Demostramos cómo establecer un modelo murino de implantación de raíz pulmonar en la aorta descendente para simular el procedimiento de Ross. Este modelo permite la evaluación a medio/largo plazo de la remodelación del autoinjerto pulmonar en posición sistémica, representando la base del desarrollo de estrategias terapéuticas para promover su adaptación.
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Artículo de método
Un modelo de roedor de la operación ross: implantación singénica de injerto de arteria pulmonar en una posición sistémica
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Resumen
Resumen
La operación Ross para la enfermedad de la válvula aórtica ha recuperado un nuevo interés debido a sus excelentes resultados a largo plazo. No obstante, cuando se emplea como reemplazo radicular independiente, se describe la posible dilatación del autoinjerto pulmonar y la posterior regurgitación aórtica. Se han propuesto varios modelos animales. Sin embargo, estos generalmente se limitan a modelos ex-vivo o experimentos in vivo con modelos animales grandes relativamente caros. En este estudio, buscamos establecer un modelo de roedor de implantación de injerto de arteria pulmonar (PAG) en posición sistémica. Se incluyeron un total de 39 ratas Lewis adultas. Inmediatamente después de la eutanasia, la raíz pulmonar fue cosechada de un animal donante (n = 17). Las ratas receptoras singénicas (n = 17) y operadas simuladamente (n = 5) fueron sedadas y ventiladas. En el grupo receptor, el PAG fue implantado con una anastomosis de extremo a extremo en posición aórtica abdominal infrarrenal. Las ratas operadas simuladamente se sometieron solo a transección y reanastomosis de la aorta. Los animales fueron seguidos con estudios de ultrasonido en serie durante dos meses y análisis histológico post mortem. El diámetro medio del PAG en la posición nativa fue de 3,20 mm (IQR=3,18-3,23). En el seguimiento, el diámetro medio del PAG fue de 4,03 mm (IQR=3,74-4,13) a la semana 1, 4,07 mm (IQR=3,80-4,28) a 1 mes, y 4,27 mm (IQR=3,90-4,35) a los 2 meses (p<0,01). La velocidad sistólica máxima fue de 220,07 mm/s (IQR=210,43-246,41) a 1 semana, 430,88 mm/s (IQR=375,28-495,56) a 1 mes, y 373,68 mm/s (IQR=305,78-429,81) a los 2 meses (p=0,02) y no difirió del grupo operado simuladamente al final del experimento (p=0,5). El análisis histológico no mostró ningún signo de trombosis endotelial. Este estudio mostró que los modelos de roedores pueden permitir la evaluación de la adaptación a largo plazo de la raíz pulmonar a un sistema de alta presión. Un implante de PAG singénico colocado sistémicamente representa una plataforma simple y factible para el desarrollo y la evaluación de nuevas técnicas quirúrgicas y terapias farmacológicas para mejorar aún más los resultados de la operación de Ross.
Introducción
La estenosis congénita de la válvula aórtica es un subgrupo de cardiopatía congénita caracterizada por una obstrucción del tracto ventricular izquierdo en el que se localiza la lesión a nivel valvular. La malformación afecta aproximadamente a 0,04-0,38 por cada 1000 nacidos vivos1.
Las opciones disponibles para la corrección son muchas, cada una con sus propias ventajas y desventajas. Para los pacientes aptos para una corrección biventricular2, el abordaje puede estar dirigido a la reparación valvulolítica (valvulotomía percutánea o quirúrgica) o a su sustitución3. Este último se prefiere cuando la válvula aórtica se considera insalvable; sin embargo, las opciones disponibles son limitadas para los pacientes pediátricos. De hecho, las válvulas bioprotésicas no están indicadas para el reemplazo aórtico en la población joven debido a su calcificación temprana4. Por otro lado, la degeneración en las válvulas mecánicas es considerablemente más lenta, pero estas requieren terapia anticoagulante de por vida5. Además, la mayor limitación de estas prótesis está representada por la falta de potencial de crecimiento, lo que predispone a los pacientes a reintervenciones adicionales.
Una opción terapéutica interesante en la población pediátrica es la transferencia del autoinjerto pulmonar a la posición aórtica denominada "operación ross". En este caso, la válvula pulmonar se sustituye por un homoinjerto (Figura 1)6. Este procedimiento puede representar la mejor opción quirúrgica para los niños porque el autoinjerto pulmonar preserva su potencial de crecimiento y no conlleva los riesgos de la terapia anticoagulante de por vida. Además, el procedimiento de Ross puede ser de gran valor también en adultos jóvenes para evitar una válvula mecánica o biológica, teniendo el potencial de convertirse en la mejor solución quirúrgica.
Los resultados tras la sustitución de la válvula aórtica con autoinjerto pulmonar son excelentes, con una supervivencia superior al 98% y buenos resultados a largo plazo7. Los estudios bibliográficos reportan 93% y 90% de ausencia de reemplazo del homoinjerto pulmonar a los 4 y 12 años, respectivamente8.
La principal limitación de este procedimiento es la tendencia del autoinjerto a dilatarse a largo plazo, especialmente cuando se emplea como un reemplazo radicular independiente. Esto puede causar incompetencia valvular que puede requerir una nueva intervención. De hecho, el estudio de seguimiento más largo realizado hasta ahora reporta la ausencia de reoperación para el reemplazo de autoinjertos del 88% a los 10 años y del 75% a los 20 años9.
La posibilidad de recrear una operación de Ross en un entorno experimental representa un requisito previo fundamental para investigar el mecanismo subyacente de la adaptación del autoinjerto pulmonar a las presiones sistémicas. En el pasado se han propuesto varios modelos. Sin embargo, estos generalmente se limitan a experimentos ex vivo o modelos animales in vivo con animales grandes relativamente caros. En este estudio, buscamos establecer un modelo de roedor de implantación de injerto de arteria pulmonar (PAG) en posición sistémica, como raíz independiente.
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Protocolo
Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Padua (OPBA, número de protocolo n° 55/2017) y autorizados por el Ministerio de Salud italiano (Autorización n° 700/2018-PR), de conformidad con la Directiva de la Unión Europea 2010/63/UE y la Ley italiana 26/2014 para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Cuidado animal y modelo experimental
- Asegúrese de que todas las ratas Lewis se obtengan de una sola empresa (Tabla de materiales). Mantener a las ratas en instalaciones convencionales con libre acceso a alimentos y agua.
- Asegúrese de que el peso de las ratas oscile entre 320-400 g para el grupo receptor y 200-250 g para el grupo donante.
2. Protocolo preoperatorio
NOTA: Todas las operaciones deben realizarse en condiciones limpias. Utilice ratas Lewis adultas macho y hembra como receptoras y donantes también para realizar un trasplante singénico.
- Realizar una inyección intraperitoneal de tramadol (5 mg/kg) 15 min antes de la cirugía.
- Administrar una dosis única de gentamicina intramuscular (5 mg/kg) inmediatamente antes de la cirugía.
- Para la inducción de la anestesia, suministre sevoflurano al 4% en 1 L/min de oxígeno a una cámara de poli(metacrilato de metilo) donde se coloca el animal. Para el mantenimiento de la anestesia, use sevoflurano al 2.0-2.5% en 1 L/min de oxígeno durante todo el procedimiento.
- Afeite al animal a lo largo de la línea media durante 2 cm de ancho desde el esternón hasta 1 cm por encima del área genital con una maquinilla de afeitar. Luego, esterilice la piel con solución de yodo.
- Para evitar que el animal se moje y para evitar la dispersión del calor durante la cirugía, cubra al animal con una película de plástico transparente.
- Evalúe el nivel de anestesia antes de realizar el procedimiento evaluando la ausencia de respuesta a un estímulo nocivo.
3. Operación del donante
- Preparación animal y del corazón:
- Coloque el animal anestesiado en una bandeja de corcho con el lado caudal mirando hacia el cirujano. Realice una incisión xifopúbica de unos 5-6 cm y retraiga los dos colgajos musculocutáneos lateralmente.
- Administrar un volumen de 1 ml de solución salina a 4 °C que contenga 500 UI de heparina a través de la vena cava abdominal.
- Después de 1 min, corte el diafragma de izquierda a derecha y realice una toracotomía anterior para exponer el corazón.
- Enfríe el corazón que late goteando solución salina a 4 °C.
- Realizar una pericardiectomía y una timectomía con el fin de obtener una visión completa del arco aórtico. Retire los tejidos grasos restantes que rodean la aorta.
- Corte en el arco, justo encima del origen de la arteria innominada; corta este último, también.
- Cortar la vena cava inferior torácica (IVC) e insertar una cánula de 22 G para infundir el corazón con 20-25 ml de solución salina a 4 °C, ejerciendo una ligera presión. Suspenda la perfusión cuando el corazón deja de latir y el flujo de la aorta se vuelve claro.
- Explante PAG:
NOTA: Una cosecha precisa y un manejo delicado del PAG es obligatorio para lograr una implantación óptima en el receptor. No lo toque directamente con instrumentos, en su lugar use hisopos de algodón.- Realizar un estudio ecográfico para evaluar el diámetro de la AP en su posición nativa.
- Inserte un microalicate debajo de la pared posterior del recipiente y corte este último con una microjera lo más cerca posible de su bifurcación para maximizar la longitud del PAG.
- Sostenga suavemente el PA con las microfórceps de punta anillada y sepárelo del ventrículo derecho con las tijeras de microflujo. Cosecha el PAG, incluyendo algo de músculo ventricular derecho.
- Preparación PAG:
- Coloque el PAG en una gasa humedecida con solución salina fría en la mesa de operaciones e inspeccione el recipiente bajo el microscopio de operación.
- Corte cualquier tejido circundante abundante, dejando solo 1 mm de músculo ventricular. Fije la longitud del recipiente en 5 mm.
4. Implantación de injerto de arteria pulmonar (PAG)
- Preparación del animal receptor:
- Coloque el animal anestesiado en una bandeja de corcho con el lado caudal mirando hacia el cirujano.
- Realice una incisión longitudinal mediana y use dos mini retractores para mantener el abdomen abierto.
- Extraer los intestinos con dos hisopos de algodón y cubrirlos con una gasa empapada con solución salina a 39 °C permitiendo la visualización de la zona retroperitoneal con exposición de la aorta abdominal infrarrenal (AA).
NOTA: Durante la cirugía, es importante humedecer ocasionalmente los intestinos con una jeringa que contenga solución salina de 39 ° C para prevenir la hipotermia, una condición crítica común en roedores. - Elimine el peritoneo parietal posterior entre las dos arterias renales y la bifurcación ilíaca con dos hisopos de algodón y elimine el tejido graso alrededor del AA infrarrenal. Deje solo una pequeña porción de grasa por encima del AA, para facilitar el manejo en el recipiente.
- Separe el AA del IVC. Para realizar este procedimiento, primero, pase una pinza curva detrás de la pared aórtica posterior y úsela para abrir un pasaje entre el AA y el IVC. Luego, use una sutura de seda 2-0 para crear un bucle alrededor del AA, con el fin de levantar el recipiente y separar el AA del IVC. Ligar cualquier arteria lumbar que surja de la AA infrarrenal con sutura de seda 6/0 y dividirla.
- Gire el animal 90° en sentido contrario a las agujas del reloj, colocando la cabeza en el lado izquierdo del operador. El AA ahora se encuentra horizontalmente en el campo microscópico.
- Utilice dos clips Yasargil para sujetar el AA infrarrenal y colóquelos a una distancia de 1,5 cm entre sí. Transecte el AA en el punto medio entre los dos clips.
- Irrigar los dos extremos de los vasos con heparina (1 UI/ml) en solución salina para eliminar cualquier coágulo. Retire cualquier residuo adventicio de los vasos.
- Implantación PAG:
- Coloque el PAG entre los dos extremos, con el extremo ventricular hacia la porción craneal del animal.
- Use una sutura de polipropileno 10-0 para realizar dos puntos de sutura únicos que conectan el PG con el AA. Realice el procedimiento en ambos extremos del PAG colocando la sutura en lados opuestos de la circunferencia del vaso.
- Realizar una anastomosis de extremo a extremo entre PAG y AA, comenzando por el extremo distal. Use uno de los dos extremos de la sutura de punto de referencia distal para la anastomosis posterior utilizando una secuencia de receptor a injerto de entrada / entrada para realizar una sutura en ejecución de aproximadamente seis puntos de sutura.
- Una vez que la sutura alcanza el punto de referencia proximal, realice un doble medio enganche completado por un nudo cuadrado utilizando la sutura y uno de los dos extremos de la sutura de punto de referencia proximal. Aplique pinzas de mosquito con calzado de goma a las suturas para proporcionar tracción.
- Realizar la misma anastomosis en la pared anterior. Continúe todo el procedimiento en el extremo proximal del PAG. Preste especial atención al realizar la anastomosis proximal para evitar incluir cualquier folíolo en la línea de sutura.
- Suelte primero el clip distal para permitir que el PAG se llene con sangre retrógrada (flujo de baja presión) para controlar la anastomosis. Repare cualquier fuga de sangre con una sola sutura. Una vez evaluada la anastomosis distal, realizar el mismo procedimiento en el extremo proximal.
- Etapas finales de la operación en el destinatario:
- Evalúe la permeabilidad del PAG y aplique dos tiras de esponja de gelatina sobre las líneas de sutura a ambos lados del PAG (si es necesario). Ejerza una presión suave durante unos segundos con dos hisopos de algodón para ayudar a la hemostasia.
- Reubique los intestinos en la cavidad abdominal y cierre las paredes con una sutura de polipropileno 4/0.
5. Procedimiento operado simuladamente
- Realice una preparación idéntica del animal como se ilustró anteriormente para las ratas receptoras.
- Cortar el AA infrarrenal, a medio camino entre el origen de las arterias renal y ilíaca.
- Reapromoximar los dos extremos de la AA usando una anastomosis de extremo a extremo, como se describió anteriormente. Retire los dos clips y realice un procedimiento de hemostasia preciso.
- Reposicione los intestinos y cierre la pared abdominal en capas, como para los animales receptores.
6. Cuidados postoperatorios y seguimiento
- Administrar solución salina tibia (5 ml) en el tejido subcutáneo de la espalda del animal para su hidratación. Coloque a la rata debajo de una lámpara de calefacción y monitoréela visualmente hasta que se despierte, lo que generalmente toma hasta 5 minutos después de suspender la anestesia. Coloque al animal en una jaula a una temperatura ambiente de 22-24 ° C, con acceso inmediato y sin restricciones a alimentos y agua.
- Administrar tramadol intramuscular (5 mg/kg) para analgesia postoperatoria dos veces al día durante las primeras 48 h después de la cirugía. A partir de entonces, controle el estado de salud y el peso corporal del receptor diariamente, de forma regular.
- Seguimiento: Durante el seguimiento, realice estudios de ultrasonido seriados a la semana, un mes y dos meses para evaluar la función de PAG. Durante estos estudios, mida el diámetro del vaso, la velocidad sistólica máxima (PSV) y la velocidad diastólica final. Medir estos parámetros dentro del PAG y a nivel de AA proximal y distal.
- Sacrificar a los animales después de dos meses de seguimiento mediante la aplicación de CO2 durante unos minutos, y luego explantar el PAG, que se someterá a un análisis histopatológico.
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Resultados
Un total de 39 ratas Lewis adultas fueron incluidas en este estudio: 17 animales fueron utilizados como donantes de PAG, 17 animales como receptores y 5 como operados simuladamente (grupo de control) (Tabla 1). Las ratas macho fueron 22 (56%) y las hembras 17 (44%); estos últimos se utilizaron solo en el grupo de donantes.
No se produjo ningún evento fatal durante la operación con una supervivencia del 100%. Durante el seguimiento, dos animales del grupo de trasplante tuvieron...
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Discusión
El reemplazo de la válvula aórtica con la raíz pulmonar autóloga (operación ross) representa una opción atractiva para la reparación de la estenosis congénita de la válvula aórtica debido al perfil favorable y al crecimiento potencial del autoinjerto10. La principal limitación de este procedimiento es la posible dilatación de la neoválvula aórtica, que predispone al desarrollo de regurgitación a largo plazo. La posibilidad de caracterizar las modificaciones en la arteria pulmonar después de la exp...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El estudio fue financiado por el presupuesto integrado para la investigación interdepartamental (BIRD) 2019.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloruro de Sodio 0,9% | Monico SpA | AIC 030805105 | Dos frascos de 100 mL. El frío (4° C) para lavar el órgano de cosecha; el cálido (39° C) para la humectación y rehidratación del receptor |
| 7,5% Povidona Yodada | B Braun | AIC 032151211 | |
| Barraquer | Aesculap | FD 232R | Micro portaagujas recto para las anastomosis vasculares |
| Portagujas Castroviejo | No disponible | J 4065 | Para cerrar el animal |
| Pinza de aplicación de clip | Rudolf Medical | RU 3994-05 | Para la aplicación de clips |
| Bastoncillos de algodón Johnson | & Johnson Medical SpA | N/A | Producto de supermercado. Esterilizado |
| Pinza de micro joyero curvada | Rudolf Medical | RU 4240-06 | Se utiliza para pasar suturas por debajo de los jarrones. |
| Crema depilatoria | RB healthcare | N/A Producto | supermercado |
| Máquina de electrocauterización | LED SpA | Surton 200 | |
| Tijeras finas | Rudolf Medical | RU 2422-11 | Para abrir el abdomen (recipiente) |
| Punta fina curvada Micro tijeras Vannas | Aesculap | OC 497R | Solo para preparar la raíz pulmonar, corte los jarrones lumbares y el 10/0 Prolene |
| Fluovac Isoflurano/Halotane Unidad de limpieza | Harvard Apparatus Ltd | K 017041 | Completo de máquina de anestesia, tubo de anestesia, cámara de inducción y unidad de limpieza con filtro absorbible |
| Gentamycin | MSD Italia Srl | AIC 020891014 | Antibiótico. Dosis única, 5 mg/kg por vía intramuscular, administrada durante la cirugía |
| Heparina | Pharmatex Italia Srl | AIC 034692044 | 500 UI en el receptor Vena cava |
| abdominal Catéter I.V. | Smiths Medical Ltd | 4036 | 20G |
| Jeringa de insulina, 1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | Para inyectar heparina en el animal de captura y para lavar la aorta seccionada en el receptor |
| Pinza bipolar de joyero | GIMA SpA | 30665 | punta de 0,25 mm. Para la electrocauterización de jarrones muy pequeños |
| Ratas Lewis (LEW/HanHsd) | Envigo RMS SRL, San Pietro al Natisone, Udine, Italia | 86104M | Macho o hembra, con un peso de 200-250 g (animales recolectores de raíces pulmonares) y 320-400 g (recipientes) |
| Micro-Mosquito | Rudolf Medical | RU 3121-10 | En número de cuatro, con las puntas cubiertas con tubos de silicona. Para mantener la tracción de la sutura de Prolene durante la anastomosis |
| Microscopio de operación | Leica Microsystems | M 400-E | Se utiliza con aumentos intercambiables de 6x, 10x y 16x en el procedimiento |
| Perma-Hand silk 2-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | C026D | Para levantar la aorta |
| Pomada oftálmica de vaselina | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Prolene 10-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | W2790 | Sutura muy fina no absorbible, con aguja de cuerpo redondo BV75-3, para las anastomosis |
| vasculares Retractores | No | ninguno N/A Dos | retractores |
| Micro pinzas de punta anular | Rudolf Medical | RU 4079-14 | Para una manipulación delicada |
| Sevoflurano AbbVie | Srl | AIC 031841036 | Mezclado con oxígeno, para anestesia |
| inhalatoriaMicrotijera tipo muelle | Rudolf Medical | RU 2380-14 | Rrecta; 14 cm de largo |
| Pinzas estándar para aneurismas | Rudolf Medical | RU 3980-12 | Dos pinzas (7,5 mm; 180 g; 1,77 N) para cerrar la aorta |
| Gasa estéril de tela no tejida | Luigi Salvadori SpA | 26161V | 7,5x7,5 cm, cuatro capas |
| Tijeras Doyen rectas | Rudolf Medical | RU/1428-16 | Para uso del donante |
| Pinza de micro joyero recta | Rudolf Medical | RU 4240-04 | de 10,5 cm de largo. Se utiliza en toda la anastomosis |
| Jeringas | Artsana SpA | N/A | 20 mL (para el animal recolector) y 5 mL (para el receptor). Para el lavado y la inmersión con solución salina |
| TiCron 4-0 | Covidien | CV-331 | Para el cierre de músculos y piel |
| Pinzas de tejidos V. | Mueller McKesson | CH 6950-009 | Se utiliza para la piel y los músculos |
| Tramadol | SALF SpA | AIC 044718029 | Analgésico. Dosis única, 5 mg/kg intramuscular |
| seda virgen 8-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | W818 | Para la ligadura de ramas arteriales |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
