Etichettatura delle vescicole extracellulari per il monitoraggio della migrazione e dell'assorbimento negli espianti di cartilagine

L'osteoartrite (OA) è una malattia degenerativa articolare che implica un'infiammazione progressiva e irreversibile e la distruzione della matrice extracellulare della cartilagine^{articolare 1}. Sebbene varie forme di artrite abbiano numerosi trattamenti^2,3,4, questi sono limitati dai loro effetti collaterali e dall'efficacia limitata. Le tecniche di ingegneria tissutale che utilizzano l'impianto autologo dei condrociti sono applicate di routine per il trattamento rigenerativo della cartilagine lesa nelle prime lesioni della cartilagine OA⁴. Le terapie cellulari sono limitate principalmente a causa del numero limitato di condrociti fenotipicamente stabili o condroprogenitori in grado di riparare efficacemente la cartilagine³. Pertanto, lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per prevenire la progressione della malattia e rigenerare le lesioni cartilaginee di grandi dimensioni è di fondamentale importanza.

Le vescicole extracellulari (EV) sono state suggerite come trattamento per l'OA da diversi autori^5,6. Gli EV sono corpi membranosi secreti dalla maggior parte dei tipi di cellule, sono coinvolti nella segnalazione intercellulare e hanno dimostrato di esercitare gli effetti terapeutici delle cellule staminali^7,8,9,a causa dei quali hanno recentemente suscitato interesse nella medicina rigenerativa¹⁰. Gli EV derivati dalle cellule stromali mesenchimali (MSC) sono i principali EV terapeutici studiati per l'OA, sebbene altre cellule correlate alle articolazioni siano state utilizzate come fonti EV, ad esempio condroprogenitori o cellule immunitarie^11,12.

I concentrati piastrinici, come i lisati piastrinici (PL), sono usati per migliorare la guarigione delle ferite in diverse lesioni, come le ulcere corneali^13,14,15 o nella rigenerazione del tessuto tendineo¹⁶, a causa dell'ipotesi che la componente EV dei concentrati piastrinici possa essere responsabile di questi effetti¹⁷ . Alcuni studi relativi alle malattie correlate alle articolazioni utilizzano EV derivati dalle piastrine (PL-EV) come trattamento per migliorare le condizioni osteoartritiche. I PL-EV migliorano la proliferazione dei condrociti e la migrazione cellulare attivando la via Wnt/β-catenina^18,promuovendo l'espressione di marcatori condrogeni nei condrociti osteoartritici^19,o mostrando livelli più elevati di proteine condrogeniche e meno anomalie tissulari nei conigli osteoartritici trattati con PL-EV^18.

Gli EV contengono proteine, lipidi e acidi nucleici che vengono liberati dalla cellula bersaglio, stabilendo la comunicazione cellula-cellula, che è la caratteristica principale correlata alle loro applicazioni terapeutiche²⁰. Gli effetti dei veicoli elettrici dipendono dal loro raggiungimento delle cellule e dal successivo rilascio del carico. Questo effetto può essere confermato indirettamente da cambiamenti causati nelle cellule, come l'attività metabolica o la modifica dell'espressione genica. Tuttavia, questi metodi non consentono la visualizzazione di come i veicoli elettrici raggiungono le cellule per esercitare la loro funzione. Pertanto, questo documento presenta un metodo per etichettare questi veicoli elettrici derivati da PL da utilizzare come trattamento per gli espianti di cartilagine OA guidati dall'infiammazione. La microscopia confocale è stata utilizzata per monitorare l'assorbimento e la progressione dell'EV ai condrociti presenti negli espianti in un time-lapse di 5 ore.

NOTA: Gli espianti di cartilagine sono stati ottenuti dalla Biobanca IdISBa (IB 1995/12 BIO) in conformità alle linee guida istituzionali dopo l'approvazione etica del progetto da parte del CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Preparazione della colonna

1. Equilibrare le colonne seguendo le istruzioni del produttore o come segue:
   1. Rimuovere il cappuccio della colonna ed equilibrare la colonna. Rimuovere il buffer di archiviazione per eluizione.
   2. Lavare la colonna 3 volte con 2,5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Durante ogni lavaggio, attendere che la colonna assorba l'intero volume.
      NOTA: non lasciare asciugare la colonna.
   3. Coprire la colonna con il tappo dopo l'ultimo lavaggio e fino alla preparazione del campione.

2. Etichettatura EV

NOTA: Questo protocollo di etichettatura EV utilizza un campione PL-EV precedentemente isolato dalla cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) con condizioni precedentemente descritte^21,22. Tuttavia, qualsiasi campione EV da qualsiasi fonte può essere utilizzato con questo protocollo.

1. Concentrare il campione EV e il controllo (PBS) utilizzando un tubo di concentrazione.
   1. Posizionare i campioni in un tubo di concentrazione da 15 mL o 500 μL, a seconda del volume iniziale di partenza del campione EV. Centrifugare i tubi secondo le istruzioni del produttore fino ad ottenere un campione quasi asciutto.
      NOTA: il campione di controllo è necessario per verificare la presenza di qualsiasi sfondo colorante. Sebbene questo metodo non richieda alcun volume iniziale specifico, va considerato che circa il 10% delle particelle andrà perso durante le fasi di purificazione.
2. Sospendere i campioni concentrati con diluente C. Resuspend EV campioni con 200 μL e il gruppo di controllo con 100 μL e trasferirli in nuovi tubi centrifughi da 1,5 mL.
3. Separare il campione EV in due aliquote di 100 μL. Contrassegnarne uno con colorante e utilizzarlo come trattamento (PKH-PL-EV); lasciare l'altro non contrassegnato ma elaborarlo (NTA-PL-EV) come il campione EV e usarlo per quantificare la concentrazione EV per NTA.
4. Preparare 2x soluzione colorante, ottenendo una soluzione di PKH26 da 8 μM nel diluente C.
5. Miscelare 1 μL di 1 mM di linker PKH26 per 125 μL di diluente C nel campione. Preparare un volume necessario da aggiungere ai campioni in un rapporto 1:1.
6. Aggiungere 2x soluzione colorante a PKH-PL-EV e controllare i campioni in un rapporto 1:1 per ottenere 1x concentrazione di colorante e 4 μM di concentrazione di PKH26. Aggiungere lo stesso volume di PBS al campione NTA-PL-EV. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Aggiungere la soluzione di albumina-PBS sierica bovina al 5% ai campioni in un rapporto 1:1 e assicurarsi che il volume finale sia ~ 400 μL.
   NOTA: questo passaggio consente la rimozione di interazioni di colorante non specifiche o colorante non legato.
8. Procedere a separare i veicoli elettrici etichettati dal colorante non legato e dalle interazioni non specifiche del colorante con la colonna.

3. Isolamento EV etichettato

1. Rimuovere il tappo dalla colonna, aggiungere 400 μL del campione (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV o controllo) ed eliminare tutto il liquido eluito.
2. Attendere che l'esempio entri completamente nella colonna prima di procedere al passaggio successivo. Aggiungere 600 μL di PBS ed eliminare tutto il liquido eluito.
3. Attendere che il PBS entri completamente nella colonna prima di procedere al passaggio successivo. Aggiungere 600 μL di PBS e raccogliere una frazione di 600 μL in un 1,5. Tubo centrifugo mL (EV o controllo).
   NOTA: questi passaggi sono necessari per rimuovere il colorante in eccesso dai campioni. Un'altra separazione per colonna è necessaria per ottenere veicoli elettrici più puri. Pertanto, i seguenti passaggi devono essere eseguiti in una nuova colonna equilibrata (punto 4.1.) o nella stessa colonna dopo una fase iniziale di lavaggio (passaggio 4.2).
4. Preparare la colonna per una nuova fase di separazione EV per ottenere veicoli elettrici più puri. Se si tratta di una nuova colonna, ripetere i passaggi 2.1. e 2.2. Se si tratta della stessa colonna, lavare la colonna con 2,5 mL di isopropanolo al 20% e quindi ripetere i passaggi 2.1 e 2.2.
5. Aggiungere alla colonna 600 μL di veicoli elettrici precedentemente eluiti ottenuti nel punto 2.5 ed eliminare il volume eluito. Attendere che il liquido entri completamente nella colonna prima di procedere al passaggio successivo.
6. Aggiungere 400 μL di PBS ed eliminare tutto il volume eluito. Attendere che il liquido entri completamente nella colonna prima di procedere al passaggio successivo.
7. Aggiungere 600 μL di PBS e raccogliere una frazione di 600 μL in un tubo centrifuga da 1,5 mL. Utilizzare i veicoli elettrici e i campioni di controllo per ulteriori analisi o conservarli durante la notte a 4 oC.
8. Memorizzare le colonne utilizzate per un uso futuro.
   1. Lavare la colonna con 25 ml di isopropanolo al 20% ed eliminare il volume eluito. Lavare la colonna 3 volte con 2,5 ml di PBS.
   2. Aggiungere il buffer di archiviazione rimosso nel passaggio 1.1.1 e attendere che il buffer entri nella colonna. Coprire la colonna con il tappo e conservare a 4 oC fino all'uso successivo.

4. Quantificazione EV

1. Preparare 1:1.000 diluizioni del campione NTA-PL-EV e del campione PL-EV iniziale come descritto nei due passaggi seguenti.
   1. Preparare 1 mL di NTA-PL-EV diluito 1:10 e 1 mL di PL-EV iniziale diluito 1:10 con PBS filtrato attraverso un filtro da 0,2 μm.
   2. Preparare 1 mL di diluizione 1:100 dei campioni diluiti precedenti con PBS filtrato attraverso un filtro da 0,2 μm.
2. Iniettare il campione NTA-PL-EV diluito 1:1.000 o il campione PL-EV iniziale utilizzando una siringa sterile nella pompa NTA. Seguire le istruzioni e le raccomandazioni del produttore per la determinazione della concentrazione delle particelle e della distribuzione dimensionale.
   NOTA: poiché la concentrazione di EV dipende dal volume di avviamento del campione, potrebbe essere necessario leggere le diluizioni intermedie e apportare modifiche per ottenere una corretta determinazione dell'NTA.

5. Veicoli elettrici usati come trattamento per l'OA guidata dall'infiammazione

1. Lavare la cartilagine due volte con PBS e asportare con un punzone per biopsia di 3 mm di diametro in condizioni sterili.
   NOTA: eseguire la procedura dai passaggi da 5.1 a 5.6 in una cappa di coltura cellulare.
2. Posizionare gli espianti in piastre di coltura a 96 pozzetti con mezzo DMEM-F12 integrato con l'1% di penicillina-streptomicina a 37 oC, il 5% di CO₂e l'80% di umidità.
   1. Per stabilire un modello di OA guidato dall'infiammazione, integrare il terreno di coltura cellulare con 10 ng / mL oncostatina M e 2 ng / mL fattore di necrosi tumorale alfa (TNFα).
3. Trattare gli espianti con 1 × 10⁹ particelle/pozzetto di VEICOLI elettrici etichettati (PKH-PL-EV) o controllo in terreno di coltura cellulare integrato con oncostatina M e TNFα.
   NOTA: Misurare il volume del campione contenente 1 × 10⁹ particelle/pozzetto e utilizzare lo stesso volume per il controllo.
4. Rimuovere il mezzo dalle piastre di coltura cellulare a 96 pozzetti contenenti espianti di cartilagine. Aggiungere 200 μL del terreno di coltura cellulare descritto al punto 5.3 a ciascun pozzetto.
   NOTA: se le piastre a 96 pozzetti sono state a contatto con il siero bovino fetale (FBS), lavare ogni pozzetto tre volte con 200 μL di PBS per rimuovere eventuali veicoli elettrici dall'FBS.
5. Interrompere il test in vitro in momenti diversi: 0, 1, 2, 3, 4 e 5 ore.
6. Lavare due volte i pozzetti di coltura cellulare contenenti gli espianti di cartilagine con 200 μL di PBS.
7. Aggiungere 100 μL di paraformaldeide al 4% (PFA) al tessuto per fissarlo per 3 ore a 4 oC.
   NOTA: le fasi che coinvolgono il PFA devono essere eseguite in una cappa aspirante seguendo le raccomandazioni della scheda di dati di sicurezza.
8. Rimuovere il PFA, aggiungere 100 μL di PBS, conservare il tessuto fisso a 4 °C ed elaborare i campioni entro 48 ore.

6. Preparazione e visualizzazione della microscopia

NOTA: Questa procedura istologica consiste in disidratazione, incorporamento di paraffina e fasi di reidratazione. Questi passaggi possono ridurre la fluorescenza complessiva del colorante (una limitazione menzionata nella scheda tecnica per PKH26). Pertanto, altre procedure, come il sezionamento congelato, possono essere più adatte per la visualizzazione EV mediante microscopia confocale.

1. Incorporare i tessuti fissi in blocchi di paraffina. Tagliare il tessuto in sezioni spesse 6 μm.
2. Deparaffinizzare le sezioni di tessuto.
   NOTA: Tutti i passaggi con xilene devono essere eseguiti in una cappa aspirante.
   1. Immergere le sezioni di tessuto in xilene per 30 min, 100% etanolo per 2 min, 96% etanolo per 2 min, 75% etanolo per 1 min, e infine in acqua distillata per 30 s.
3. Permeabilizzare le sezioni tissutali.
   1. Preparare una soluzione di citrato di sodio tritone-0,1% allo 0,1% per permeabilizzare il tessuto. Aggiungere una goccia di 20 μL a ciascuna sezione di tessuto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare ogni sezione due volte con 20 μL di PBS.
4. Su un vetrino microscopico, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio contenente 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) con un mezzo di montaggio acquoso per preservare la fluorescenza. Coprire il vetrino contenente 3 sezioni di tessuto dal punto 6.3.1.
5. Incubare i vetrini durante la notte a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
6. Conservare a 4 °C, al riparo dalla luce fino alla microscopia confocale.

Una panoramica schematica per l'etichettatura dei veicoli elettrici e il monitoraggio dell'assorbimento dei veicoli elettrici è visualizzata nella Figura 1. La concentrazione di particelle e la dimensione EV rilevate da NTA nella Tabella 1 mostrano che la concentrazione EV diminuisce durante il processo a causa della fase di purificazione eseguita due volte dopo l'etichettatura con la colonna. Tuttavia, la quantità ottenuta è nell'intervallo ottimale del numero di particelle da utilizzare per il trattamento. Questa concentrazione di particelle viene utilizzata per calcolare il volume di PKH-PL-EV e il controllo che vengono utilizzati per trattare gli espianti della cartilagine osteoartritica.

Una volta che gli espianti di cartilagine sono trattati con VEICOLI elettrici o il gruppo di controllo, vengono fissati per periodi diversi: 0, 1, 2, 3, 4 e 5 ore. Ogni gruppo viene quindi paraffinizzato, affettato e preparato per la microscopia confocale con un mezzo di montaggio contenente DAPI. Le immagini rappresentative per ciascun gruppo in ogni punto temporale sono presentate nella Figura 2, mostrando come gli EV entrano nel tessuto fino a raggiungere i condrociti e li inseriscono nel tempo.

Come si vede nella Figura 2,i veicoli elettrici marcati sono già localizzati intorno ai condrociti (mostrati in blu con colorazione DAPI) dopo 1 ora di incubazione (mostrati in rosso con colorante PKH26). Alcuni retroscena dovuti al colorante residuo possono essere osservati per il gruppo di controllo, che non ha veicoli elettrici ma viene elaborato seguendo lo stesso protocollo del campione EV. Questi risultati confermano il successo del protocollo per etichettare i veicoli elettrici, che può essere utilizzato per monitorare la loro migrazione attraverso i tessuti in saggi in vitro, come mostrato qui, e in esperimenti in vivo.

Figura 1: Panoramica schematica per l'etichettatura EV e il protocollo di monitoraggio dell'assorbimento. Abbreviazioni: PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; EV = vescicola extracellulare; RT = temperatura ambiente; BSA = albumina sierica bovina; NTA = analisi di tracciamento delle nanoparticelle; OA = osteoartrite; TNFα = fattore di necrosi tumorale-alfa; PL = lisato piastrinico; PFA = paraformaldeide; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative dell'assorbimento dei veicoli elettrici in momenti diversi. Immagini rappresentative confocali scattate dopo 0, 1, 2, 3, 4 e 5 ore di espianti di cartilagine osteoartritica incubate con veicoli elettrici marcati PKH o con un gruppo di controllo. Le immagini sono state scattate a 400x. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: OA = osteoartrite; PL = lisato piastrinico; EV = vescicola extracellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Caratterizzazione mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle. Abbreviazioni: OA = osteoartrite; PL = lisato piastrinico; EV = vescicola extracellulare; NTA = analisi di tracciamento delle nanoparticelle.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.