Preparación y cría de insectos axénicos con plántulas cultivadas en tejidos para estudios de interacción entre la microbiota huésped-intestino del escarabajo de la hoja

Summary

Para obtener un insecto axénico, se esteriliza la superficie de su huevo y la larva eclosionada se cría posteriormente con hojas axiénicas. Este método proporciona una forma eficiente para la preparación de insectos axénicos sin administrar antibióticos o desarrollar una dieta artificial, que también se puede aplicar a otros insectos que comen hojas.

Abstract

Los intestinos de los insectos son colonizados por diversas bacterias que pueden afectar profundamente los rasgos fisiológicos del huésped. La introducción de una cepa bacteriana particular en un insecto axénico es un método poderoso para verificar la función microbiana intestinal y dilucidar los mecanismos subyacentes a las interacciones entre microbios intestinales y huéspedes. La administración de antibióticos o la esterilización de las superficies de los huevos son dos métodos comúnmente utilizados para eliminar las bacterias intestinales de los insectos. Sin embargo, además de los posibles efectos adversos de los antibióticos en los insectos, estudios previos indicaron que la alimentación con antibióticos no podía eliminar las bacterias intestinales. Por lo tanto, las dietas artificiales libres de gérmenes generalmente se emplean para mantener los insectos axénicos, que es un proceso tedioso y laborioso que no puede parecerse completamente a los componentes nutricionales de los alimentos naturales. Aquí se describe un protocolo eficiente y simple para preparar y mantener larvas axénicas de un escarabajo de la hoja (Plagiodera versicolora). Específicamente, las superficies de los huevos de escarabajo fueron esterilizadas, después de lo cual se utilizaron hojas de álamo libres de gérmenes para criar larvas axénicas. El estado axénico de los insectos se confirmó aún más a través de ensayos dependientes del cultivo e independientes del cultivo. Colectivamente, al combinar la desinfección de huevos y el cultivo libre de gérmenes, se desarrolló un método eficiente y conveniente para obtener P. versicolora axénico, proporcionando una herramienta fácilmente transferible para otros insectos que comen hojas.

Introduction

Similar a los mamíferos, el tracto digestivo de los insectos es una cavidad para la digestión y absorción de los alimentos. La mayoría de los insectos albergan diversas bacterias comensales que prosperan en sus intestinos y viven de la nutrición suministrada por los huéspedes¹. La comunidad comensal intestinal tiene un profundo impacto en múltiples procesos fisiológicos en insectos, incluyendo la digestión y desintoxicación de alimentos ^2,3,4, nutrición y desarrollo ^5,6,7, defensa co....

Protocol

1. Cría de insectos

1. Mantener la población de P. versicolora en una cámara de crecimiento en la condición de 27 °C y 70 ± 5% de humedad relativa con un fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Colóquelos en cajas de plástico perforadas con papel absorbente húmedo alicatado y aliméntelos con ramas de álamo frescas. Rocíe agua limpia sobre el papel absorbente para mantener la humedad y cambie las ramas cada dos días.
2. Aislar a los adultos para la oviposición después de la pupación. Aliméntelos con hojas tiernas para obtener más huevos.
3. Recoger los huevos recién puestos (en un plazo de 24 h). Coloque los huevos so....

Results

Las etapas de la vida de P. versicolora se muestran en la Figura 1. El macho adulto es más pequeño que la hembra adulta (Figura 1A). En el campo, el escarabajo agrupa sus huevos en una hoja; aquí, cuatro huevos se separaron de una hoja (Figura 1B). Los segmentos del tallo del álamo y las plántulas utilizadas para la cría de insectos axénicos se muestran en la Figura 2. El intestino de una larva.......

Discussion

La preparación de larvas libres de gérmenes y la obtención de larvas gnotobióticas mediante la reintroducción de cepas bacterianas específicas son métodos poderosos para dilucidar los mecanismos subyacentes a las interacciones huésped-microbio. Las larvas recién nacidas obtienen la microbiota intestinal de dos maneras principales: transmisión vertical de la madre a la descendencia o adquisición horizontal de los hermanos y el medio ambiente³⁴. El primero puede cumplirse mediante la transferencia p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 y micro; Filtros de jeringa	Millipore	SLGP033RB
		NAA de 1 mg/mL	a. Prepare una solución de NaOH 0,1 M (disuelva 0,8 g de NaOH en 200 mL de agua destilada). b. Agregue 0,2 g de NAA en un vaso de precipitados de 250 mL, agregue una pequeña solución de NaOH 0,1 M hasta que el NAA se disuelva y ajuste el volumen final a 200 mL con agua destilada. c. Filtre la solución para eliminar las bacterias con un 0,22 µ m y una jeringa estéril de 50 mL, subempaque la solución en tubos de centrífuga de 1,5 mL y restaure a -20 °C.
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Sangon Biotech	F600620
10x solución madre de PBS	Biosharp Life Sciences	BL302A
2 M KOH Disolver			22,44 g de KOH (peso molecular: 56,1) en 200 mL de agua destilada y esterilizarla en autoclave durante 20 min a 121 °C.
Vasos de precipitados de 250 mL y 2.000 mL	Shubo	sb16455
Jeringas estériles de 50 mL	Jinta	JT0125789
cilindro de medición de 500 mL	Shubo	sb1601
50x TAE solución			a.  Disolver 242 g de Tris y 18,612 g de EDTA en 700 mL de agua destilada. b. Ajuste el pH a 7.8 con aproximadamente 57.1 mL de ácido acético. c. Ajuste el volumen final a 1,000 mL. d. La solución madre se diluyó a 1x tampón TAE cuando se utilizó.
75% etanol	Xingheda comercio
&alfa;-naftaleno ácido acético (NAA)	Solarbio Life Sciences	86-87-3
Papel			22,3 cm x 15,3 cm x 9 cm
Ácido acético	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Agar	Coolaber	9002-18-0
Agarosa	Biowest	111860
Autoclave	Panasonic	MLS-3781L-PC
Homogeneizador de bolas	Jing Xin	XM-GTL64
Kit de extracción	de ADN MP Biomedicals	116560200
EDTA	Saiguo Biotech	1340
Papel de filtro	Jiaojie		70 mm de diámetro
Unidad	de electroforesis en gelBio-rad	164-5052
Gel Signal Green colorante de ácido nucleico	TsingKe	TSJ003
Plántulas de álamo libres de gérmenes			Álamo Shan Xin de la Universidad de Ludong en la provincia de Shandong Golden
Star Super PCR Master Mix (1.1×)	TsingKe	TSE101
Cámara de crecimiento	Ruihua	HP400GS-C
medio de agar			a. Disuelva 5 g de triptona, 5 g de NaCl, 2,5 g de extracto de levadura en 300 mL de agua destilada. b. Ajuste el volumen final a 500 mL, transfiera la solución a un matraz cónico de 1,000 mL y agregue 7.5 g de agar. c. Atornille el medio durante 20 min a 121 °C.
Mini centrífuga	DRAGONLAB	D1008
MS medio básico	Coolaber	PM1121-50L	M0245
MS medio sólido para el cultivo			a. Disuelva 4,43 g de polvo de medio básico MS y 30 g de sacarosa en 800 mL de agua destilada. b. Ajuste el pH a aproximadamente 5.8 con 2 M KOH con un medidor de pH. c. Ajuste el volumen final a 1,000 mL, separar en dos partes, transferir a dos matraces cónicos de 1.000 mL y añadir 2,6 g de agar por 500 mL. d. Autoclave durante 20 min a 121 °C.
Espectrofotómetro NanoDrop 1000	Thermo Fisher Scientific
Pincel			de 1 cm de ancho, utilizado para recoger los huevos
Parafilm	Bemis	PM-996
PCR Termocicladores	Eppendorf	6331000076
Placas de Petri	Supin		90 mm de diámetro
	METTLER TOLEDO	FE20
Pipetas 0.2-2 y micro; L	Gilson	ECS000699
Pipetas 100-1.000 µ L	Eppendorf	3120000267
Pipetas 20-200 µ L	Pipetas 3120000259
2-20 y micro; L	Eppendorf	3120000232
Contenedor de cultivo de tejidos vegetales	Chembase	ZP21	240 mL
Caja			2,35 L
Hidróxido de potasio (KOH)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Imprimadores para amplificar el gen bacteriano 16S rRNA	Sangon Biotech		27-F: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'
Cloruro de sodio (NaCl)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Hidróxido de sodio (NaOH)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Bolas		0,25 mm	utilizadas para moler tejidos
Microscopio estereoscópico	OLYMPUS	SZ61
Sacarosa	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Trans2K plus II DNA marcador	Transgene Biotech	BM121-01
Tris base	Biosharp Life Sciences	1115
Triptona	Thermo Fisher Scientific	LP0037
Transiluminador UV	Monad Biotech	QuickGel 6100
Vortexer	Scilogex	MX-S
Ramas			Sha Lake Park, Wuhan, China
Escarabajo de la hoja del sauce			Huazhong, Wuhan, China
Extracto de levadura	Thermo Fisher Scientific	LP0021