Para obtener un insecto axénico, se esteriliza la superficie de su huevo y la larva eclosionada se cría posteriormente con hojas axiénicas. Este método proporciona una forma eficiente para la preparación de insectos axénicos sin administrar antibióticos o desarrollar una dieta artificial, que también se puede aplicar a otros insectos que comen hojas.
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Artículo de método
Preparación y cría de insectos axénicos con plántulas cultivadas en tejidos para estudios de interacción entre la microbiota huésped-intestino del escarabajo de la hoja
En este artículo
Resumen
Resumen
Los intestinos de los insectos son colonizados por diversas bacterias que pueden afectar profundamente los rasgos fisiológicos del huésped. La introducción de una cepa bacteriana particular en un insecto axénico es un método poderoso para verificar la función microbiana intestinal y dilucidar los mecanismos subyacentes a las interacciones entre microbios intestinales y huéspedes. La administración de antibióticos o la esterilización de las superficies de los huevos son dos métodos comúnmente utilizados para eliminar las bacterias intestinales de los insectos. Sin embargo, además de los posibles efectos adversos de los antibióticos en los insectos, estudios previos indicaron que la alimentación con antibióticos no podía eliminar las bacterias intestinales. Por lo tanto, las dietas artificiales libres de gérmenes generalmente se emplean para mantener los insectos axénicos, que es un proceso tedioso y laborioso que no puede parecerse completamente a los componentes nutricionales de los alimentos naturales. Aquí se describe un protocolo eficiente y simple para preparar y mantener larvas axénicas de un escarabajo de la hoja (Plagiodera versicolora). Específicamente, las superficies de los huevos de escarabajo fueron esterilizadas, después de lo cual se utilizaron hojas de álamo libres de gérmenes para criar larvas axénicas. El estado axénico de los insectos se confirmó aún más a través de ensayos dependientes del cultivo e independientes del cultivo. Colectivamente, al combinar la desinfección de huevos y el cultivo libre de gérmenes, se desarrolló un método eficiente y conveniente para obtener P. versicolora axénico, proporcionando una herramienta fácilmente transferible para otros insectos que comen hojas.
Introducción
Similar a los mamíferos, el tracto digestivo de los insectos es una cavidad para la digestión y absorción de los alimentos. La mayoría de los insectos albergan diversas bacterias comensales que prosperan en sus intestinos y viven de la nutrición suministrada por los huéspedes1. La comunidad comensal intestinal tiene un profundo impacto en múltiples procesos fisiológicos en insectos, incluyendo la digestión y desintoxicación de alimentos 2,3,4, nutrición y desarrollo 5,6,7, defensa co....
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Protocolo
1. Cría de insectos
- Mantener la población de P. versicolora en una cámara de crecimiento en la condición de 27 °C y 70 ± 5% de humedad relativa con un fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Colóquelos en cajas de plástico perforadas con papel absorbente húmedo alicatado y aliméntelos con ramas de álamo frescas. Rocíe agua limpia sobre el papel absorbente para mantener la humedad y cambie las ramas cada dos días.
- Aislar a los adultos para la oviposición después de la pupación. Aliméntelos con hojas tiernas para obtener más huevos.
- Recoger los huevos recién puestos (en un plazo de 24 h). Coloque los huevos so....
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Resultados
Las etapas de la vida de P. versicolora se muestran en la Figura 1. El macho adulto es más pequeño que la hembra adulta (Figura 1A). En el campo, el escarabajo agrupa sus huevos en una hoja; aquí, cuatro huevos se separaron de una hoja (Figura 1B). Los segmentos del tallo del álamo y las plántulas utilizadas para la cría de insectos axénicos se muestran en la Figura 2. El intestino de una larva.......
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Discusión
La preparación de larvas libres de gérmenes y la obtención de larvas gnotobióticas mediante la reintroducción de cepas bacterianas específicas son métodos poderosos para dilucidar los mecanismos subyacentes a las interacciones huésped-microbio. Las larvas recién nacidas obtienen la microbiota intestinal de dos maneras principales: transmisión vertical de la madre a la descendencia o adquisición horizontal de los hermanos y el medio ambiente34. El primero puede cumplirse mediante la transferencia p.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31971663) y el Programa de Patrocinio de Jóvenes Científicos de Élite por CAST (2020QNRC001).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,22 y micro; Filtros de jeringa | Millipore | SLGP033RB | |
| NAA de 1 mg/mL | a. Prepare una solución de NaOH 0,1 M (disuelva 0,8 g de NaOH en 200 mL de agua destilada). b. Agregue 0,2 g de NAA en un vaso de precipitados de 250 mL, agregue una pequeña solución de NaOH 0,1 M hasta que el NAA se disuelva y ajuste el volumen final a 200 mL con agua destilada. c. Filtre la solución para eliminar las bacterias con un 0,22 µ m y una jeringa estéril de 50 mL, subempaque la solución en tubos de centrífuga de 1,5 mL y restaure a -20 °C. | ||
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x solución madre de PBS | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH Disolver | 22,44 g de KOH (peso molecular: 56,1) en 200 mL de agua destilada y esterilizarla en autoclave durante 20 min a 121 °C. | ||
| Vasos de precipitados de 250 mL y 2.000 mL | Shubo | sb16455 | |
| Jeringas estériles de 50 mL | Jinta | JT0125789 | |
| cilindro de medición de 500 mL | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE solución | a. Disolver 242 g de Tris y 18,612 g de EDTA en 700 mL de agua destilada. b. Ajuste el pH a 7.8 con aproximadamente 57.1 mL de ácido acético. c. Ajuste el volumen final a 1,000 mL. d. La solución madre se diluyó a 1x tampón TAE cuando se utilizó. | ||
| 75% etanol | Xingheda comercio | ||
| &alfa;-naftaleno ácido acético (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Papel | 22,3 cm x 15,3 cm x 9 cm | ||
| Ácido acético | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarosa | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Homogeneizador de bolas | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| Kit de extracción | de ADN MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Papel de filtro | Jiaojie | 70 mm de diámetro | |
| Unidad | de electroforesis en gelBio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green colorante de ácido nucleico | TsingKe | TSJ003 | |
| Plántulas de álamo libres de gérmenes | Álamo Shan Xin de la Universidad de Ludong en la provincia de Shandong Golden | ||
| Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Cámara de crecimiento | Ruihua | HP400GS-C | |
| medio de agar | a. Disuelva 5 g de triptona, 5 g de NaCl, 2,5 g de extracto de levadura en 300 mL de agua destilada. b. Ajuste el volumen final a 500 mL, transfiera la solución a un matraz cónico de 1,000 mL y agregue 7.5 g de agar. c. Atornille el medio durante 20 min a 121 °C. | ||
| Mini centrífuga | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS medio básico | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS medio sólido para el cultivo | a. Disuelva 4,43 g de polvo de medio básico MS y 30 g de sacarosa en 800 mL de agua destilada. b. Ajuste el pH a aproximadamente 5.8 con 2 M KOH con un medidor de pH. c. Ajuste el volumen final a 1,000 mL, separar en dos partes, transferir a dos matraces cónicos de 1.000 mL y añadir 2,6 g de agar por 500 mL. d. Autoclave durante 20 min a 121 °C. | ||
| Espectrofotómetro NanoDrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pincel | de 1 cm de ancho, utilizado para recoger los huevos | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Termocicladores | Eppendorf | 6331000076 | |
| Placas de Petri | Supin | 90 mm de diámetro | |
| METTLER TOLEDO | FE20 | ||
| Pipetas 0.2-2 y micro; L | Gilson | ECS000699 | |
| Pipetas 100-1.000 µ L | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipetas 20-200 µ L | Pipetas 3120000259 | ||
| 2-20 y micro; L | Eppendorf | 3120000232 | |
| Contenedor de cultivo de tejidos vegetales | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Caja | 2,35 L | ||
| Hidróxido de potasio (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Imprimadores para amplificar el gen bacteriano 16S rRNA | Sangon Biotech | 27-F: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3' | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Bolas | 0,25 mm | utilizadas para moler tejidos | |
| Microscopio estereoscópico | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sacarosa | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marcador | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Triptona | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| Transiluminador UV | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Ramas | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Escarabajo de la hoja del sauce | Huazhong, Wuhan, China | ||
| Extracto de levadura | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
Referencias
- Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
- Warnecke, F., et al. M....
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Reimpresiones y permisos
