Qui, presentiamo un protocollo per etichettare le vescicole extracellulari derivate dal lisato piastrinico per monitorare la loro migrazione e assorbimento negli espianti di cartilagine utilizzati come modello per l'osteoartrite.
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Articolo metodologico
Etichettatura delle vescicole extracellulari per il monitoraggio della migrazione e dell'assorbimento negli espianti di cartilagine
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le vescicole extracellulari (EV) sono utilizzate in diversi studi per dimostrare il loro potenziale come trattamento privo di cellule a causa del loro carico derivato dalla loro fonte cellulare, come il lisato piastrinico (PL). Se usati come trattamento, ci si aspetta che i veicoli elettrici entrino nelle cellule bersaglio e abbiano una risposta da queste. In questa ricerca, gli EV derivati da PL sono stati studiati come trattamento privo di cellule per l'osteoartrite (OA). Pertanto, è stato istituito un metodo per etichettare i veicoli elettrici e testarne l'assorbimento sugli espianti di cartilagine. I veicoli elettrici derivati da PL sono etichettati con il colorante lipofilo PKH26, lavati due volte attraverso una colonna e quindi testati in un modello OA in vitro guidato dall'infiammazione per 5 ore dopo la quantificazione delle particelle mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Ogni ora, gli espianti di cartilagine vengono fissati, paraffinati, tagliati in sezioni da 6 μm per essere montati su vetrini e osservati al microscopio confocale. Ciò consente di verificare se gli EV entrano nelle cellule bersaglio (condrociti) durante questo periodo e analizzare il loro effetto diretto.
Introduzione
L'osteoartrite (OA) è una malattia degenerativa articolare che implica un'infiammazione progressiva e irreversibile e la distruzione della matrice extracellulare della cartilaginearticolare 1. Sebbene varie forme di artrite abbiano numerosi trattamenti2,3,4, questi sono limitati dai loro effetti collaterali e dall'efficacia limitata. Le tecniche di ingegneria tissutale che utilizzano l'impianto autologo dei condrociti sono applicate di routine per il trattamento rigenerativo della cartilagine lesa nelle prime lesioni della cartilagine OA
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Protocollo
NOTA: Gli espianti di cartilagine sono stati ottenuti dalla Biobanca IdISBa (IB 1995/12 BIO) in conformità alle linee guida istituzionali dopo l'approvazione etica del progetto da parte del CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Preparazione della colonna
- Equilibrare le colonne seguendo le istruzioni del produttore o come segue:
- Rimuovere il cappuccio della colonna ed equilibrare la colonna. Rimuovere il buffer di archiviazione per eluizione.
- Lavare la colonna 3 volte con 2,5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Durante ogni lavaggio, attendere che la colonna assorba l'intero volume.
NOTA: non lasciare asc....
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Risultati
Una panoramica schematica per l'etichettatura dei veicoli elettrici e il monitoraggio dell'assorbimento dei veicoli elettrici è visualizzata nella Figura 1. La concentrazione di particelle e la dimensione EV rilevate da NTA nella Tabella 1 mostrano che la concentrazione EV diminuisce durante il processo a causa della fase di purificazione eseguita due volte dopo l'etichettatura con la colonna. Tuttavia, la quantità ottenuta è nell'intervallo ottimale del numero di particelle.......
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Discussione
L'imaging EV aiuta a comprendere le proprietà EV, come i loro meccanismi di rilascio e assorbimento. Il loro imaging consente il monitoraggio della loro biodistribuzione e la caratterizzazione delle loro proprietà farmacocinetiche come veicoli farmacologici. Tuttavia, l'imaging e il tracciamento dei veicoli elettrici possono essere difficili a causa delle loro piccole dimensioni, sebbene siano stati sviluppati molti dispositivi di imaging e tecniche di etichettatura per aiutare i ricercatori a monitorare i veicoli elettr.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata dall'Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinanziato dal Fondo sociale europeo del FSE e dal Fondo europeo di sviluppo regionale del FESR (MS16/00124; CP16/00124); a cura del PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finanziato dalla tassa di turismo sostenibile delle Isole Baleari; della Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); dal programma post-dottorato FOLIUM (FOLIUM 17/01) all'interno del FUTURMed, finanziato al 50% dalla tassa sul turismo sostenibile delle Isole Baleari e al 50% dal FSE; e d....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiale | |||
| 1,5 mL Provetta da centrifuga | SPL scienze della vita | PLC60015 | |
| Siringa da 1 mL BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-propanolo (isopropanolo) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Preparato al 20% con acqua Milli-Q |
| Piastra di coltura a 96 pozzetti | SPL scienze della | vita | |
| Etanolo assoluto Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Utilizzato per preparare etanolo al 96% e al 75% con Milli-Q Punzone |
| biopsia ad acqua con stantuffo 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Siero bovino Albumina (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Preparato al 5% con |
| espianti di cartilagine | IdISBa Biobank | ||
| Provetta di concentrazione 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Provetta di concentrazione 500 &; L Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Vetro di copertura 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Blocchi di tessuto di paraffina incorporati | IdISBa Biobank | Tariffa per il servizio | |
| Colonne mini-HD Exo-spin | Sistemi di guida cellulare | EX05 | |
| Feather S35 Microtomo Blade Feather | 43037 | ||
| Filtropur S 0.2 µ m filtro per siringa | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield con DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Preparare una soluzione madre a una concentrazione finale di 0,1 &; g/µ L diluten in PBS-0,1% |
| BSA Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Preparato al 4% con PBS e conservato a 4 gradi; C |
| Soluzione di penicillina-streptomicina 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Kit di collegamento cellulare fluorescente rosso per l'etichettatura generale della membrana cellulare | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 e Dliuent C incluso |
| Citrato di sodio diidrato | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Vetrini per microscopio | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNF&alfa; | R& Sistemi D | 210-TA-005 | Preparare una soluzione madre ad una concentrazione finale di 0,01 & micro; g/µ L diluito in PBS-0,1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Utilizzato per preparare una soluzione di citrato di sodio 0,1% Triton-0,1% con acqua Milli-Q |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 |
| rotore NanoSight NS300 | Dispositivo Malvern | NS300 | con laser incorporato a λ= 532 nm e fotocamera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manuale Microtomo | Thermo Scientific™ | ||
| Microscopio confocale TCS-SPE | Leica Microsystems | 5200000271 |
Riferimenti
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T.
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Ristampe e permessi
