Aquí, presentamos protocolos para detectar el óxido nítrico y sus derivados biológicamente relevantes utilizando ensayos basados en quimioluminiscencia con alta sensibilidad.
Artículo de método
Aquí, presentamos protocolos para detectar el óxido nítrico y sus derivados biológicamente relevantes utilizando ensayos basados en quimioluminiscencia con alta sensibilidad.
La actividad del óxido nítrico (NO) in vivo es el resultado combinado de sus efectos directos, la acción de sus derivados generados a partir de la autoxidación del NO y los efectos de los compuestos nitrosados. La medición de los metabolitos de NO es esencial para estudiar la actividad del NO tanto a nivel vascular como en otros tejidos, especialmente en los entornos experimentales donde se administra NO exógeno. Los ensayos de quimioluminiscencia a base de ozono permiten mediciones precisas de metabolitos de NO y NO tanto en fluidos (incluidos plasma, homogeneizados de tejidos, cultivos celulares) como en mezclas de gases (por ejemplo, aliento exhalado). El NO reacciona con el ozono para generar dióxido de nitrógeno en un estado excitado. La consiguiente emisión de luz permite la fotodetección y la generación de una señal eléctrica que refleje el contenido de NO de la muestra. Las alícuotas de la misma muestra se pueden usar para medir metabolitos específicos de NO, como nitrato, nitrito, S-nitrosotioles y complejos hierro-nitrosil. Además, el NO consumido por la hemoglobina libre de células también se cuantifica con el análisis de quimioluminiscencia. Se proporciona una ilustración de todas estas técnicas.
Desde que Salvador Moncada y los premios Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro y Ferid Murad identificaron el óxido nítrico (NO) como el factor de relajación derivado del endotelial (EDRF) previamente conocido, el papel central del NO se ha establecido en varios mecanismos clave que abarcan toda la biología vascular, las neurociencias, el metabolismo y la respuesta del huésped 1,2,3,4,5,6,7 . La administración exógena de NO gas se ha con....
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Los procedimientos indicados en este protocolo están de acuerdo con la junta de revisión del Hospital General de Massachusetts. Las muestras de sangre que se utilizaron habían sido recogidas durante un estudio previo y fueron desidentificadas para el propósito actual18.
NOTA: Consulte las instrucciones del fabricante para obtener orientación específica sobre las conexiones óptimas entre los tubos y la cristalería que constituyen el recipiente de purga, el lavado y el mantenimiento general. Las conexiones deben ser firmes y cuidadosamente hechas para no dañar la cristalería. Identifique los componentes del recipiente ....
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El consumo de NO por el ensayo de Hb libre de células se utilizó en muestras que contenían concentraciones conocidas de oxyHb libre de células (Figura 4). Como un hemo de oxyHb libera estequiométricamente una molécula de NO en el ensayo, se utiliza oxyHb libre de células purificadas para construir la curva de calibración para el ensayo (Figura suplementaria 3).
La relación dosis-respuesta entre la Hb libre de células (medida con un ensayo colorimé.......
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Debido a la alta sensibilidad, los ensayos basados en quimioluminiscencia para la determinación de NO y compuestos relacionados tienen un alto riesgo de contaminación por NO2. Cada reactivo (especialmente la solución de bloqueo de NO2) y diluyente (incluido ddH2O) utilizado en el experimento debe probarse por su contenido de NO2- para corregir la señal de fondo. El nitrito es extremadamente reactivo con una vida media en sangre total alrededor d.......
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L.B. recibe apoyo salarial de K23 HL128882 / NHLBI NIH como investigador principal por su trabajo en hemólisis y óxido nítrico. LB recibe subvenciones de "Fast Grants for COVID-19 research" en el Mercatus Center de la Universidad George Mason y de iNO Therapeutics LLC. B.Y. cuenta con el apoyo de subvenciones de un NHLBI / #R21HL130956 y DOD / The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. recibió patentes en MGH sobre la generación eléctrica de óxido nítrico.
L.B. y B.Y. han presentado una solicitud de patente para la NO entrega en la enfermedad COVID-19 Número de solicitud PCT: PCT/US2021/036269 presentada el 7 de junio de 2021. RWC recibe apoyo salarial de Unitaid como investigador principal para el desarrollo de tecnología destinada al diagnóstico descentralizado de la tuberculosis en niños ubicados en entornos de bajos recursos.
Los protocolos reportados en este manuscrito fueron posibles gracias a las contribuciones acumuladas de becarios anteriores del laboratorio de Investigación de Anestesia en Cuidados Críticos del Dr. Warren Zapol, Departamento de Anestesia del Hospital General de Massachusetts. Reconocemos la contribución de los Dres. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli y Emanuele Rezoagli.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido Acético | Sigma | 45754 | 500 mL - líquido |
| Emulsión Antiespumante B Sigma | A5757 | 250 mL - líquido | |
| DETA NONOate | Cayman | 82120 | 10 mg |
| Gibco DPBS (1x) sin calcio, sin magnesio | ThermoFisher | 14190144 | 500 mL |
| Ácido Clorhídrico 37% (1 M) | Sigma | 258148 | 500 mL - líquido |
| Yodo | SAFC 207772 | 100 g - sólido | |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | |
| Cloruro de mercurio (II) Reactivo ACS> 99,5% | Sigma | 215465 | 100 g - sólido (disuelto en agua) |
| Sistema de purificación de agua Mili-Q | Millipore | ||
| Modelo 705 RN 50 μ Jeringa L | Hamilton | 80530 | Jeringa de microlitros |
| Modelo 802 N 25 μ L Jeringa | Hamilton | 84854 | Jeringa de microlitros |
| N-etilmaleimida Sigma | 4260 | 25 g - cristalino | |
| Analizador de óxido nítrico + Bundle Software - Recipiente de purga | Zysense | NOA 280i | Detector de quimioluminiscencia |
| Nonidet p-40 (NP-40) | ThermoFisher | 85125 | 10% - 500 mL |
| de hexacianoferrato de potasio (III) reactivo ACS≥ 99% | Sigma | 244023 | 100 g - polvo |
| Reactivo ACS de yoduro de potasio> 99% | Sigma | 221945 | 100 g - sólido |
| Nitrito de potasio cryst. Para análisis EMSURE ACS | Supelco | 105067 250 g - cristalino | |
| PowerGen 125 | Fisher Scientific | 14-359-251 | Homogeneizador mecánico |
| RV3 Bomba de paletas rotativas de dos etapas | Bomba de vacío Edwards | A65201906 | Incluido con analizador |
| Heparina de sodio - BD Hemogard Clo | BD Biosciences | BD367871 | 75 unidades USP |
| Hidróxido de sodio anhidro Reactivo ACS ≥ 97% | Sigma | 795429 | 1 kg - pellets |
| Nitrato de sodio ACS reactivo ≥ 99% | Sigma | 221341 | 500 g - polvo |
| Nitrito de sodio ≥ 99% | Sigma | S2252 | 500 g - cristalino |
| Sulfanilamida ≥ 98% | Sigma | S9251 | 100 g - sólido |
| Cloruro de vanadio (III) | Sigma | 112393 25 g - sólido - Precaución (exotérmico) | |
| Whatman 1 Papel de Filtro | Sigma | WHA10010155 |
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