Etiquetado de vesículas extracelulares para monitorear la migración y absorción en explantes de cartílago

La artrosis (OA) es una enfermedad articular degenerativa que implica una inflamación y destrucción progresiva e irreversible de la matriz extracelular del cartílago articular¹. Aunque varias formas de artritis tienen numerosos tratamientos^2,3,4,estos están restringidos por sus efectos secundarios y eficacia limitada. Las técnicas de ingeniería tisular que utilizan la implantación autóloga de condrocitos se aplican rutinariamente para el tratamiento regenerativo del cartílago lesionado en lesiones tempranas de cartílago OA⁴. Las terapias basadas en células están restringidas principalmente debido al número limitado de condrocitos fenotípicamente estables o condroprogenitores capaces de reparar eficazmente el cartílago³. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para prevenir la progresión de la enfermedad y regenerar grandes lesiones de cartílago es de suma importancia.

Las vesículas extracelulares (EV) han sido sugeridas como tratamiento para la OA por diferentes autores^5,6. Los EV son cuerpos membranosos secretados por la mayoría de los tipos de células, están involucrados en la señalización intercelular y se ha demostrado que ejercen los efectos terapéuticos de las células madre^7,8,9, debido a lo cual recientemente han despertado interés en la medicina regenerativa¹⁰. Los EV derivados de células estromales mesenquimales (MSC) son los principales EV terapéuticos investigados para la OA, aunque se han utilizado otras células relacionadas con las articulaciones como fuentes de EV, por ejemplo, condroprogenitores o células inmunes^11,12.

Los concentrados plaquetarios, como los lisados plaquetarios (PL), se utilizan para potenciar la cicatrización de heridas en diferentes lesiones, como las úlceras corneales^{13,14, 15} o en la regeneración del tejido tendinoso^16,debido a la hipótesis de que el componente EV de los concentrados plaquetarios puede ser responsable de estos efectos¹⁷ . Algunos estudios relacionados con enfermedades relacionadas con las articulaciones utilizan EV derivados de plaquetas (PL-EV) como tratamiento para mejorar las afecciones osteoartríticas. Los PL-EV mejoran la proliferación de condrocitos y la migración celular activando la vía Wnt/β-catenina^18,promoviendo la expresión de marcadores condrogénicos en condrocitos osteoartríticos^19,o mostrando mayores niveles de proteínas condrogénicas y menos anomalías tisulares en conejos osteoartríticos tratados con PL-EV¹⁸.

Los EV contienen proteínas, lípidos y ácidos nucleicos que se liberan a la célula diana, estableciendo la comunicación célula a célula, que es la principal característica relacionada con sus aplicaciones terapéuticas²⁰. Los efectos de los vehículos eléctricos dependen de sus células de alcance y posterior liberación de carga. Este efecto puede confirmarse indirectamente por cambios causados en las células, como la actividad metabólica o la modificación de la expresión génica. Sin embargo, estos métodos no permiten la visualización de cómo los EV llegan a las células para ejercer su función. Por lo tanto, este documento presenta un método para etiquetar estos EV derivados de PL para ser utilizados como tratamiento para explantes de cartílago de OA impulsados por la inflamación. Se utilizó microscopía confocal para monitorizar la captación de EV y la progresión a los condrocitos presentes en los explantes en un lapso de tiempo de 5 h.

NOTA: Los explantes de cartílago se obtuvieron del Biobanco IdISBa (IB 1995/12 BIO) de conformidad con las directrices institucionales tras la aprobación ética del proyecto por parte del CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Preparación de la columna

1. Equilibre las columnas siguiendo las instrucciones del fabricante o de la siguiente manera:
   1. Retire la tapa de la columna y equilibre la columna. Elimine el búfer de almacenamiento por elución.
   2. Lave la columna 3 veces con 2,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Durante cada lavado, espere a que la columna absorba todo el volumen.
      NOTA: No deje secar la columna.
   3. Cubra la columna con la tapa después del último lavado y hasta la preparación de la muestra.

2. Etiquetado EV

NOTA: Este protocolo de etiquetado EV utiliza una muestra PL-EV previamente aislada por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) con las condiciones previamente descritas^21,22. Sin embargo, cualquier muestra de EV de cualquier fuente se puede utilizar con este protocolo.

1. Concentre la muestra EV y el control (PBS) utilizando un tubo concentrador.
   1. Coloque las muestras en un tubo de concentración de 15 ml o 500 μL, dependiendo del volumen inicial de la muestra EV de partida. Centrifugar los tubos de acuerdo con las instrucciones del fabricante hasta obtener una muestra casi seca.
      NOTA: La muestra de control es necesaria para comprobar si hay fondo de tinte. Aunque este método no requiere ningún volumen inicial específico, se debe considerar que alrededor del 10% de las partículas se perderán durante los pasos de purificación.
2. Resuspender las muestras concentradas con diluyente C. Resuspend muestras EV con 200 μL y el grupo control con 100 μL y transferirlas a nuevos tubos centrífugos de 1,5 mL.
3. Separe la muestra EV en dos alícuotas de 100 μL. Marque una con tinte y úsela como tratamiento (PKH-PL-EV); deje el otro sin marcar, pero procesarlo (NTA-PL-EV) como la muestra EV y úselo para cuantificar la concentración de EV por NTA.
4. Prepare 2x solución de colorante, dando como resultado una solución de PKH26 de 8 μM en el diluyente C.
5. Mezclar 1 μL de enlazador PKH26 de 1 mM por 125 μL de diluyente C en la muestra. Prepare un volumen necesario para agregar a las muestras en una proporción de 1:1.
6. Agregue 2x solución de tinte a PKH-PL-EV y controle muestras en una proporción de 1: 1 para lograr una concentración de colorante de 1x y una concentración de PKH26 de 4 μM. Agregue el mismo volumen de PBS a la muestra NTA-PL-EV. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
7. Agregue una solución de albúmina-PBS sérica bovina al 5% a las muestras en una proporción de 1: 1 y asegúrese de que el volumen final sea de ~ 400 μL.
   NOTA: Este paso permite la eliminación de interacciones de tinte inespecífico o tinte no unido.
8. Proceda a separar los EV etiquetados del tinte no unido y las interacciones no específicas del tinte con la columna.

3. Aislamiento de EV etiquetado

1. Retire la tapa de la columna, agregue 400 μL de la muestra (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV o control) y deseche todo el líquido eluido.
2. Espere a que la muestra entre completamente en la columna antes de continuar con el siguiente paso. Añadir 600 μL de PBS y desechar todo el líquido eluido.
3. Espere a que el PBS ingrese la columna por completo antes de continuar con el siguiente paso. Añadir 600 μL de PBS y recoger una fracción de 600 μL en un 1,5. tubo centrífugo mL (EV o control).
   NOTA: Estos pasos son necesarios para eliminar el exceso de tinte de las muestras. Se necesita otra separación por columna para obtener vehículos eléctricos más puros. Por lo tanto, los siguientes pasos deben realizarse en una nueva columna equilibrada (paso 4.1.) o la misma columna después de un paso de lavado inicial (paso 4.2).
4. Prepare la columna para un nuevo paso de separación de EV para obtener EV más puros. Si se trata de una columna nueva, repita los pasos 2.1. y 2.2. Si es la misma columna, lave la columna con 2,5 ml de isopropanol al 20% y luego repita los pasos 2.1 y 2.2.
5. Agregue 600 μL de evs previamente eluidos obtenidos en el paso 2.5 a la columna y descarte el volumen eluido. Espere a que el líquido entre completamente en la columna antes de continuar con el siguiente paso.
6. Agregue 400 μL de PBS y deseche todo el volumen eluido. Espere a que el líquido entre completamente en la columna antes de continuar con el siguiente paso.
7. Añadir 600 μL de PBS y recoger una fracción de 600 μL en un tubo centrífugo de 1,5 ml. Utilice los vehículos eléctricos y las muestras de control para análisis adicionales o guárdelos durante la noche a 4 oC.
8. Almacene las columnas usadas para su uso futuro.
   1. Lavar la columna con 25 mL de isopropanol al 20% y desechar el volumen eluido. Lave la columna 3 veces con 2,5 ml de PBS.
   2. Agregue el búfer de almacenamiento eliminado en el paso 1.1.1 y espere a que el búfer entre en la columna. Cubra la columna con la tapa y guárdela a 4 oC hasta su uso posterior.

4. Cuantificación ev

1. Prepare diluciones 1:1,000 de la muestra NTA-PL-EV y la muestra pl-EV inicial como se describe en los dos pasos siguientes.
   1. Preparar 1 mL de NTA-PL-EV diluido 1:10 y 1 mL de PL-EV inicial diluido 1:10 con PBS filtrado a través de un filtro de 0,2 μm.
   2. Preparar 1 ml de una dilución de 1:100 de las muestras diluidas anteriores con PBS filtrado a través de un filtro de 0,2 μm.
2. Inyecte la muestra de NTA-PL-EV diluida 1:1,000 o la muestra inicial de PL-EV con una jeringa estéril en la bomba NTA. Siga las instrucciones y recomendaciones del fabricante para la determinación de la concentración de partículas y la distribución del tamaño.
   NOTA: Como la concentración de EV depende del volumen de arranque de la muestra, puede ser necesario leer las diluciones intermedias y realizar ajustes para obtener una determinación correcta de NTA.

5. EV utilizados como tratamiento para la OA impulsada por la inflamación

1. Lave el cartílago dos veces con PBS y apóselo con una punción de biopsia de 3 mm de diámetro en condiciones estériles.
   NOTA: Realice el procedimiento de los pasos 5.1 a 5.6 en una campana de cultivo celular.
2. Coloque los explantes en placas de cultivo de 96 pocillos con medio DMEM-F12 suplementado con 1% de penicilina-estreptomicina a 37 oC, 5% de CO₂y 80% de humedad.
   1. Para establecer un modelo de OA impulsado por la inflamación, complemente el medio de cultivo celular con 10 ng/mL de oncostatina M y 2 ng/mL de factor de necrosis tumoral alfa (TNFα).
3. Tratar los explantes con 1 × 10⁹ partículas/pocillo de EV marcados (PKH-PL-EV) o control en medio de cultivo celular suplementado con oncostatina M y TNFα.
   NOTA: Mida el volumen de la muestra que contiene 1 × 10⁹ partículas/pozo y utilice el mismo volumen para el control.
4. Retire el medio de las placas de cultivo celular de 96 pocillos que contienen explantes de cartílago. Añadir 200 μL del medio de cultivo celular descrito en el paso 5.3 a cada pocillo.
   NOTA: Si las placas de 96 pocillos han estado en contacto con suero fetal bovino (FBS), lave cada pozo tres veces con 200 μL de PBS para eliminar cualquier EV del FBS.
5. Detener el ensayo in vitro en diferentes momentos: 0, 1, 2, 3, 4 y 5 h.
6. Lave los pocillos de cultivo celular que contienen los explantes de cartílago dos veces con 200 μL de PBS.
7. Añadir 100 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) al tejido para fijarlo durante 3 h a 4 oC.
   NOTA: Los pasos que involucran PFA deben realizarse en una campana de humos siguiendo las recomendaciones de la Hoja de datos de seguridad.
8. Retire el PFA, agregue 100 μL de PBS, almacene el tejido fijo a 4 °C y procese las muestras dentro de las 48 h.

6. Preparación y visualización de microscopía

NOTA: Este procedimiento histológico consiste en pasos de deshidratación, incrustación de parafina y rehidratación. Estos pasos pueden reducir la fluorescencia general del colorante (una limitación mencionada en la hoja de datos para PKH26). Por lo tanto, otros procedimientos, como la sección congelada, pueden ser más adecuados para la visualización de EV por microscopía confocal.

1. Incrustar los tejidos fijos en bloques de parafina. Cortar el tejido en secciones de 6 μm de espesor.
2. Desparafinar las secciones de tejido.
   NOTA: Todos los pasos que usan xileno deben realizarse en una campana extractora de humos.
   1. Sumergir las secciones de tejido en xileno durante 30 min, 100% etanol durante 2 min, 96% etanol durante 2 min, 75% etanol durante 1 min, y finalmente en agua destilada durante 30 s.
3. Permeabilizar las secciones de tejido.
   1. Prepare una solución de citrato de sodio Triton-0.1% al 0.1% para permeabilizar el tejido. Agregue una gota de 20 μL a cada sección de tejido e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave cada sección dos veces con 20 μL de PBS.
4. En una diapositiva microscópica, agregue una gota de medio de montaje que contenga 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) con un medio de montaje acuoso para preservar la fluorescencia. Cubra la diapositiva que contiene 3 secciones de tejido del paso 6.3.1.
5. Incubar los portaobjetos durante la noche a temperatura ambiente, protegidos de la luz.
6. Conservar a 4 °C, protegido de la luz hasta la microscopía confocal.

En la Figura 1se muestra una descripción general esquemática para el etiquetado de vehículos eléctricos y el monitoreo de la absorción. La concentración de partículas y el tamaño de EV detectados por NTA en la Tabla 1 muestran que la concentración de EV disminuye durante el proceso debido al paso de purificación realizado dos veces después del etiquetado con la columna. Sin embargo, la cantidad obtenida está en el rango óptimo del número de partículas a utilizar para el tratamiento. Esta concentración de partículas se utiliza para calcular el volumen de PKH-PL-EV y el control que se utilizan para tratar los explantes de cartílago osteoartrítico.

Una vez que los explantes de cartílago se tratan con EV o el grupo control, se fijan para diferentes períodos: 0, 1, 2, 3, 4 y 5 h. Luego, cada grupo se parafina, se corta en rodajas y se prepara para la microscopía confocal con un medio de montaje que contiene DAPI. En la Figura 2se presentan imágenes representativas para cada grupo en cada punto temporal, mostrando cómo los EV entran en el tejido hasta que llegan a los condrocitos y entran en ellos con el tiempo.

Como se ve en la Figura 2,los EV marcados ya están localizados alrededor de los condrocitos (mostrados en azul con tinción DAPI) después de 1 h de incubación (mostrados en rojo con tinte PKH26). Se puede observar algún fondo debido al tinte remanente para el grupo de control, que no tiene EV pero se procesa siguiendo el mismo protocolo que la muestra EV. Estos resultados confirman el éxito del protocolo para etiquetar los EV, que se puede utilizar para monitorear su migración a través del tejido en ensayos in vitro, como se muestra aquí, y en experimentos in vivo.

Figura 1: Descripción general esquemática para el protocolo de monitoreo de etiquetado y absorción de EV. Abreviaturas: PBS = solución salina tamponada con fosfato; EV = vesícula extracelular; RT = temperatura ambiente; BSA = albúmina sérica bovina; NTA = análisis de seguimiento de nanopartículas; OA = osteoartritis; TNFα = factor de necrosis tumoral alfa; PL = lisado plaquetario; PFA = paraformaldehído; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes representativas de la absorción de EV en diferentes momentos. Imágenes representativas confocales tomadas después de 0, 1, 2, 3, 4 y 5 h de explantes de cartílago osteoartrítico incubados con EV marcados con PKH o con un grupo de control. Las imágenes fueron tomadas a 400x. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: OA = osteoartritis; PL = lisado plaquetario; EV = vesícula extracelular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Caracterización por análisis de seguimiento de nanopartículas. Abreviaturas: OA = osteoartritis; PL = lisado plaquetario; EV = vesícula extracelular; NTA = análisis de seguimiento de nanopartículas.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.