adecuadamente. Consulte las pautas de salud y seguridad ambiental de la institución al manejar criógenos. - Adquirir suficiente LN2 en un dewar de manejo LN2 apropiado (es decir, 3-4 L es típico para la preparación y almacenamiento de la red).
PRECAUCIÓN: LN2 es un criógeno que puede representar una seria amenaza para la vida y / o lesiones si no se maneja adecuadamente.- Asegúrese de que todo el equipo de protección personal se utilice para minimizar el riesgo de lesiones. El vapor de LN2 es un asfixiante y debe manejarse en áreas bien ventiladas. Consulte a un experto si no está seguro de cómo operar o manejar vasos criogénicos y criógenos. Consulte las pautas de salud y seguridad ambiental de la institución al manejar criógenos. Para situaciones en las que el nitrógeno líquido no se puede utilizar en una cámara frigorífica, recomendamos sumergir la congelación en un espacio fresco y bien ventilado.
- Fuera de la cámara frigorífica, enfríe el dewar sumergido vertiendo LN2 directamente en el recipiente de etano de latón hasta que el nivel de nitrógeno líquido alcance la parte superior del recipiente de etano (es decir, justo encima de la plataforma). Cubra el LN2 fuera del recipiente de etano según sea necesario. Continúe con el siguiente paso cuando el LN2 deje de burbujear violentamente (aproximadamente 5 minutos).
- Agregue LN2 directamente al recipiente de etano de latón para enfriar suficientemente el recipiente antes de condensar el gas etano. Si no se enfría adecuadamente el recipiente de etano de latón, aumentará drásticamente el tiempo que se tarda en condensar el etano.
- Una vez que el dewar haya alcanzado la temperatura LN2 , evite llenar en exceso el dewar de tal manera que LN2 se derrame en el recipiente de etano.
- El etano viene como un gas comprimido y necesita ser licuado para su uso. El tanque de etano utiliza un regulador de doble etapa de alta pureza para controlar el flujo de gas. Conecte el tubo a la válvula de salida del regulador y utilice una punta dispensadora de metal plana de calibre 14 conectada en el extremo para dispensar etano.
- Antes de abrir la válvula del tanque principal de etano, asegúrese de que la perilla de ajuste de presión y la válvula de salida estén cerradas por completo. Abra completamente la válvula del tanque principal y luego abra la válvula de salida a ~ 50%. Abra lentamente la perilla de ajuste de presión hasta que se observe un flujo de gas lento. Utilice la válvula de salida para ajustar el flujo de gas.
PRECAUCIÓN: Siempre apunte la punta dispensadora de metal lejos de sí misma al abrir válvulas o hacer ajustes de flujo de gas. - Comience lentamente el flujo de gas y evalúe el caudal insertando la punta de la línea de gas etano en un pequeño vaso de agua desionizada. Ajuste el flujo de gas hasta que el caudal perturbe moderadamente el agua.
- Ajuste el caudal de gas para garantizar que se produzca una condensación adecuada del etano: un caudal demasiado lento hará que el gas etano se solidifique en la punta de dispensación y un caudal demasiado rápido dará lugar a un burbujeo intenso y evitará la congelación.
- Antes de insertar la punta de la línea de gas etano en el recipiente de etano de latón, limpie y limpie la punta dispensadora con delicadas toallitas de tarea para eliminar el agua.
- En un movimiento suave y rápido, ubique la punta dispensadora de gas en la parte inferior del recipiente de etano de latón y comience a mover la punta dispensadora en un círculo lento alrededor del fondo del recipiente de etano. El etano sólido se formará inmediatamente, pero se licuará rápidamente a medida que se agregue / condense más gas etano.
- Continúe moviendo la punta dispensadora de etano metálico en la parte inferior del recipiente de etano para licuar el etano sólido. Llene el recipiente de etano a 3/4 lleno de etano líquido (2-3 hilos desde la parte superior). Detenga el flujo de gas etano retirando cuidadosamente la punta dispensadora de etano metálico del recipiente de etano de latón y cerrando la válvula de salida.
- Remata el dewar de inmersión con LN2 vertiendo suavemente en el lado del dewar para evitar la adición de LN2 al recipiente de etano de latón, hasta que el nivel de líquido toque el recipiente de etano de latón. Coloque la tapa de espuma en el dewar de inmersión para facilitar la solidificación del etano.
- LN2 debe entrar en contacto directamente con el recipiente de etano de latón para ayudar en la solidificación del etano. Después de aproximadamente 5 minutos, el etano dentro del recipiente de latón se congelará completamente sólido. Agregue más LN2 hasta que toque el recipiente de etano y continúe con el siguiente paso.
- Si el etano no se ha congelado sólido, entonces el recipiente de etano de latón no está lo suficientemente frío para los pasos restantes. Agregue más LN2 hasta que toque el recipiente de etano y espere 5 minutos adicionales. Asegúrese de que el etano dentro del recipiente de latón esté completamente congelado y sólido.
- Abra la válvula de salida de gas para producir un flujo de gas etano a una velocidad similar a la determinada en el paso 4.6. Coloque verticalmente la punta dispensadora de etano metálico en el etano sólido y continúe moviendo la punta dispensadora de etano en un movimiento circular para fundir el etano sólido.
- Continúe agregando etano hasta que esté nivelado con la parte superior del recipiente de etano de latón. Retire lentamente la punta del recipiente de etano y cierre la válvula de salida del tanque de etano. Cubra el dewar con la tapa durante ~ 1-4 minutos (s) para dejar que el etano se solidifique alrededor de los bordes del recipiente de etano de latón.
NOTA: Un recipiente de etano ideal tendrá un anillo simétrico de 2-3 mm de etano sólido en el perímetro del recipiente de etano de latón con etano líquido en el centro (Figura 1D y Figura 2). - Asegúrese de que el etano esté lo más frío posible sin solidificarse para garantizar la vitrificación adecuada del espécimen biológico. La falta de preparación adecuada del etano líquido puede resultar en una vitrificación inadecuada de la muestra, acumulación de hielo y / o pérdida de la muestra, cada una de las cuales contribuye al deterioro de la calidad de la muestra para la obtención de imágenes.
- Si un anillo sólido de etano no se forma después de 2-3 minutos, agregue más LN2 al dewar y cubra durante 2-5 minutos más.
- Si el etano se está solidificando demasiado rápido, use un par grande de pinzas limpias para calentar suavemente el recipiente de etano y / o etano sólido para evitar la solidificación completa del etano. Una vez que el etano y el LN2 estén estables, cierre todas las válvulas del tanque de etano y ubique el dewar de inmersión en el émbolo manual. Asegure el dewar de inmersión al émbolo manual.
PRECAUCIÓN: Tenga mucho cuidado al transferir el dewar, ya que LN2 puede derramarse en el recipiente de etano y solidificar el etano líquido. Si es necesario, se puede usar un juego limpio de pinzas para derretir cualquier etano sólido en el medio del recipiente.
- Continúe agregando etano hasta que esté nivelado con la parte superior del recipiente de etano de latón. Retire lentamente la punta del recipiente de etano y cierre la válvula de salida del tanque de etano. Cubra el dewar con la tapa durante ~ 1-4 minutos (s) para dejar que el etano se solidifique alrededor de los bordes del recipiente de etano de latón.
- Pruebe la ubicación del dewar de etano con un par de pinzas vacías para asegurarse de que la punta de la pinza se ubique en el centro del recipiente de etano y que haya suficiente espacio para la rejilla y la punta de la pinza dentro del etano líquido (Figura 1D).
- Si el anillo de etano sólido es demasiado grueso para facilitar el manejo de la rejilla, use un par de pinzas limpias a temperatura ambiente para derretir el etano sólido y crear más área de congelación en el centro del recipiente de etano.
5. Prepara las rejillas EM
NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 1-5 minutos
- Agregue la(s) caja(s) de almacenamiento de rejilla al dewar, desenrosque la(s) tapa(s) de la(s) de la caja de almacenamiento de rejilla y asegúrese de que cada tapa pueda girar libremente a una nueva ranura de rejilla.
- Transfiera cuidadosamente las rejillas de la caja de almacenamiento de la rejilla al borde de la cubierta de vidrio cuadrada con ~ 30-40% de la rejilla fuera del borde de la diapositiva. Asegúrese de que la lámina de la rejilla esté hacia arriba. Asegúrese de que las rejillas estén cubiertas cuando no estén en uso. Colocar las rejillas sobre el borde de la cubierta de vidrio cuadrada proporciona facilidad de manejo de la rejilla y disminuye la posibilidad de doblar o dañar la rejilla durante la transferencia.
NOTA: Normalmente se preparan de 4 a 6 rejillas a la vez. - Renderice las rejillas hidrofílicas utilizando un descargador de resplandor o un limpiador de plasma.
NOTA: Consulte las pautas recomendadas para la limpieza de la rejilla proporcionadas por el fabricante del descargador de resplandor / limpiador de plasma.- Use las rejillas dentro de los 10 minutos posteriores a la limpieza con plasma, ya que las rejillas pierden hidrofilicidad y la reproducibilidad de rejilla a rejilla disminuye después de este tiempo.
6. Prepare la muestra de crioEM por congelación por inmersión
NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: >10 minutos (~ 1-3 minutos por cuadrícula)
- Use una pinza de sujeción limpia y seca para recoger una rejilla limpia, deslice la abrazadera de plástico hacia abajo para fijar la rejilla en su lugar y toque suavemente las pinzas para asegurarse de que la rejilla esté correctamente asegurada.
- Manipule las rejillas por el anillo exterior para evitar daños en la lámina de la rejilla.
- Aplique de 1 a 5 μL de muestra en el lado preparado (por ejemplo, el lado frontal o de la lámina) de la rejilla.
NOTA: El volumen óptimo y el tiempo de borrado dependen de la muestra y deben optimizarse para cada muestra; los volúmenes más grandes y las muestras más viscosas requieren tiempos de borrado más largos. - Asegure el conjunto de pinza-rejilla-muestra al brazo de inmersión manual envolviendo la cinta alrededor del mango de la pinza.
- Enfréntate a la muestra hacia el usuario para el borrado frontal tradicional. Si la muestra requiere blotting posterior, busque la muestra lejos del usuario.
- Sostenga un pedazo de papel secante limpio, seco y cortado entre el pulgar y el dedo índice de cada mano.
- Solo maneje los papeles secantes de los bordes y nunca toque el centro, ya que los aceites y otros contaminantes de las manos / guantes pueden alterar la calidad de la rejilla.
- Apoye las manos en el borde del dewar que se hunde para establecer una posición estable. Ubique el papel secante paralelo a la superficie de la rejilla a aproximadamente 1 cm de distancia de la superficie de la rejilla.
- Use la sección central del papel secante para permitir una movilidad completa del fluido e incluso la absorción a través de la superficie de la rejilla.
- Deslice y gire suavemente el pulgar y los dedos anular uno hacia el otro para doblar el papel secante hacia la rejilla para iniciar el borrado. Mantenga el contacto entre el papel secante y la superficie de la rejilla durante todo el proceso de borrado.
- Contacte directamente el papel secante con la superficie de la rejilla y mantenga un contacto constante a través de la superficie de la rejilla.
- Doblar suavemente el papel secante disminuye la flexión de la rejilla y / o el daño a la superficie de la rejilla, y da como resultado un hielo más consistente en toda la rejilla (Figura 3A).
- Observe el frente de líquido móvil y una vez que deje de progresar hacia el papel secante comience a contar durante 4 a 6 segundos.
NOTA: El conteo puede ocurrir una vez que el papel secante entra en contacto con la superficie de la cuadrícula, pero puede ocurrir una menor reproducibilidad de cuadrícula a cuadrícula. El tiempo total de borrado dependerá del tipo de rejilla, el tipo de lámina, la concentración de muestra y el tipo de muestra (por ejemplo, proteínas solubles versus membrana versus filamentosas). Para muestras más viscosas se requerirán tiempos de borrado más largos (por ejemplo, de 5 a 7 segundos).- Importante: Desarrollar un esquema de conteo confiable y consistente para mejorar en gran medida la reproducibilidad durante el proceso de congelación.
- Mueva los dedos izquierdo, derecho, pulgar e índice en direcciones opuestas para quitar el papel secante en un "movimiento de chasquido" lejos de la superficie de la cuadrícula. Presione inmediatamente el pedal para liberar el brazo que se hunde y sumerja la rejilla en etano líquido.
- Retire simultáneamente el papel secante y presione el pedal para sumergir la rejilla en el etano lo antes posible para obtener los mejores resultados de congelación. Cuanto mayor sea el tiempo entre la eliminación del papel secante y la inmersión, más evaporación se producirá de las películas delgadas y disminuirá la reproducibilidad de rejilla a rejilla.
- Use una mano para estabilizar las pinzas de sujeción, desenrolle la cinta con cuidado de alrededor de las pinzas y el brazo de inmersión manual.
- Mantenga siempre el contacto con la pinza para evitar el movimiento de la rejilla de la pinza y limitar el daño de la rejilla que se produce al golpear la rejilla contra el etano sólido.
- Una vez que las pinzas de sujeción estén libres del brazo de inmersión manual, mantenga la pinza en una mano apoyada en la parte superior del dewar de inmersión, asegúrese de que la rejilla permanezca en el etano líquido. Deslice con cuidado la abrazadera de plástico lejos de la rejilla para que la rejilla pueda transferirse. Mantenga la presión sobre las pinzas para retener la rejilla.
- Con un movimiento rápido, transfiera rápidamente la rejilla desde el recipiente de etano al depósito de LN2 . Coloque con cuidado la rejilla en la caja de almacenamiento de la red.
NOTA: Algunos etanos pueden solidificarse en la superficie de la rejilla. Abrir ligeramente la pinza romperá el etano y permitirá que la rejilla se deje caer en la caja de la rejilla.
- Con un movimiento rápido, transfiera rápidamente la rejilla desde el recipiente de etano al depósito de LN2 . Coloque con cuidado la rejilla en la caja de almacenamiento de la red.
- Envuelva la punta de las pinzas en una delicada toallita de tareas para evitar la acumulación de escarcha. Reservar hasta que las pinzas hayan vuelto a temperatura ambiente.
- Tenga de 4 a 6 pinzas a mano para facilitar su uso. Cada pinza se utilizará para la congelación de muestras y se calentará antes de su uso posterior.
- Repita los pasos 6.1 a 6.11 para cada cuadrícula.
- Una vez que la congelación haya culminado, cierre de forma segura la caja de rejilla y transfiérala a una ubicación de almacenamiento adecuada.
- Deseche cuidadosamente el etano líquido y el LN2 y almacene todos los materiales en un lugar seco.
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Representative Results
La ejecución exitosa del protocolo de blot-and-plunge descrito aquí dará como resultado una capa delgada y uniforme de hielo vítreo que está libre de cualquier hielo hexagonal, contaminantes y grandes gradientes de hielo inutilizable que se pueden observar bajo el microscopio electrónico (Figura 3). El contacto inconsistente del papel secante con la superficie de la rejilla, la eliminación prematura del papel secante o el movimiento del papel secante durante el contacto con la rejilla pueden disminuir la calidad del hielo vítreo y conducir a un espesor de hielo inconsistente a través de la rejilla EM (Figura 4)
Figura 1: Sala de inmersión de muestras y equipo requerido. A) Cámara frigorífica escalonada para la congelación manual de especímenes biológicos utilizando un dispositivo tradicional de blot-and-plunge descrito en este artículo. El equipo necesario se muestra y etiqueta en consecuencia. B) Para ajustar la altura de trabajo del émbolo manual, ajuste el tope de golpe deslizándolo hacia arriba y hacia abajo del brazo de inmersión manual y asegurándolo apretando el tornillo. C) Vista ampliada del recipiente de etano y la plataforma de almacenamiento de la rejilla giratoria para indicar la altura y la ubicación adecuadas de las pinzas de sujeción y la rejilla dentro del recipiente de etano de latón vacío. Las pinzas y la rejilla no deben entrar en contacto con los lados o la parte inferior del etano de latón para evitar daños. D) Altura y ubicación adecuadas de las pinzas de sujeción y rejilla en etano líquido. Las pinzas y la rejilla deben introducir el etano líquido en el centro, evitando el contacto con el etano sólido en el perímetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Etano líquido preparado. Vista ampliada del dewar en picado que muestra el estado del etano líquido en el recipiente de etano de latón antes de la congelación de la muestra. El anillo de 2-3 mm de etano sólido dentro del recipiente de etano de latón es claramente visible. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas de apoferritina obtenidas mediante la técnica manual de blot-and-plunge. (A) Atlas representativo de una rejilla crioEM que muestra el espesor del hielo y la calidad de los cuadrados de la rejilla que se pueden obtener utilizando la técnica manual de blot-and-plunge. (B) Micrografía corregida por movimiento de apoferritina vitrificada de ratón adquirida utilizando un microscopio electrónico de transmisión de 200 kV equipado con un detector de electrones directo en las instalaciones CryoEM de la Universidad de California en San Diego. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Atlas representativo de una cuadrícula crioEM subóptima que muestra espesores de hielo inconsistentes a través de la cuadrícula, numerosos cuadrados rotos y áreas en las que el hielo es demasiado grueso para obtener imágenes de la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La vitrificación de especímenes biológicos para la obtención de imágenes mediante microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (cryoEM) sigue siendo un paso de importancia crítica para la determinación exitosa de la estructura. El método manual de borrado y inmersión descrito en este protocolo representa un método rentable, confiable y robusto para congelar rápidamente muestras biológicas en películas delgadas de hielo vítreo para imágenes crioEM. Utilizando los métodos descritos en el manuscrito, los investigadores podrán ensamblar y operar el émbolo manual, preparar criógenos adecuados para muestras biológicas de congelación instantánea y secar manualmente las rejillas EM que contienen especímenes biológicos. Si bien este método es bastante robusto, se debe tener cuidado durante los pasos críticos de este procedimiento para obtener un espesor y una calidad de hielo óptimos para imágenes de alta resolución. Hemos descrito varios de estos pasos críticos a continuación y proporcionamos recomendaciones sobre cómo solucionar estos pasos.
Es imperativo colocar correctamente el brazo de inmersión manual para garantizar que la rejilla se ubique en el centro del etano líquido dentro del recipiente de latón después del hundimiento. La altura o posición incorrecta del brazo de hundimiento y / o no asegurar las pinzas correctamente provocará daños en las pinzas de sujeción, la rejilla EM y, posiblemente, el émbolo manual. Como se discutió anteriormente, siempre realizamos al menos una prueba antes de preparar especímenes biológicos para verificar que la rejilla EM se ubicará en el centro del recipiente de etano de latón después de un hundimiento exitoso (Figura 1C). Además, también hacemos pequeños ajustes en la ubicación del dewar de inmersión después de cada congelación de la rejilla para ajustar la ubicación de la rejilla dentro del recipiente de etano (Figura 1D).
La preparación adecuada del criógeno de etano es fundamental para obtener películas delgadas de especímenes biológicos en hielo vítreo. Hemos observado que la presencia de un anillo de 2-3 mm de etano sólido alrededor del borde interno del recipiente de etano de latón asegura que la temperatura del etano líquido sea óptima para la vitrificación de la muestra (Figura 2). De hecho, después de que cada rejilla se ha congelado, monitoreamos la calidad del etano y hacemos ajustes menores: calentando ligeramente el recipiente si se ha solidificado demasiado etano o enfriando el etano si el sistema se ha calentado, según sea necesario. Hemos encontrado que el borde de una pinza a temperatura ambiente es suficiente para licuar el etano sólido, mientras que cubrir el dewar con la tapa de espuma durante 1-5 minutos es tiempo suficiente para permitir que el etano se enfríe. Es importante destacar que hacemos estos ajustes antes de preparar la superficie de la rejilla (es decir, la limpieza por plasma) y aplicar la muestra a la rejilla, ya que esto puede introducir otra variable a la preparación de la rejilla que no es reproducible.
Finalmente, recomendamos desarrollar una rutina estandarizada de blot-and-plunge (aplicación de muestra, blotting de muestra y tiempo de blotting) para aumentar la reproducibilidad de cuadrícula a cuadrícula. Doblar el papel secante hacia la rejilla EM permite un contacto uniforme del papel con la rejilla y produce un espesor de hielo más consistente en toda la rejilla, lo que resulta en una distribución uniforme de partículas dentro de los orificios de la rejilla (Figura 3A y Figura B, respectivamente). Este método de blotting contrasta con los dispositivos robóticos de blotting que interactúan con la muestra en un ángulo que puede resultar en un gradiente de espesor de hielo a través de la rejilla. Además, esta flexión del papel secante también disminuye la posibilidad de dañar la rejilla EM al entrar en contacto con el papel secante al amortiguar la fuerza aplicada por el usuario. Después del tiempo de borrado deseado, enderece rápidamente el papel secante realizando un movimiento de chasquido para mover rápidamente el papel secante lejos de la superficie de la rejilla antes de sumergirse para evitar daños en la rejilla al soltar el brazo de inmersión manual. Hemos encontrado que este método de borrado y el movimiento de chasquido del papel secante, cuando se sincroniza con la liberación simultánea del brazo de inmersión manual a través del pedal, limita la evaporación de la película delgada antes de la vitrificación y aumenta la reproducibilidad de rejilla a rejilla.
El método manual de blot-and-plunge descrito aquí es un método robusto y confiable que ayuda a disminuir parte de la carga financiera que el cryoEM puede imponer a los laboratorios emergentes. Si bien este método es reproducible, la creación de hielo vítreo de alta calidad que sea adecuado para la crioEM se basa en la experiencia y la habilidad del investigador individual. Aunque los émbolos robóticos y otras tecnologías emergentes automatizan varios aspectos del proceso de congelación, generalmente están limitados por la cantidad de control que ofrecen a los investigadores y, a menudo, incurren en un alto precio para comprar y operar. Con el método descrito en este protocolo, los investigadores podrán utilizar una plataforma de preparación de rejilla EM asequible y versátil que ofrece flexibilidad para optimizar las condiciones de inmersión (es decir, tipos de papel de borrado, ángulo de borrado, duraciones de borrado, direcciones de borrado, etc.) en función de los tipos y características de la muestra.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del laboratorio Herzik por pensar críticamente y proporcionar comentarios sobre este manuscrito y el contenido del video. M.A.H.Jr. cuenta con el apoyo de NIH R35 GM138206 y como Searle Scholar. H.P.M.N cuenta con el apoyo de la Beca de Capacitación en Biofísica Molecular (NIH T32 GM008326). También nos gustaría agradecer a Bill Anderson, Charles Bowman y al Dr. Gabriel Lander en el Instituto de Investigación Scripps por su ayuda para diseñar, ensamblar y probar el émbolo manual que se muestra en el video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22x22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
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