Summary
Aqui descrevemos um protocolo para a geração de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Para obter organoides cerebrais em grandes quantidades e de alta qualidade, usamos mini bioreatores caseiros.
Abstract
O organoide cerebral derivado do iPSC é uma tecnologia promissora para modelar in vitro as patologias do sistema nervoso e o rastreamento de drogas. Essa tecnologia surgiu recentemente. Ainda está em sua infância e ainda tem algumas limitações não resolvidas. Os protocolos atuais não permitem que a obtenção de organoides seja consistente o suficiente para a descoberta de drogas e estudos pré-clínicos. O amadurecimento dos organoides pode levar até um ano, pressionando os pesquisadores a lançar múltiplos processos de diferenciação simultaneamente. Impõe custos adicionais para o laboratório em termos de espaço e equipamentos. Além disso, organoides cerebrais geralmente têm uma zona necrosada no centro, que sofre de deficiência de nutrientes e oxigênio. Assim, a maioria dos protocolos atuais utiliza um sistema circulante para o meio cultural para melhorar a nutrição.
Enquanto isso, não há sistemas dinâmicos baratos ou bioreatores para o cultivo organoide. Este artigo descreve um protocolo para a produção de organoides cerebrais em minirepartores caseiros compactos e baratos. Este protocolo permite a obtenção de organoides de alta qualidade em grandes quantidades.
Introduction
Modelos derivados do iPSC humano são amplamente utilizados nos estudos de distúrbios neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativos1. Na última década, modelos de tecido cerebral 3D, os chamados organoides cerebrais, essencialmente complementaram as culturas neuronais 2D tradicionais2. Os organoides recapitulam até certo ponto a arquitetura 3D do cérebro embrionário e permitem uma modelagem mais precisa. Muitos protocolos são publicados para a geração de organoides representando diferentes regiões cerebrais: córtex cerebral3,4,5, cerebelo6, cérebro médio, cérebro, hipotálamo7,8,9e hipocampo10. Houve vários exemplos de uso de organoides para estudar doenças do sistema nervoso humano11. Além disso, os organoides foram implementados em descobertas de medicamentos12 e utilizados em estudos de doenças infecciosas, incluindo SARS-Cov-213,14.
Os organoides cerebrais podem atingir até vários milímetros de diâmetro. Assim, a zona interna do organoide pode sofrer de hipóxia ou desnutrição e eventualmente se tornar necrosada. Portanto, muitos protocolos incluem bioreatores especiais8,shakers ou sistemas microfluidos15. Esses dispositivos podem exigir grandes volumes de mídia de cultura celular cara. Além disso, o custo desses equipamentos geralmente é alto. Alguns bioreatores consistem em muitas partes mecânicas que os tornam difíceis de esterilizar para reutilização.
A maioria dos protocolos sofre do "efeito lote"16, que gera variabilidade significativa entre organoides obtidos a partir de iPSCs idênticos. Essa variabilidade dificulta o teste de drogas ou estudos pré-clínicos que requerem uniformidade. O alto rendimento de organoides suficientes para selecionar organoides de tamanho uniforme pode resolver parcialmente este problema.
O fator tempo também é um problema significativo. Matsui et al. (2018) mostraram que os organoides cerebrais requerem pelo menos seis meses para atingir a maturidade17. Trujillo et al. (2019) também demonstraram que a atividade eletrofisiológica ocorreu apenas em organoides após seis meses de cultivo18. Devido ao longo tempo de maturação organoide, os pesquisadores frequentemente lançam uma nova diferenciação antes de completar a anterior. Múltiplos processos paralelos de diferenciação exigem despesas adicionais, equipamentos e espaço de laboratório.
Recentemente desenvolvemos um mini bioreator que resolve principalmente os problemas mencionados acimade 19. Este bioreator caseiro consiste em uma placa de Petri ultra-baixa ou não tratada com um botão plástico no centro. Este botão plástico evita a aglomeração de organoides e sua conglutinação no centro da placa de Petri, que é causada pela rotação do agitador. Este artigo descreve como este mini bioreator caseiro barato e simples permite gerar organoides cerebrais de alta qualidade em grandes quantidades.
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Protocol
NOTA : Utilize técnica estéril em todo o protocolo, excluindo as etapas 1.2 e 1.3. Aqueça todos os meios de cultura e soluções a 37 °C antes de aplicar em células ou organoides. Cultivar células em uma incubadora de CO2 a 37 °C em 5% de CO2 em 80% de umidade. O esquema de protocolo é mostrado na Figura 1.
1. Transformando placas de Petri em mini bioreatores
- Corte tubos de centrífugas estéreis de 15 mL em anéis de 7-8 mm de altura; autoclave os anéis.
- Quebre a baixa adesão, placas de Petri não tratadas ou microbiológicas em migalhas. Dissolva cerca de 1 g de migalhas plásticas em 10 mL de clorofórmio durante a noite para preparar plástico líquido.
ATENÇÃO: Trabalhe em um capô de fumaça. - Verifique se o plástico líquido resultante é viscoso o suficiente para a pipetação; sua queda retém uma forma esférica e não se espalha na superfície. Se for muito líquido, adicione mais migalhas de plástico. Se for grosso, adicione clorofórmio.
- Faça um botão de plástico no centro de uma placa de Petri ultra-baixa estéril de 6 cm. Existem duas maneiras igualmente adequadas, conforme detalhado abaixo.
- Coloque o anel de plástico autoclavado no centro e solte o plástico líquido no interior do anel.
- Sem nenhum anel de plástico, deixe cair o plástico líquido no centro da placa de Petri.
- Deixe os pratos abertos por 2-3 h em uma capa de fluxo laminar até que sequem completas. Trate os pratos secos com radiação ultravioleta por 15-20 min.
2. Indução da diferenciação neuronal dos iPSCs
- Cultivar iPSCs no meio para células-tronco pluripotentes até 75-90% de confluência em placas de Petri de 35 mm pré-revestidas com uma matriz composta por proteínas extracelulares.
- Prepare o meio A-SR. Consulte a Tabela 1 para obter detalhes.
- Aspire o meio de cultivo e adicione 2 mL de meio A-SR no dia 0 de diferenciação.
- Prepare o meio A (ver Tabela 2).
- Cultivar células em média A por duas semanas entre os dias 2 e 14, meio refrescante em pratos petri a cada dois dias.
3. A formação de esferoides a partir de células precursoras neuroepiteliais no dia 14
- No dia 14, faça esferoides a partir de células precursoras neuroepiteliais usando uma placa de cultura especial de 24 poços contendo aproximadamente 1.200 microwells em cada poço(Figura 2C). Acompanhe o procedimento abaixo.
NOTA: Nesta fase de diferenciação, uma placa de Petri de 35 mm geralmente contém 3 - 3,5 x 106 células precursoras neuroepitheliais. Assim, uma placa de Petri de 35 mm com células precursoras neuroepitenelianas é suficiente para 3 - 4 poços de placa de cultura de 24 poços com microwells. - Prepare uma placa de cultura de 24 poços com microwells: Para cada poço, adicione 1 mL de média A. Centrífuga brevemente a 1.300 x g por 5 min em rotor de balde balançando equipado com porta-placas. Controle sob o microscópio que não há bolhas em microwells.
- Prepare o meio B (Tabela 3).
- Remover o meio da placa de Petri com células precursoras neuroefitelais; lavar as células com 2 mL de DMEM/F12. Para o descolamento celular, trate as células com 1,5 mL de solução EDTA de 0,48 mM preparada em PBS. Controle o desprendimento celular sob o microscópio.
- Colhe as células em um tubo de 15 mL. Adicione 5 mL de DMEM/F12 no tubo para lavar as células. Centrifugar a 200 x g por 5 min. Remova as células supernascidas e resuspendes em 2 mL de média B.
- Verifique a concentração e viabilidade celular por staining Trypan Blue e um hemócitometro. Calcule o volume de suspensão necessário para conter 1 x 106 células viáveis no total.
- Transfira a suspensão celular contendo 1 x 106 células em cada poço de uma placa de 24 poços com microwells. Adicione b médio até 2 mL em cada poço, células de pipeta suavemente para cima e para baixo várias vezes, e centrífuga brevemente 100 x g por 1 min para capturar células nos microwells.
NOTA: O número de células por poço não deve exceder 1 x 106. Caso contrário, esferoides de microwells vizinhos se fundem. - Verifique sob o microscópio que as células são distribuídas uniformemente em microwells. Reincidente a pipetação e a centrifugação se as células forem distribuídas de forma irregular.
- Incubar a placa durante a noite para permitir que as células se acumulem em esferoides.
4. Obtenção e cultivo de organoides
- Na manhã seguinte (dia 15), verifique a qualidade dos esferoides sob o microscópio. Certifique-se de que são transparentes e suaves, se saudáveis(Figura 2A,B). Colete cuidadosamente os esferoides de cada poço em um tubo de 15 mL, deixe os esferoides precipitarem pela gravidade por 2-3 minutos e, em seguida, remova o sobrenante.
- Adicione aos esferoides 2 mL da matriz descongelada durante o mesmo tempo no gelo. Misture suavemente por pipetar e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.
- Para lavar o excesso da matriz, adicione ao tubo 8 mL de B médio. Pipeta suavemente, em seguida, centrifugar o tubo por 1 min a 100 x g.
NOTA: Não exceda o tempo e a velocidade da centrifugação para evitar a agregação irreversível de esferoides. - Remova o supernatante. Adicione ao tubo 2 mL de B médio, pipeta suavemente. Divida a suspensão esferoide entre dois mini bioreatores, cada um contendo 4 mL de médio B. Coloque os mini bioreatores em uma placa de Petri de 15 cm para evitar a evaporação da água e para evitar contaminação.
- Coloque a placa de Petri com mini bioreatores em um agitador orbital. Cultive os organoides a uma taxa de rotação de 70-75 rpm.
- No dia 16, prepare o meio C (Tabela 4).
- Transfira os organoides para tubo de 15 mL. Por 5 min, deixe-os cair para o fundo, aspirar o supernante, adicionar 5 mL de C médio. Devolva os organoides para os mini bioreatores.
NOTA: Tenha cuidado para não perder os esferoides, que são transparentes e pouco visíveis. - Cultivar esferoides em C médio por duas semanas, refrescando o meio a cada dois dias. Ao final dessas duas semanas, deixe cerca de 100 esferoides por mini bioreator para o cultivo seguinte. Congele eferóides excessivos em um meio de congelamento em nitrogênio líquido.
- No dia 30, prepare o meio D (Tabela 5).
- Mude o cultivo médio para médio D, que é um meio de maturação. Atualize o meio de cultivo a cada 2-3 dias durante três semanas e use o médio D sem BDNF e GDNF.
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Representative Results
O esquema de protocolo é mostrado na Figura 1. O protocolo incluiu cinco mídias nas quais os iPSCs se diferenciaram em organoides cerebrais durante pelo menos um mês. A diferenciação foi iniciada, então os iPSCs atingiram a confluência de 75-90% (Figura 2A,B). Os primeiros sinais de diferenciação em relação aos neurônios foram observados nos dias 10-11 do cultivo do iPSC no médio A, quando as células começaram a se agrupar em "rosetas"(Figura 2C). Nos dias 14-15, iPSCs diferenciados em progenitores neuroepiteliois. 99% das células foram positivas no marcador neuroepiteliol SOX1 e não expressaram marcadores celulares pluripotentes TRA-1-81 e OCT4(Figura Suplementar S1). Em seguida, colhemos as células usando a solução contendo EDTA e as transferimos em média B para uma placa de cultura especial de 24 poços com microwells(Figura 2D). As células imediatamente após a transferência para microwells, como mostrado na Figura 2E. Cada microwell promoveu a agregação de células em um único esferoide. Os esferoides de todas as micro-habitas tinham o mesmo tamanho e continham cerca de 100 células(Figura 2J). Após a formação de esferoides, foram revestidos com matriz recém-descongelada e transferidos em C médio para mini bioreatores caseiros(Figura 2H). Os mini bioreatores foram girados em um agitador orbital à taxa de 70-75 rpm. Os esferoides se diferenciaram em organoides cerebrais, que cresceram uniformemente, e a morfogênese prosseguiu de forma idêntica em todos os organoides.
Os organoides cresceram durante os primeiros três meses, então seu crescimento desacelerou e acabou parando. O tamanho máximo de organoides cerebrais cultivados por seis meses foi de cerca de 6 mm. Organoides maiores tinham uma zona central solta, muitas vezes com cavidades ou áreas necróticas(Figura 3). A coloração imunohistoquímica das crioseções de organoides em d45 de diferenciação revelou grandes aglomerados de células SOX2 positivas, indicando neurônios imaturos(Figura 4B). Os organoides de dois meses de idade expressaram marcadores neuronais e gliais, como as proteínas tyrosine hydroxylase (TH), PAX6, beta-III-tubulin (TUBB3), MAP2 e GFAP(Figura 4A,4Ce 4D). O tempo máximo de cultivo para organoides de alta qualidade foi de cerca de ~7 meses.
Assim, a formação de esferoides de tamanho idêntico seguido pelo cultivo em condições dinâmicas em mini bioreatores resulta em organoides de tamanho padrão desenvolvidos através de morfogênese idêntica.
Figura 1: Os principais estágios do protocolo. No início, os iPSCs são cultivados em um meio comercial para células-tronco pluripotentes até 70-95% de confluência. A próxima etapa do protocolo consiste em dois passos. Primeiro, durante 1-2 dias, o meio para células-tronco pluripotentes é alterado para médio A-SR. Segundo, as células são cultivadas no meio A por duas semanas. Ao formar rosetas de células neuroepiteliais, as células são transferidas para a placa de cultura com microwells com média B para formar esferoides. No dia seguinte, os esferoides obtidos são transferidos para mini bioreatores com o médio C. A maturação adicional dos organoides prossegue no meio D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: As principais estruturas morfológicas observadas sob o microscópio durante a execução do protocolo. (A) Os iPSCs na baixa confluência, insuficientes para o início da diferenciação. (B) Os iPSCs na confluência, adequados para a diferenciação de lançamento. (C) Os aglomerados de progenitores neuroepiteliois, as chamadas rosetas antes da colheita. (D) As micro-habitações vazias na parte inferior da placa de cultura. (E) As células logo após a semeadura em placa de cultura com microwells. (F) Após a incubação durante a noite, as células se agregam no esferoide em cada microwell. (J). O esferoide de boa qualidade. H. Os esferoides após o revestimento da matriz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Mancha de hematoxilina-eosina de organoides. (A-D) Organoides normais com a densa zona central. (E) O organoide com uma cavidade forrada por epitélio. (F)O organoide com a zona central necrosada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Mancha imunohistoquímica de organoides. Os organoides tinham aglomerados de células expressando marcadores de progenitores neurais (SOX2, B) e células neurais (TH, PAX6, A; TUBB3, C; GFAP, MAP2, D). Dapi foi usado para manchar DNA nuclear. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componentes para médio A-SR | Concentração |
| Meio DMEM/F12 | somar até 100% |
| Substituição de soro | 1% |
| Suplemento N2 | 1% |
| Suplemento neuronal B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamina | 2 mM |
| β-Mercaptoetanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorphin | 3 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Solução penicilina-estreptomicina | 1x |
Tabela 1: Composição do médio A-SR.
| Componentes para médio A | Concentração |
| Meio DMEM/F12 | somar até 100% |
| Suplemento N2 | 1% |
| Suplemento neuronal B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamina | 2 mM |
| β-Mercaptoetanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorphin | 3 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Solução penicilina-estreptomicina | 1x |
Tabela 2: Composição do médio A.
| Componentes para médio B | Concentração |
| Meio DMEM/F12 | somar até 100% |
| Suplemento N2 | 1% |
| β-Mercaptoetanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Y-27632 | 5 μM |
| Dorsomorphin | 5 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Solução penicilina-estreptomicina | 1x |
Tabela 3: Composição do médio B.
| Componentes para médio C | Concentração |
| Meio DMEM/F12 | somar até 100% |
| Suplemento N2 | 1% |
| Suplemento neuronal B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamina | 2 mM |
| β-Mercaptoetanol | 50 μM |
| Purmorphamina | 3 μM |
| bFGF | 10 ng/mL |
| Solução penicilina-estreptomicina | 1x |
Tabela 4: Composição do médio A.
| Componentes para médio D | Concentração |
| Meio basal para manutenção de células neuronais | somar até 100% |
| Suplemento neuronal B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamina | 2 mM |
| β-Mercaptoetanol | 50 μM |
| BDNF | 20 ng/mL |
| GDNF | 20 ng/mL |
| Solução penicilina-estreptomicina | 1x |
Tabela 5: Composição do médio D.
Figura suplementar S1: Na d14 da diferenciação, a pureza da população celular foi avaliada por meio de citometria de fluxo e RT-PCR. (A) Mais de 98% das células perderam um marcador de pluripotência TRA-1-81. (B) A maioria das células (>99%) apresentava um marcador neuroepitetelial SOX1. (C) A expressão do gene POU5F1 codificando um fator-chave de pluripotência OCT4 diminuiu drasticamente em três linhas diferentes de iPSC (IPSRG2L, IPSPDL2.15L, IPSPDP1.5L). Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
O protocolo descrito tem duas etapas cruciais que permitem a geração de organoides de alta qualidade de tamanho uniforme. Primeiro, os organoides crescem a partir de esferoides que são quase idênticos no número celular e na maturidade celular. Em segundo lugar, os bioreatores caseiros fornecem a cada organoide um ambiente uniforme, onde organoides não se aglomeram ou se mantêm unidos.
A qualidade celular e o estado de maturação celular são essenciais para a execução do protocolo. É fundamental iniciar a diferenciação neuronal em 75-90% de confluência de iPSCs. Se a densidade celular for muito baixa, os iPSCs podem se diferenciar em direções não neuronais. É importante não exceder duas semanas de indução neuronal de iPSCs porque os progenitores neuronais mais tarde se tornam mais vulneráveis. Durante a diferenciação, as células e os organoides devem ser regularmente fornecidos com o meio fresco, pois a fome leva ao declínio acentuado da qualidade organoide. Apenas intervalos de curto prazo são permitidos no cultivo dinâmico.
Algumas modificações do protocolo são permitidas. Qualquer material biológico inerte pode ser aplicado para fazer um botão na parte central do mini bioreator: fluoroplásico, polietileno, polipropileno. Se uma placa de Petri para microbiologia é usada para preparar o plástico líquido, então os mini bioreatores resultantes devem ser verificados para citotoxicidade neuronal. As placas de Petri de diferentes diâmetros podem servir de base para o bioreator. No entanto, o ajuste da velocidade de rotação é necessário. Além disso, a velocidade de rotação precisa ser ajustada se o volume do meio for alterado. Por exemplo, para 8 mL do meio em uma placa de Petri de 6 cm, a velocidade ideal é de 70-75 rpm.
A receita do meio pode ser reformulada para obter organoides cerebrais mais maduros ou organoides específicos para diferentes regiões cerebrais20. Além disso, a placa de cultura com microwells é adequada para a formação de esferoides complexos. Por exemplo, é possível misturar progenitores neuronais com progenitores endoteliais para receber um organoide cerebral vascularizado21. Outros derivados iPSC também podem ser agregados em esferoides em uma placa de cultura com microwells para obter outros organoides: condrosferas22,organoides intestinais23,etc.
O protocolo requer mudança de meio a cada 2-3 dias durante a maturação organoide, o que pode levar metade do ano. Portanto, deve-se tomar cuidado especial ao usar técnicas estéreis. É permitido usar a dose profilática de antimicrobianos para a prevenção da infecção por micoplasma.
A limitação do protocolo decorre da difusão limitada de oxigênio e nutrientes no centro de grandes organoides. A maioria dos protocolos atuais para a geração organoide sofre desse problema24. Em nossas condições, o crescimento pára e o organoide atinge 6 mm. Os organoides de maior porte desenvolveram zona necrosada no centro. Provavelmente, esse problema pode ser resolvido usando vascularização21 ou hiperoxigenação25.
Em comparação com outros bioreatores, os mini bioreatores caseiros têm vantagens aparentes em termos de custo e acessibilidade. Além disso, são pequenos. Podemos manter várias dúzias de bioreatores caseiros em um agitador orbital na incubadora. É impossível manter esses muitos bioreatores na incubadora ao usar bioreatores mesxidos.
Em conclusão, o protocolo apresentado é útil para estudos biomédicos e farmacológicos onde a modelagem in vitro do cérebro humano é necessária. Acreditamos que, variando a composição da mídia de diferenciação, é possível obter organoides cerebrais de diferentes regiões cerebrais e diferentes graus de maturidade. Além disso, o uso de mini bioreatores provavelmente não se limita à diferenciação neural e, se o protocolo for modificado, eles também podem ser usados para estabelecer outros organoides de células-tronco pluripotentes ou adultas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela subvenção 075-15-2019-1669 do Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa (análise RT-PCR) e pela concessão nº 19-15-00425 da Fundação Russa de Ciência (para todos os outros trabalhos). Os autores também agradecem a Pavel Belikov por sua ajuda na edição de vídeo. Figuras do manuscrito foram criadas com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
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