Aquí, presentamos un protocolo para etiquetar las vesículas extracelulares derivadas del lisado plaquetario para monitorear su migración y absorción en los explantes de cartílago utilizados como modelo para la osteoartritis.
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Artículo de método
Etiquetado de vesículas extracelulares para monitorear la migración y absorción en explantes de cartílago
En este artículo
Resumen
Resumen
Las vesículas extracelulares (EV) se utilizan en diferentes estudios para demostrar su potencial como tratamiento libre de células debido a su carga derivada de su fuente celular, como el lisado plaquetario (PL). Cuando se usan como tratamiento, se espera que los EV ingresen a las células diana y efectúen una respuesta a partir de estas. En esta investigación, los EV derivados de PL se han estudiado como un tratamiento libre de células para la osteoartritis (OA). Por lo tanto, se estableció un método para etiquetar los EV y probar su absorción en los explantes de cartílago. Los EV derivados de PL se etiquetan con el tinte lipofílico PKH26, se lavan dos veces a través de una columna y luego se prueban en un modelo de OA impulsado por inflamación in vitro durante 5 h después de la cuantificación de partículas mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Cada hora, los explantes de cartílago se fijan, se parafinan, se cortan en secciones de 6 μm para montar en portaobjetos y se observan bajo un microscopio confocal. Esto permite verificar si los EV ingresan a las células diana (condrocitos) durante este período y analizar su efecto directo.
Introducción
La artrosis (OA) es una enfermedad articular degenerativa que implica una inflamación y destrucción progresiva e irreversible de la matriz extracelular del cartílago articular1. Aunque varias formas de artritis tienen numerosos tratamientos2,3,4,estos están restringidos por sus efectos secundarios y eficacia limitada. Las técnicas de ingeniería tisular que utilizan la implantación autóloga de condrocitos se aplican rutinariamente para el tratamiento regenerativo del cartílago lesionado en lesiones tempranas de cartílago OA4. Las....
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Protocolo
NOTA: Los explantes de cartílago se obtuvieron del Biobanco IdISBa (IB 1995/12 BIO) de conformidad con las directrices institucionales tras la aprobación ética del proyecto por parte del CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Preparación de la columna
- Equilibre las columnas siguiendo las instrucciones del fabricante o de la siguiente manera:
- Retire la tapa de la columna y equilibre la columna. Elimine el búfer de almacenamiento por elución.
- Lave la columna 3 veces con 2,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Durante cada lavado, espere a que la columna absorba todo el volumen.
NOTA: No deje secar la columna....
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Resultados
En la Figura 1se muestra una descripción general esquemática para el etiquetado de vehículos eléctricos y el monitoreo de la absorción. La concentración de partículas y el tamaño de EV detectados por NTA en la Tabla 1 muestran que la concentración de EV disminuye durante el proceso debido al paso de purificación realizado dos veces después del etiquetado con la columna. Sin embargo, la cantidad obtenida está en el rango óptimo del número de partículas a utilizar para el trat.......
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Discusión
Las imágenes EV ayudan a comprender las propiedades ev, como sus mecanismos de liberación y absorción. Su imagen permite el seguimiento de su biodistribución y la caracterización de sus propiedades farmacocinéticas como vehículos farmacológicos. Sin embargo, las imágenes y el seguimiento de EV pueden ser difíciles debido a sus pequeños tamaños, aunque se han desarrollado muchos dispositivos de imágenes y técnicas de etiquetado para ayudar a los investigadores a monitorear los EV en condiciones in vitro e in .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación ha sido financiada por el Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinanciada por el Fondo Social Europeo del FSE y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional FEDER (MS16/00124; CP16/00124); por el PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financiado por el impuesto de turismo sostenible de las Islas Baleares; por la Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); por el programa postdoctoral FOLIUM (FOLIUM 17/01) dentro de la FUTURMed, financiado al 50% por el impuesto de turismo sostenible de las Islas Baleares y al 50% por ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| 1,5 mL Tubo de centrífuga | SPL ciencias de la vida | PLC60015 | |
| 1 mL Jeringa BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Preparado al 20% con agua Milli-Q |
| Placa de cultivo de 96 pocillos | SPL ciencias de la | vida | |
| Etanol absoluto Pharmpur | Scharlab ET0006005P | Se utiliza para preparar etanol al 96% y al 75% con agua Milli-Q | |
| Punzón de biopsia con émbolo de 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Suero bovino Albúmina (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Preparado al 5% con PBS |
| Explantes de cartílago | IdISBa | ||
| Tubo concentrador 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Tubo concentrador 500 µ L Nanosep 100 kD Omega | Pall OD003C33 | ||
| Cubierta de vidrio 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medio | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| integrados | Biobanco | Tarifa por servicio | |
| Columnas mini-HD Exo-spin | Sistemas de guiado de células | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µ m filtro de jeringa | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield con DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatina M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare una solución madre hasta una concentración final de 0,1 µ g/µ L diluido en PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Preparado al 4% con PBS y almacenado a 4 & grados; C |
| Solución de penicilina-estreptomicina 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Kit de enlazador de células fluorescentes rojas para el etiquetado general de membranas celulares | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 y Dliuent C incluido |
| Citrato de sodio dihidratado | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFy alfa; | R& D systems | 210-TA-005 | Prepare una solución madre hasta una concentración final de 0,01 µ g/µ L diluido en PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Se utiliza para preparar una solución de citrato de sodio Triton-0.1% al 0.1% con agua Milli-Q |
| Xileno | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 | R Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 |
| rotor NanoSight NS300 | Dispositivo Malvern | NS300 | con láser integrado a λ= 532 nm y cámara sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Microtomo manual | Thermo Scientific™ | ||
| Microscopio confocal A78100101 TCS-SPE | 5200000271 | Leica Microsystems |
Referencias
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T.
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Reimpresiones y permisos
