Etichettatura delle vescicole extracellulari per il monitoraggio della migrazione e dell'assorbimento negli espianti di cartilagine

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per etichettare le vescicole extracellulari derivate dal lisato piastrinico per monitorare la loro migrazione e assorbimento negli espianti di cartilagine utilizzati come modello per l'osteoartrite.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) sono utilizzate in diversi studi per dimostrare il loro potenziale come trattamento privo di cellule a causa del loro carico derivato dalla loro fonte cellulare, come il lisato piastrinico (PL). Se usati come trattamento, ci si aspetta che i veicoli elettrici entrino nelle cellule bersaglio e abbiano una risposta da queste. In questa ricerca, gli EV derivati da PL sono stati studiati come trattamento privo di cellule per l'osteoartrite (OA). Pertanto, è stato istituito un metodo per etichettare i veicoli elettrici e testarne l'assorbimento sugli espianti di cartilagine. I veicoli elettrici derivati da PL sono etichettati con il colorante lipofilo PKH26, lavati due volte attraverso una colonna e quindi testati in un modello OA in vitro guidato dall'infiammazione per 5 ore dopo la quantificazione delle particelle mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Ogni ora, gli espianti di cartilagine vengono fissati, paraffinati, tagliati in sezioni da 6 μm per essere montati su vetrini e osservati al microscopio confocale. Ciò consente di verificare se gli EV entrano nelle cellule bersaglio (condrociti) durante questo periodo e analizzare il loro effetto diretto.

Introduction

L'osteoartrite (OA) è una malattia degenerativa articolare che implica un'infiammazione progressiva e irreversibile e la distruzione della matrice extracellulare della cartilagine^{articolare 1}. Sebbene varie forme di artrite abbiano numerosi trattamenti^2,3,4, questi sono limitati dai loro effetti collaterali e dall'efficacia limitata. Le tecniche di ingegneria tissutale che utilizzano l'impianto autologo dei condrociti sono applicate di routine per il trattamento rigenerativo della cartilagine lesa nelle prime lesioni della cartilagine OA

Protocol

NOTA: Gli espianti di cartilagine sono stati ottenuti dalla Biobanca IdISBa (IB 1995/12 BIO) in conformità alle linee guida istituzionali dopo l'approvazione etica del progetto da parte del CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Preparazione della colonna

1. Equilibrare le colonne seguendo le istruzioni del produttore o come segue:
   1. Rimuovere il cappuccio della colonna ed equilibrare la colonna. Rimuovere il buffer di archiviazione per eluizione.
   2. Lavare la colonna 3 volte con 2,5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Durante ogni lavaggio, attendere che la colonna assorba l'intero volume.
      NOTA: non lasciare asc....

Results

Una panoramica schematica per l'etichettatura dei veicoli elettrici e il monitoraggio dell'assorbimento dei veicoli elettrici è visualizzata nella Figura 1. La concentrazione di particelle e la dimensione EV rilevate da NTA nella Tabella 1 mostrano che la concentrazione EV diminuisce durante il processo a causa della fase di purificazione eseguita due volte dopo l'etichettatura con la colonna. Tuttavia, la quantità ottenuta è nell'intervallo ottimale del numero di particelle.......

Discussion

L'imaging EV aiuta a comprendere le proprietà EV, come i loro meccanismi di rilascio e assorbimento. Il loro imaging consente il monitoraggio della loro biodistribuzione e la caratterizzazione delle loro proprietà farmacocinetiche come veicoli farmacologici. Tuttavia, l'imaging e il tracciamento dei veicoli elettrici possono essere difficili a causa delle loro piccole dimensioni, sebbene siano stati sviluppati molti dispositivi di imaging e tecniche di etichettatura per aiutare i ricercatori a monitorare i veicoli elettr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiale
1,5 mL Provetta da centrifuga	SPL scienze della vita	PLC60015
Siringa da 1 mL BD Plastipak	BD	303174
2-propanolo (isopropanolo)	Panreac AppliChem	1.310.901.211	Preparato al 20% con acqua Milli-Q
Piastra di coltura a 96 pozzetti	SPL scienze della	vita
Etanolo assoluto Pharmpur	Scharlab	ET0006005P	Utilizzato per preparare etanolo al 96% e al 75% con Milli-Q Punzone
biopsia ad acqua con stantuffo 3 mm	Scandidact	MTP-33-32
Siero bovino  Albumina (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Preparato al 5% con
espianti di cartilagine	IdISBa Biobank
Provetta di concentrazione 15 mL Nanosep 100 kD Omega	Pall	MCP100C41
Provetta di concentrazione 500 &; L Nanosep 100 kD Omega	Pall	OD003C33
Vetro di copertura 24 x 60 mm	Deltalab	D102460
DMEM-F12 -GlutaMAX medium	Biowest	L0092
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Blocchi di tessuto di paraffina incorporati	IdISBa Biobank		Tariffa per il servizio
Colonne mini-HD Exo-spin	Sistemi di guida cellulare	EX05
Feather S35 Microtomo Blade Feather		43037
Filtropur S 0.2 µ m filtro per siringa	Sarstedt	83.1826.001
Fluoroshield con DAPI	Sigma-Aldrich	F-6057
Oncostatin M Human	Sigma-Aldrich	O9635-10UG	Preparare una soluzione madre a una concentrazione finale di 0,1 &; g/µ L diluten in PBS-0,1%
BSA Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	8.18715.1000	Preparato al 4% con PBS e conservato a 4 gradi; C
Soluzione di penicillina-streptomicina 100x	Biowest	L0022
PKH26 Kit di collegamento cellulare fluorescente rosso per l'etichettatura generale della membrana cellulare	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26 e Dliuent C incluso
Citrato di sodio diidrato	Scharlab	SO019911000
Superfrost Plus Vetrini per microscopio	Thermo Scientific	J1800AMNZ
TNF&alfa;	R& Sistemi D	210-TA-005	Preparare una soluzione madre ad una concentrazione finale di 0,01 & micro; g/µ L diluito in PBS-0,1% BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Utilizzato per preparare una soluzione di citrato di sodio 0,1% Triton-0,1% con acqua Milli-Q
Xylene	Scharlab	XI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11
rotore NanoSight NS300	Dispositivo Malvern	NS300	con laser incorporato a λ= 532 nm e fotocamera sCMOS
Shandon Finesse 325 Manuale Microtomo	Thermo Scientific™
Microscopio confocale TCS-SPE	Leica Microsystems	5200000271