Summary
Nous décrivons ici un protocole pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSI). Pour obtenir des organoïdes cérébraux en grande quantité et de haute qualité, nous utilisons des mini-bioréacteurs faits maison.
Abstract
L’organoïde cérébral dérivé de l’iPSC est une technologie prometteuse pour la modélisation in vitro des pathologies du système nerveux et le dépistage des médicaments. Cette technologie a émergé récemment. Il en est encore à ses balbutiements et a encore certaines limites non résolues. Les protocoles actuels ne permettent pas d’obtenir des organoïdes de manière suffisamment cohérente pour la découverte de médicaments et les études précliniques. La maturation des organoïdes peut prendre jusqu’à un an, poussant les chercheurs à lancer plusieurs processus de différenciation simultanément. Il impose des coûts supplémentaires pour le laboratoire en termes d’espace et d’équipement. En outre, les organoïdes cérébraux ont souvent une zone nécrotique au centre, qui souffre d’une carence en nutriments et en oxygène. Par conséquent, la plupart des protocoles actuels utilisent un système de circulation pour le milieu de culture afin d’améliorer la nutrition.
Pendant ce temps, il n’y a pas de systèmes dynamiques peu coûteux ou de bioréacteurs pour la culture d’organoïdes. Cet article décrit un protocole pour la production d’organoïdes cérébraux dans des mini-bioréacteurs compacts et peu coûteux fabriqués à la maison. Ce protocole permet d’obtenir des organoïdes de haute qualité en grande quantité.
Introduction
Les modèles humains dérivés de l’iPSC sont largement utilisés dans les études des troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs1. Au cours de la dernière décennie, les modèles de tissus cérébraux 3D, appelés organoïdes cérébraux, ont essentiellement complété les cultures neuronales 2D traditionnelles2. Les organoïdes récapitulent dans une certaine mesure l’architecture 3D du cerveau embryonnaire et permettent une modélisation plus précise. De nombreux protocoles sont publiés pour la génération d’organoïdes représentant différentes régions du cerveau : cortex cérébral3,4,5,cervelet6,mésencéphale, cerveau antérieur, hypothalamus7,8,9et hippocampe10. Il y a eu de multiples exemples d’utilisation d’organoïdes pour étudier les maladies du système nerveux humain11. En outre, les organoïdes ont été mis en œuvre dans les découvertes de médicaments12 et utilisés dans des études sur les maladies infectieuses, y compris le SARS-Cov-213,14.
Les organoïdes cérébraux peuvent atteindre plusieurs millimètres de diamètre. Ainsi, la zone interne de l’organoïde peut souffrir d’hypoxie ou de malnutrition et éventuellement devenir nécrotique. Par conséquent, de nombreux protocoles incluent des bioréacteurs spéciaux8,des agitateurs ou des systèmes microfluidiques15. Ces dispositifs peuvent nécessiter de grands volumes de milieux de culture cellulaire coûteux. En outre, le coût d’un tel équipement est généralement élevé. Certains bioréacteurs sont constitués de nombreuses pièces mécaniques qui les rendent difficiles à stériliser pour les réutiliser.
La plupart des protocoles souffrent de « l’effet batch »16, qui génère une variabilité significative entre les organoïdes obtenus à partir des cSI identiques. Cette variabilité entrave les tests de dépistage de drogues ou les études précliniques nécessitant une uniformité. Le rendement élevé des organoïdes suffisant pour sélectionner des organoïdes de taille uniforme peut résoudre partiellement ce problème.
Le facteur temps est également un problème important. Matsui et al. (2018) ont montré que les organoïdes cérébraux ont besoin d’au moins six mois pour atteindrela maturité 17. Trujillo et al. (2019) ont également démontré que l’activité électrophysiologique ne se produisait dans les organoïdes qu’après six mois de culture18. En raison du long temps de maturation des organoïdes, les chercheurs lancent souvent une nouvelle différenciation avant de terminer la précédente. De multiples processus parallèles de différenciation nécessitent des dépenses, des équipements et des espaces de laboratoire supplémentaires.
Nous avons récemment développé un mini bioréacteur qui résout principalement les problèmes mentionnés ci-dessus19. Ce bioréacteur fait maison se compose d’une boîte de Petri à très faible adhérence ou non traitée avec un bouton en plastique au centre. Ce bouton en plastique empêche l’encombrement des organoïdes et leur conglutination au centre de la boîte de Pétri, qui est causée par la rotation du shaker. Cet article décrit comment ce mini bioréacteur maison peu coûteux et simple permet de générer des organoïdes cérébraux de haute qualité en grande quantité.
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Protocol
NOTE : Utiliser la technique stérile tout au long du protocole, à l’exception des étapes 1.2 et 1.3. Réchauffer tous les milieux de culture et les solutions à 37 °C avant de les appliquer sur les cellules ou les organoïdes. Cultivez des cellules dans un incubateur à CO2 à 37 °C dans 5 % de CO2 et 80 % d’humidité. Le schéma de protocole est illustré à la figure 1.
1. Transformer les boîtes de Petri en mini-bioréacteurs
- Couper des tubes centrifuges stériles de 15 mL dans des anneaux de 7 à 8 mm de hauteur; autoclavez les anneaux.
- Casser les boîtes de Petri à faible adhérence, non traitées ou microbiologiques en miettes. Dissoudre environ 1 g de miettes de plastique dans 10 mL de chloroforme pendant la nuit pour préparer du plastique liquide.
ATTENTION : Travailler dans une hotte aspirante. - Vérifier que le plastique liquide résultant est suffisamment visqueux pour le pipetage; sa goutte conserve une forme sphérique et ne se propage pas à la surface. S’il est très liquide, ajoutez plus de miettes de plastique. S’il est épais, ajoutez du chloroforme.
- Faites un bouton en plastique au centre d’une boîte de Petri stérile à ultra-faible adhérence de 6 cm. Il existe deux façons également appropriées, comme détaillé ci-dessous.
- Placez l’anneau en plastique autoclavé au centre et déposez le plastique liquide à l’intérieur de l’anneau.
- Sans anneau en plastique, déposez le plastique liquide au centre de la boîte de Pétri.
- Laissez la vaisselle ouverte pendant 2-3 h dans une hotte à écoulement laminaire jusqu’à ce qu’elle soit complètement séchée. Traitez les plats séchés avec un rayonnement ultraviolet pendant 15-20 min.
2. Induction de la différenciation neuronale des CS IPC
- Cultiver des CSPe dans le milieu des cellules souches pluripotentes jusqu’à 75-90% de confluence dans des boîtes de Petri de 35 mm pré-recouvertes d’une matrice constituée de protéines extracellulaires.
- Préparez un A-SR moyen. Voir le tableau 1 pour plus de détails.
- Aspirer le milieu de culture et ajouter 2 mL de milieu A-SR au jour 0 de la différenciation.
- Préparer le milieu A (voir tableau 2).
- Cultivez des cellules en milieu A pendant deux semaines à partir des jours 2 à 14, en les rafraîchissants dans des boîtes de Pétri tous les deux jours.
3. La formation de sphéroïdes à partir de cellules précurseurs neuroépithéliales au jour 14
- Au jour 14, fabriquer des sphéroïdes à partir de cellules précurseurs neuroépithéliales à l’aide d’une plaque de culture spéciale de 24 puits contenant environ 1 200 micropuits dans chaque puits(figure 2C). Suivez la procédure ci-dessous.
REMARQUE: À ce stade de différenciation, une boîte de Petri de 35 mm contient généralement 3 à 3,5 x 106 cellules précurseurs neuroépithéliales. Ainsi, une boîte de Petri de 35 mm avec des cellules précurseurs neuroépithéliales est suffisante pour 3 à 4 puits de plaque de culture de 24 puits avec des micropuits. - Préparer une plaque de culture de 24 puits avec des micropuits : À chaque puits, ajouter 1 mL de milieu A. Centrifuger brièvement à 1 300 x g pendant 5 min dans un rotor à godet oscillant équipé d’un support de plaque. Contrôlez au microscope qu’il n’y a pas de bulles dans les micropuits.
- Préparer le milieu B (Tableau 3).
- Retirer le milieu de la boîte de Pétri avec des cellules précurseurs neuroépithéliales; laver les cellules avec 2 mL de DMEM/F12. Pour le détachement cellulaire, traiter les cellules avec 1,5 mL de solution d’EDTA de 0,48 mM préparée dans du PBS. Contrôlez le détachement de la cellule au microscope.
- Récoltez les cellules dans un tube de 15 mL. Ajouter 5 mL de DMEM/F12 dans le tube pour laver les cellules. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et ressuspender les cellules dans 2 mL de milieu B.
- Vérifiez la concentration cellulaire et la viabilité par coloration Trypan Blue et un hémocytomètre. Calculer le volume de suspension nécessaire pour contenir 1 x 106 cellules viables au total.
- Transférer la suspension cellulaire contenant 1 x 10 6 cellules danschaque puits d’une plaque de 24 puits avec des micropuits. Ajouter le milieu B jusqu’à 2 mL dans chaque puits, pipeter doucement les cellules de haut en bas plusieurs fois, et centrifuger brièvement 100 x g pendant 1 min pour capturer les cellules dans les micropuits.
REMARQUE: Le nombre de cellules par puits ne doit pas dépasser 1 x 106. Sinon, les sphéroïdes des micropuits voisins fusionnent. - Vérifiez au microscope que les cellules sont réparties uniformément dans les micropuits. Répétez le pipetage et la centrifugation si les cellules sont réparties de manière inégale.
- Incuber la plaque pendant la nuit pour laisser les cellules s’agréger en sphéroïdes.
4. Obtention et culture d’organoïdes
- Le lendemain matin (Jour 15), vérifiez la qualité des sphéroïdes au microscope. Assurez-vous qu’ils sont transparents et lisses, s’ils sont sains (Figure 2A, B). Recueillez soigneusement les sphéroïdes de chaque puits dans un tube de 15 mL, laissez les sphéroïdes précipiter par gravité pendant 2-3 minutes, puis retirez le surnageant.
- Ajouter aux sphéroïdes 2 mL de la matrice décongelée pendant le même temps sur la glace. Mélanger doucement par pipetage et incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Pour laver l’excès de matrice, ajouter au tube 8 mL de milieu B. Pipette doucement, puis centrifuger le tube pendant 1 min à 100 x g.
REMARQUE: Ne pas dépasser le temps et la vitesse de centrifugation pour éviter l’agrégation irréversible des sphéroïdes. - Retirez le surnageant. Ajouter au tube 2 mL de milieu B, pipeter doucement. Répartir la suspension sphéroïde entre deux mini-bioréacteurs, contenant chacun 4 mL de milieu B. Placer les mini-bioréacteurs dans une boîte de Petri de 15 cm pour éviter l’évaporation de l’eau et éviter la contamination.
- Mettez la boîte de Petri avec des mini-bioréacteurs sur un agitateur orbital. Cultivez les organoïdes à une vitesse de rotation de 70-75 tr / min.
- Le jour 16, préparez le milieu C (tableau 4).
- Transférer les organoïdes dans un tube de 15 mL. Pendant 5 min, laissez-les tomber au fond, aspirez le surnageant, ajoutez 5 mL de milieu C. Retournez les organoïdes dans les mini-bioréacteurs.
REMARQUE: Veillez à ne pas perdre les sphéroïdes, qui sont transparents et à peine visibles. - Cultivez les sphéroïdes en C moyen pendant deux semaines, en rafraîchissant le milieu tous les deux jours. À la fin de ces deux semaines, laissez environ 100 sphéroïdes par mini bioréacteur pour la culture suivante. Congeler les sphéroïdes excessifs dans un milieu de congélation dans de l’azote liquide.
- Le jour 30, préparez le milieu D (Tableau 5).
- Changez le milieu de culture en milieu D, qui est un milieu de maturation. Rafraîchir le milieu de culture tous les 2-3 jours pendant trois semaines, puis utiliser le milieu D sans BDNF et GDNF.
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Representative Results
Le schéma de protocole est illustré à la figure 1. Le protocole comprenait cinq milieux dans lesquels les CSPe se différenciaient en organoïdes cérébraux pendant au moins un mois. La différenciation a commencé puis les CSPe ont atteint la confluence de 75 à 90 %(Figure 2A,B). Les premiers signes de différenciation vers les neurones ont été observés aux jours 10 à 11 de la culture de l’iPSC dans le milieu A lorsque les cellules ont commencé à se regrouper en « rosettes »(Figure 2C). Aux jours 14-15, les CSPi se différencient en progéniteurs neuroépithéliaux. 99 % des cellules étaient positives au marqueur neuroépithélial SOX1 et n’exprimaient pas les marqueurs cellulaires pluripotents TRA-1-81 et OCT4(figure supplémentaire S1). Nous avons ensuite récolté les cellules à l’aide d’une solution contenant de l’EDTA et les avons transférées dans le milieu B sur une plaque de culture spéciale de 24 puits avec des micropuits(Figure 2D). Les cellules immédiatement après le transfert dans des micropuits, comme le montre la figure 2E. Chaque micropuit favorisait l’agrégation des cellules en un seul sphéroïde. Les sphéroïdes de tous les micropuits étaient de la même taille et contenaient environ 100 cellules(Figure 2J). Après la formation des sphéroïdes, ils ont été recouverts d’une matrice fraîchement décongelée et transférés en milieu C dans des mini-bioréacteurs faits maison(Figure 2H). Les mini-bioréacteurs ont été tournés sur un agitateur orbital à une vitesse de 70-75 tr / min. Les sphéroïdes se sont différenciés en organoïdes cérébraux, qui ont tous grandi uniformément, et la morphogenèse s’est déroulée de manière identique dans tous les organoïdes.
Les organoïdes ont grandi au cours des trois premiers mois, puis leur croissance a ralenti et s’est finalement arrêtée. La taille maximale des organoïdes cérébraux cultivés pendant six mois était d’environ 6 mm. Les organoïdes plus gros avaient une zone centrale lâche, souvent avec des cavités ou des zones nécrotiques (Figure 3). La coloration immunohistochimique des cryosections d’organoïdes à d45 de différenciation a révélé de grands amas de cellules SOX2 positives, indiquant des neurones immatures (Figure 4B). Les organoïdes âgés de deux mois ont exprimé des marqueurs neuronaux et gliaux, tels que la tyrosine hydroxylase (TH), PAX6, bêta-III-tubuline (TUBB3), MAP2 et les protéines GFAP(Figure 4A,4Cet 4D). Le temps de culture maximal pour les organoïdes de haute qualité était d’environ ~ 7 mois.
Ainsi, la formation de sphéroïdes de taille identique suivie de la culture dans des conditions dynamiques dans des mini-bioréacteurs aboutit à des organoïdes de taille standard développés par morphogenèse identique.
Figure 1: Les principales étapes du protocole. Au début, les CSI sont cultivées dans un milieu commercial pour les cellules souches pluripotentes jusqu’à 70-95% de confluence. L’étape suivante du protocole se compose de deux étapes. Tout d’abord, pendant 1-2 jours, le milieu des cellules souches pluripotentes est changé en milieu A-SR. Deuxièmement, les cellules sont cultivées dans le milieu A pendant deux semaines. Lors de la formation de rosettes de cellules neuroépithéliales, les cellules sont transférées dans la plaque de culture avec des micropuits avec un milieu B pour former des sphéroïdes. Le lendemain, les sphéroïdes obtenus sont transférés dans des mini bioréacteurs avec le milieu C. La maturation ultérieure des organoïdes se déroule dans le milieu D. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Les structures morphologiques clés observées au microscope lors de l’exécution du protocole. (A) Les CS IPS dans la faible confluence, insuffisantes pour le début de la différenciation. (B) Les IPSC dans la confluence, aptes à lancer la différenciation. (C). Les grappes de progéniteurs neuroépithéliaux, appelés rosettes avant la récolte. (D) Les micropuits vides au fond de la plaque de culture. (E) Les cellules juste après l’ensemencement dans la plaque de culture avec des micropuits. (F) Après une incubation d’une nuit, les cellules s’agrègent dans le sphéroïde dans chaque micropuit. (J). Le sphéroïde de bonne qualité. H. Les sphéroïdes après revêtement matriciel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Coloration des organoïdes à l’hématoxyline-éosine. (A-D) Organoïdes normaux avec la zone centrale dense. (E) Organoïde avec une cavité bordée d’épithélium. (F) L’organoïde avec la zone centrale nécrotique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Coloration immunohistochimique des organoïdes. Les organoïdes avaient des grappes de cellules exprimant des marqueurs de progéniteurs neuronaux (SOX2, B) et de cellules neurales (TH, PAX6, A; TUBB3, C; GFAP, MAP2, D). DAPI a été utilisé pour colorer l’ADN nucléaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Composants pour A-SR moyen | Concentration |
| Milieu DMEM/F12 | additionner jusqu’à 100% |
| Remplacement du sérum | 1% |
| Supplément N2 | 1% |
| Supplément neuronal B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamine | 2 mM |
| β-mercaptoéthanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorphine | 3 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Solution de pénicilline-streptomycine | 1x |
Tableau 1 : Composition du milieu A-SR.
| Composants pour moyen A | Concentration |
| Milieu DMEM/F12 | additionner jusqu’à 100% |
| Supplément N2 | 1% |
| Supplément neuronal B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamine | 2 mM |
| β-mercaptoéthanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorphine | 3 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Solution de pénicilline-streptomycine | 1x |
Tableau 2 : Composition du milieu A.
| Composants pour le milieu B | Concentration |
| Milieu DMEM/F12 | additionner jusqu’à 100% |
| Supplément N2 | 1% |
| β-mercaptoéthanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Y-27632 | 5 μM |
| Dorsomorphine | 5 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Solution de pénicilline-streptomycine | 1x |
Tableau 3 : Composition du milieu B.
| Composants pour C moyen | Concentration |
| Milieu DMEM/F12 | additionner jusqu’à 100% |
| Supplément N2 | 1% |
| Supplément neuronal B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamine | 2 mM |
| β-mercaptoéthanol | 50 μM |
| Purmorphamine | 3 μM |
| bFGF | 10 ng/mL |
| Solution de pénicilline-streptomycine | 1x |
Tableau 4 : Composition du milieu A.
| Composants pour moyen D | Concentration |
| Milieu basal pour le maintien des cellules neuronales | additionner jusqu’à 100% |
| Supplément neuronal B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamine | 2 mM |
| β-mercaptoéthanol | 50 μM |
| BdNF | 20 ng/mL |
| Le GDNF | 20 ng/mL |
| Solution de pénicilline-streptomycine | 1x |
Tableau 5: Composition du milieu D.
Figure supplémentaire S1 : À d14 de la différenciation, la pureté de la population cellulaire a été évaluée à l’aide de la cytométrie en flux et de la RT-PCR. (A) Plus de 98% des cellules ont perdu un marqueur de pluripotence TRA-1-81. (B) La plupart des cellules (>99%) présentaient un marqueur neuroépithélial SOX1. (C) L’expression du gène POU5F1 codant pour un facteur de pluripotence clé OCT4 a considérablement diminué dans trois lignées iPSC différentes (IPSRG2L, IPSPDL2.15L, IPSPDP1.5L). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le protocole décrit comporte deux étapes cruciales permettant la génération d’organoïdes de haute qualité de taille uniforme. Tout d’abord, les organoïdes se développent à partir de sphéroïdes qui sont presque identiques en nombre de cellules et en maturité cellulaire. Deuxièmement, les bioréacteurs faits maison fournissent à chaque organoïde un environnement uniforme, où les organoïdes ne s’encombrent pas ou ne collent pas ensemble.
La qualité cellulaire et l’état de maturation cellulaire sont essentiels pour effectuer le protocole. Il est essentiel de commencer la différenciation neuronale à une confluence de 75 à 90% des CSPe. Si la densité cellulaire est trop faible, les CSPic peuvent se différencier en directions non neuronales. Il est important de ne pas dépasser deux semaines d’induction neuronale des CSPi, car les progéniteurs neuronaux deviennent plus vulnérables par la suite. Au cours de la différenciation, les cellules et les organoïdes doivent être régulièrement alimentés en milieu frais, car la famine entraîne une forte baisse de la qualité organoïde. Seules les pauses à court terme sont autorisées dans la culture dynamique.
Certaines modifications du protocole sont autorisées. Toute matière biologique inerte peut être appliquée pour fabriquer un bouton dans la partie centrale du mini bioréacteur: fluoroplastique, polyéthylène, polypropylène. Si une boîte de Petri pour la microbiologie est utilisée pour préparer le plastique liquide, les mini-bioréacteurs résultants doivent être vérifiés pour la cytotoxicité neuronale. Les boîtes de Petri de différents diamètres peuvent servir de base au bioréacteur. Cependant, l’ajustement de la vitesse de rotation est alors nécessaire. En outre, la vitesse de rotation doit être ajustée si le volume du support est modifié. Par exemple, pour 8 mL du milieu dans une boîte de Petri de 6 cm, la vitesse optimale est de 70-75 tr / min.
La recette du milieu peut être reformulée pour obtenir des organoïdes cérébraux plus matures ou des organoïdes spécifiques à différentes régions du cerveau20. En outre, la plaque de culture avec des micropuits convient à la formation de sphéroïdes complexes. Par exemple, il est possible de mélanger des progéniteurs neuronaux avec des progéniteurs endothéliaux pour recevoir un organoïde cérébral vascularisé21. D’autres dérivés iPSC peuvent également être agrégés en sphéroïdes dans une plaque de culture avec des micropuits pour obtenir d’autres organoïdes : chondrosphères22,organoïdes intestinaux23,etc.
Le protocole exige un changement de milieu tous les 2-3 jours pendant la maturation organoïde, ce qui peut prendre la moitié de l’année. Il convient donc de prendre des précautions particulières lors de l’utilisation de techniques stériles. Il est permis d’utiliser la dose prophylactique d’antimicrobiens pour la prévention de l’infection à mycoplasmes.
La limitation du protocole découle de la diffusion limitée de l’oxygène et des nutriments au centre des grands organoïdes. La plupart des protocoles actuels pour la génération d’organoïdes souffrent de ce problème24. Dans nos conditions, la croissance s’arrête puis l’organoïde atteint 6 mm. Les organoïdes de plus grande taille ont développé une zone nécrotique au centre. Probablement, ce problème peut être résolu en utilisant la vascularisation21 ou l’hyperoxygénation25.
En comparaison avec d’autres bioréacteurs, les mini-bioréacteurs faits maison présentent des avantages apparents en termes de coût et d’abordabilité. De plus, ils sont petits. Nous pouvons conserver plusieurs dizaines de bioréacteurs faits maison sur un agitateur orbital dans l’incubateur. Il est impossible de maintenir ces nombreux bioréacteurs dans l’incubateur lors de l’utilisation de bioréacteurs agités.
En conclusion, le protocole présenté est utile pour les études biomédicales et pharmacologiques où la modélisation in vitro du cerveau humain est nécessaire. Nous croyons qu’en variant la composition des milieux de différenciation, il est possible d’obtenir des organoïdes cérébraux de différentes régions du cerveau et de différents degrés de maturité. De plus, l’utilisation de mini-bioréacteurs ne se limite probablement pas à la différenciation neuronale et, si le protocole est modifié, ils peuvent également être utilisés pour établir d’autres organoïdes à partir de cellules souches pluripotentes ou adultes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention 075-15-2019-1669 du ministère de la Science et de l’Enseignement supérieur de la Fédération de Russie (analyse RT-PCR) et par la subvention n ° 19-15-00425 de la Fondation russe pour la science (pour tous les autres travaux). Les auteurs remercient également Pavel Belikov pour son aide au montage vidéo. Les figures du manuscrit ont été créées avec BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
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