Para obtener un insecto axénico, se esteriliza la superficie de su huevo y la larva eclosionada se cría posteriormente con hojas axiénicas. Este método proporciona una forma eficiente para la preparación de insectos axénicos sin administrar antibióticos o desarrollar una dieta artificial, que también se puede aplicar a otros insectos que comen hojas.
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Artículo de método
Preparación y cría de insectos axénicos con plántulas cultivadas en tejidos para estudios de interacción entre la microbiota huésped-intestino del escarabajo de la hoja
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Resumen
Resumen
Los intestinos de los insectos son colonizados por diversas bacterias que pueden afectar profundamente los rasgos fisiológicos del huésped. La introducción de una cepa bacteriana particular en un insecto axénico es un método poderoso para verificar la función microbiana intestinal y dilucidar los mecanismos subyacentes a las interacciones entre microbios intestinales y huéspedes. La administración de antibióticos o la esterilización de las superficies de los huevos son dos métodos comúnmente utilizados para eliminar las bacterias intestinales de los insectos. Sin embargo, además de los posibles efectos adversos de los antibióticos en los insectos, estudios previos indicaron que la alimentación con antibióticos no podía eliminar las bacterias intestinales. Por lo tanto, las dietas artificiales libres de gérmenes generalmente se emplean para mantener los insectos axénicos, que es un proceso tedioso y laborioso que no puede parecerse completamente a los componentes nutricionales de los alimentos naturales. Aquí se describe un protocolo eficiente y simple para preparar y mantener larvas axénicas de un escarabajo de la hoja (Plagiodera versicolora). Específicamente, las superficies de los huevos de escarabajo fueron esterilizadas, después de lo cual se utilizaron hojas de álamo libres de gérmenes para criar larvas axénicas. El estado axénico de los insectos se confirmó aún más a través de ensayos dependientes del cultivo e independientes del cultivo. Colectivamente, al combinar la desinfección de huevos y el cultivo libre de gérmenes, se desarrolló un método eficiente y conveniente para obtener P. versicolora axénico, proporcionando una herramienta fácilmente transferible para otros insectos que comen hojas.
Introducción
Similar a los mamíferos, el tracto digestivo de los insectos es una cavidad para la digestión y absorción de los alimentos. La mayoría de los insectos albergan diversas bacterias comensales que prosperan en sus intestinos y viven de la nutrición suministrada por los huéspedes1. La comunidad comensal intestinal tiene un profundo impacto en múltiples procesos fisiológicos en insectos, incluyendo la digestión y desintoxicación de alimentos 2,3,4, nutrición y desarrollo 5,6,7, defensa contra patógenos y parásitos 8,9,10,11, comunicación química 12,13 y comportamientos14 ,15. Curiosamente, parte de la microbiota intestinal puede ser facultativamente patógena o ser manipulada por patógenos invasores para agravar la infección, lo que indica que las bacterias intestinales pueden ser dañinas en algunos casos 16,17,18. Las bacterias intestinales también pueden servir como un recurso microbiano para aplicaciones biotécnicas y manejo de plagas. Por ejemplo, se utilizaron bacterias que digieren la lignocelulosa de insectos fitófagos y xilófagos para digerir células vegetales para desarrollar biocombustibles19. La dispersión de simbiontes intestinales modificados que expresan moléculas bioactivas es una táctica novedosa y prometedora para controlar las plagas agrícolas y forestales y los mosquitos transmisores de enfermedades infecciosas 19,20,21, que también se puede utilizar para mejorar la aptitud de los insectos beneficiosos22. Por lo tanto, ilustrar cómo se comporta una bacteria intestinal in vivo se considera una prioridad para aprovechar al máximo su función y explotarla aún más para diversas aplicaciones.
Los animales pueden albergar de 1 a >1000 especies microbianas simbióticas en el intestino1. Como resultado, es difícil verificar con precisión cómo funcionan los taxones bacterianos individuales o su ensamblaje dentro de un animal, y si el huésped o sus socios microbianos impulsan una función específica. Por lo tanto, la preparación de larvas axénicas para obtener insectos gnotobióticos por colonización mono o multiespecie es necesaria para investigar la función bacteriana y la interacción con los insectos23. En la actualidad, la administración de cócteles antibióticos y la esterilización de la superficie de los huevos de insectos son métodos comunes para eliminar las bacterias intestinales 14,24,25,26. Sin embargo, las dietas antibióticas no pueden eliminar las bacterias intestinales por completo y tienen un efecto negativo en la fisiología del insecto huésped27,28. En consecuencia, el uso de insectos tratados con antibióticos puede oscurecer las verdaderas capacidades de algunas bacterias intestinales. Afortunadamente, la esterilización superficial de los huevos puede negar este problema23,29, que tiene efectos nulos o insignificantes en los insectos experimentales. Además, las dietas artificiales no pueden parecerse completamente a los alimentos naturales para insectos, y desarrollar una dieta artificial es un proceso costoso y que consume mano de obra30,31.
El escarabajo de la hoja de sauce, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), es una plaga herbácea generalizada que se alimenta principalmente de árboles salicáceos, como sauces (Salix) y álamos (Populus L.) 32,33. Aquí, el escarabajo de la hoja de sauce se utilizó como un insecto representativo que come hojas para desarrollar un protocolo para preparar y criar un insecto libre de gérmenes. Explotamos el cultivo de tejido vegetal para obtener hojas de álamo libres de gérmenes para criar larvas axénicas de P. versicolora a partir de huevos esterilizados. El estado axénico de las larvas de P. versicolora se verificó mediante ensayos dependientes del cultivo e independientes del cultivo. Este protocolo puede mantener insectos axénicos que imitan mejor la condición silvestre que la cría de insectos con una dieta artificial. Más importante aún, este método es conveniente a un costo muy bajo, lo que aumenta la viabilidad de obtener insectos axénicos para futuros estudios de interacción insecto-microbiota intestinal, especialmente para insectos no modelo sin dietas artificiales bien desarrolladas.
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Protocolo
1. Cría de insectos
- Mantener la población de P. versicolora en una cámara de crecimiento en la condición de 27 °C y 70 ± 5% de humedad relativa con un fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Colóquelos en cajas de plástico perforadas con papel absorbente húmedo alicatado y aliméntelos con ramas de álamo frescas. Rocíe agua limpia sobre el papel absorbente para mantener la humedad y cambie las ramas cada dos días.
- Aislar a los adultos para la oviposición después de la pupación. Aliméntelos con hojas tiernas para obtener más huevos.
- Recoger los huevos recién puestos (en un plazo de 24 h). Coloque los huevos sobre papel absorbente húmedo durante 60 h para preparar las larvas axiénicas.
NOTA: Los huevos recién puestos eclosionarán después de ~ 72 h. El mejor momento para esterilizar las superficies de los huevos es el día antes de la eclosión; de lo contrario, el número de huevos eclosionados con éxito disminuirá.
2. Cultivo de álamos sin gérmenes
- Preparar soluciones madre de Murashige y Skoog (MS) medio y 1 mg/ml de ácido acético α-naftaleno (NAA) (consulte la Tabla de Materiales).
- En una campana de bioseguridad, agregue 50 μL de solución madre de NAA de 1 mg / ml a 500 ml de medio de EM, agite para mezclar bien y vierta ~ 50 ml por recipiente de cultivo de tejidos y espere la solidificación.
- Prepare bisturíes, lámpara de alcohol y fórceps; esterilizar los bisturíes y fórceps en la llama de la lámpara de alcohol en la campana de bioseguridad.
- Corte los segmentos de tallo de 3-4 cm con brotes apicales o brotes laterales de plántulas de álamo a ~ 1 mes de crecimiento (plántulas cultivadas con tejido libre de gérmenes) e insértelos en el medio de cultivo, uno o dos segmentos de tallo por contenedor.
- Incubar estos segmentos del tallo en una cámara de crecimiento a 25 °C y 50 ± 10 cd de intensidad de luz con un fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad durante aproximadamente 30 días. Use las hojas libres de gérmenes para alimentar a las larvas axénicas.
3. Esterilización de la superficie del huevo y cría de larvas axénicas
- Placas de Petri en autoclave, pinceles, papel de filtro, agua destilada y una placa de Petri que contiene medio de agar LB (Luria-Bertani).
- Coloque las hojas con huevos adherentes en una placa de Petri, retire cuidadosamente los huevos de las hojas con fórceps y transfiéralos a otra placa de Petri.
NOTA: Este paso debe realizarse con mucho cuidado porque los huevos son adherentes a las hojas. - Lave estos huevos con etanol al 75% durante 8 minutos y repita el lavado cuatro veces con agua estéril.
- Transfiera los huevos al medio de agar LB para preservar la humedad para la eclosión.
NOTA: El uso de medio de agar LB puede ayudar a verificar si el huevo desinfectado está libre de gérmenes. - Coloque la placa de Petri en una cámara de crecimiento y espere a que los huevos eclosionen dentro de las 24 h.
- En una campana de bioseguridad, azulee tres trozos de papel de filtro húmedo en una placa de Petri, coloque hojas de álamo libres de gérmenes en el papel, recoja las larvas y colóquelas en las hojas, selle la placa de Petri con parafilm y cúbralas en una cámara de crecimiento a 27 ° C y 70 ± 5% de humedad relativa con un fotoperíodo de 16 h de luz / 8 h de oscuridad.
NOTA: Las hojas cultivadas con tejido son delicadas y pueden perder agua rápidamente. Por lo tanto, es necesario usar papel de filtro húmedo al transferir las hojas a la placa de Petri. - Cambie las hojas cada dos días.
- Para los grupos criados convencionalmente, transfiera los huevos de las hojas a una placa de Petri que contenga papel de filtro húmedo y alimente a estas larvas con hojas de álamo libres de gérmenes.
4. Verificación de larvas axénicas con ensayos dependientes del cultivo
- Seleccione al azar tres larvas de1º,2º y3º instar de los grupos libres de gérmenes y criados convencionalmente.
- Diseccionar las larvas de3º instar con tijeras y fórceps estériles bajo un estereomicroscopio y recoger sus tripas en tubos de microcentrífuga. Recolectar larvasintactas de 1º y2º instar en tubos.
NOTA: Recolecte larvas enteras de1º y2º instar, ya que son demasiado pequeñas para diseccionar, y mantenga sus intestinos intactos. - Agregue 100 μL de solución salina tamponada con fosfato y tres bolas de acero a los tubos de 1,5 ml y muela los tejidos en homogeneizados utilizando un homogeneizador de perlas.
- Agregue 100 μL del homogeneizado al medio y placa de agar LB usando una varilla de vidrio estéril.
- Coloque las placas a 37 °C durante 24 h y observe las colonias bacterianas.
5. Verificación de individuos axénicos con ensayos independientes de la cultura
- Extraer el ADN total de los tejidos (obtenido en la sección 4) mediante un kit de extracción de ADN.
- Mida la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro a 260 nm.
- Amplificar el gen bacteriano 16S rRNA utilizando cebadores universales de ARNr 16S con PCR. Configure el sistema de reacción con 18 μL de mezcla maestra de PCR 1.1x (consulte la Tabla de Materiales), 0.5 μL de imprimación 27F (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0.5 μL de imprimación 1495R (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') y 100 ng de PLANTILLA de ADN. Establecer las condiciones de PCR a 95 °C durante 3 min; 28 ciclos de 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 min; seguido de 72 °C durante 10 min. Conservar los productos de PCR a 4 °C hasta un análisis adicional.
- Mezcle los productos de PCR con colorante de ácido nucleico y analícelos mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% en 1x tampón TAE. Utilice 10 μL de un marcador de ADN como referencia.
- Observe el gel con un transiluminador UV y busque el fragmento objetivo alrededor de 1.500 pb.
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Resultados
Las etapas de la vida de P. versicolora se muestran en la Figura 1. El macho adulto es más pequeño que la hembra adulta (Figura 1A). En el campo, el escarabajo agrupa sus huevos en una hoja; aquí, cuatro huevos se separaron de una hoja (Figura 1B). Los segmentos del tallo del álamo y las plántulas utilizadas para la cría de insectos axénicos se muestran en la Figura 2. El intestino de una larva...
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Discusión
La preparación de larvas libres de gérmenes y la obtención de larvas gnotobióticas mediante la reintroducción de cepas bacterianas específicas son métodos poderosos para dilucidar los mecanismos subyacentes a las interacciones huésped-microbio. Las larvas recién nacidas obtienen la microbiota intestinal de dos maneras principales: transmisión vertical de la madre a la descendencia o adquisición horizontal de los hermanos y el medio ambiente34. El primero puede cumplirse mediante la transferencia p...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31971663) y el Programa de Patrocinio de Jóvenes Científicos de Élite por CAST (2020QNRC001).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,22 y micro; Filtros de jeringa | Millipore | SLGP033RB | |
| NAA de 1 mg/mL | a. Prepare una solución de NaOH 0,1 M (disuelva 0,8 g de NaOH en 200 mL de agua destilada). b. Agregue 0,2 g de NAA en un vaso de precipitados de 250 mL, agregue una pequeña solución de NaOH 0,1 M hasta que el NAA se disuelva y ajuste el volumen final a 200 mL con agua destilada. c. Filtre la solución para eliminar las bacterias con un 0,22 µ m y una jeringa estéril de 50 mL, subempaque la solución en tubos de centrífuga de 1,5 mL y restaure a -20 °C. | ||
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x solución madre de PBS | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH Disolver | 22,44 g de KOH (peso molecular: 56,1) en 200 mL de agua destilada y esterilizarla en autoclave durante 20 min a 121 °C. | ||
| Vasos de precipitados de 250 mL y 2.000 mL | Shubo | sb16455 | |
| Jeringas estériles de 50 mL | Jinta | JT0125789 | |
| cilindro de medición de 500 mL | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE solución | a. Disolver 242 g de Tris y 18,612 g de EDTA en 700 mL de agua destilada. b. Ajuste el pH a 7.8 con aproximadamente 57.1 mL de ácido acético. c. Ajuste el volumen final a 1,000 mL. d. La solución madre se diluyó a 1x tampón TAE cuando se utilizó. | ||
| 75% etanol | Xingheda comercio | ||
| &alfa;-naftaleno ácido acético (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Papel | 22,3 cm x 15,3 cm x 9 cm | ||
| Ácido acético | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarosa | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Homogeneizador de bolas | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| Kit de extracción | de ADN MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Papel de filtro | Jiaojie | 70 mm de diámetro | |
| Unidad | de electroforesis en gelBio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green colorante de ácido nucleico | TsingKe | TSJ003 | |
| Plántulas de álamo libres de gérmenes | Álamo Shan Xin de la Universidad de Ludong en la provincia de Shandong Golden | ||
| Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Cámara de crecimiento | Ruihua | HP400GS-C | |
| medio de agar | a. Disuelva 5 g de triptona, 5 g de NaCl, 2,5 g de extracto de levadura en 300 mL de agua destilada. b. Ajuste el volumen final a 500 mL, transfiera la solución a un matraz cónico de 1,000 mL y agregue 7.5 g de agar. c. Atornille el medio durante 20 min a 121 °C. | ||
| Mini centrífuga | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS medio básico | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS medio sólido para el cultivo | a. Disuelva 4,43 g de polvo de medio básico MS y 30 g de sacarosa en 800 mL de agua destilada. b. Ajuste el pH a aproximadamente 5.8 con 2 M KOH con un medidor de pH. c. Ajuste el volumen final a 1,000 mL, separar en dos partes, transferir a dos matraces cónicos de 1.000 mL y añadir 2,6 g de agar por 500 mL. d. Autoclave durante 20 min a 121 °C. | ||
| Espectrofotómetro NanoDrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pincel | de 1 cm de ancho, utilizado para recoger los huevos | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Termocicladores | Eppendorf | 6331000076 | |
| Placas de Petri | Supin | 90 mm de diámetro | |
| METTLER TOLEDO | FE20 | ||
| Pipetas 0.2-2 y micro; L | Gilson | ECS000699 | |
| Pipetas 100-1.000 µ L | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipetas 20-200 µ L | Pipetas 3120000259 | ||
| 2-20 y micro; L | Eppendorf | 3120000232 | |
| Contenedor de cultivo de tejidos vegetales | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Caja | 2,35 L | ||
| Hidróxido de potasio (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Imprimadores para amplificar el gen bacteriano 16S rRNA | Sangon Biotech | 27-F: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3' | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Bolas | 0,25 mm | utilizadas para moler tejidos | |
| Microscopio estereoscópico | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sacarosa | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marcador | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Triptona | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| Transiluminador UV | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Ramas | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Escarabajo de la hoja del sauce | Huazhong, Wuhan, China | ||
| Extracto de levadura | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
Referencias
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