Summary
For at opnå et axenisk insekt steriliseres dets ægoverflade, og den klækkede larve opdrættes efterfølgende ved hjælp af axeniske blade. Denne metode giver en effektiv måde til axenisk insektforberedelse uden at administrere antibiotika eller udvikle en kunstig kost, som også kan anvendes på andre bladspisende insekter.
Abstract
Insektindvolde koloniseres af forskellige bakterier, der kan påvirke værtens fysiologiske træk dybt. Introduktion af en bestemt bakteriestamme i et axenisk insekt er en kraftfuld metode til at verificere tarmens mikrobielle funktion og belyse de mekanismer, der ligger til grund for tarmmikrobe-værtsinteraktioner. Administration af antibiotika eller sterilisering af ægoverflader er to almindeligt anvendte metoder til at fjerne tarmbakterier fra insekter. Ud over de potentielle bivirkninger af antibiotika på insekter viste tidligere undersøgelser imidlertid, at fodring af antibiotika ikke kunne eliminere tarmbakterier. Således anvendes kimfri kunstige kostvaner generelt til at opretholde axeniske insekter, hvilket er en kedelig og arbejdskrævende proces, der ikke fuldt ud kan ligne ernæringsmæssige komponenter i naturlig mad. Beskrevet her er en effektiv og enkel protokol til forberedelse og vedligeholdelse af axeniske larver af en bladbille (Plagiodera versicolora). Specifikt blev overflader af billeæggene steriliseret, hvorefter kimfrie poppelblade blev brugt til at bagakseniske larver. Insekternes axoniske status blev yderligere bekræftet via kulturafhængige og kulturuafhængige analyser. Samlet set blev der ved at kombinere ægdesinfektion og kimfri dyrkning udviklet en effektiv og bekvem metode til at opnå axenisk P. versicolora, hvilket giver et let overførbart værktøj til andre bladspisende insekter.
Introduction
I lighed med pattedyr er insektets fordøjelseskanalen et hulrum til fordøjelse og absorption af fødevarer. De fleste insekter har forskellige kommensale bakterier, der trives i deres tarme og lever af ernæring leveret af værter1. Tarmkommensalsamfundet har en dybtgående indvirkning på flere fysiologiske processer i insekter, herunder fordøjelse og afgiftning af fødevarer 2,3,4, ernæring og udvikling 5,6,7, forsvar mod patogener og parasitter 8,9,10,11, kemisk kommunikation 12,13 og adfærd14 ,15. Interessant nok kan nogle tarmmikrobiota være fakultativt patogene eller manipuleres af invaderende patogener for at forværre infektionen, hvilket indikerer, at tarmbakterier i nogle tilfælde kan være skadelige 16,17,18. Tarmbakterier kan også tjene som en mikrobiel ressource til biotekniske anvendelser og skadedyrsbekæmpelse. For eksempel blev lignocellulosefordøjende bakterier fra phytophagous og xylophagous insekter brugt til at fordøje planteceller til udvikling af biobrændstoffer19. Spredningen af konstruerede tarmsybbionter, der udtrykker bioaktive molekyler, er en ny og lovende taktik til håndtering af skadedyr i landbrug og skovbrug og myg, der overfører infektionssygdomme19,20,21, som også kan bruges til at forbedre egnetheden af gavnlige insekter22. At illustrere, hvordan en tarmbakterie opfører sig in vivo, betragtes således som en prioritet for fuldt ud at udnytte dens funktion og yderligere udnytte den til forskellige anvendelser.
Dyr kan rumme 1 til > 1000 symbiotiske mikrobielle arter i tarmen1. Som følge heraf er det vanskeligt nøjagtigt at verificere, hvordan individuelle bakterietaxa eller deres samling fungerer inde i et dyr, og om værten eller dens mikrobielle partnere driver en bestemt funktion. Derfor er det nødvendigt at forberede axeniske larver til at opnå gnobiotiske insekter ved mono- eller flerartskolonisering for at undersøge bakteriel funktion og interaktion med insekter23. På nuværende tidspunkt er administration af antibiotikacocktails og sterilisering af overfladen af insektæg almindelige metoder til at fjerne tarmbakterier 14,24,25,26. Antibiotikadiæter kan dog ikke fjerne tarmbakterier fuldstændigt og har en negativ effekt på værtsinsektfysiologien27,28. Derfor kan brugen af antibiotikabehandlede insekter skjule nogle tarmbakteriers sande evner. Heldigvis kan overfladesterilisering af æg negere dette problem23,29, hvilket ikke har nogen eller ubetydelige virkninger på eksperimentelle insekter. Desuden kan kunstige kostvaner ikke fuldt ud ligne naturlig insektføde, og udvikling af en kunstig kost er en dyr og arbejdskrævende proces30,31.
Pilebladbillen, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), er et udbredt bladædende skadedyr, der hovedsageligt lever af salicaceous træer, såsom pil (Salix) og poppel (Populus L.) 32,33. Her blev pilebladbaglen brugt som et repræsentativt bladædende insekt til at udvikle en protokol til at forberede og opdrætte et kimfrit insekt. Vi udnyttede plantevævskultur til at opnå bakteriefrie poppelblade til at bage P. versicolora axeniske larver fra steriliserede æg. Den axeniske status for P. versicolora larver blev verificeret via kulturafhængige og kulturuafhængige assays. Denne protokol kan opretholde axeniske insekter, der bedre efterligner den vilde tilstand end insektopdræt med en kunstig kost. Endnu vigtigere er denne metode praktisk til en meget lav pris, hvilket øger muligheden for at opnå axeniske insekter til fremtidige insekt-tarm mikrobiota interaktionsundersøgelser, især for ikke-model insekter uden veludviklede kunstige kostvaner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insektopdræt
- Oprethold P. versicolora-populationen i et vækstkammer ved tilstanden 27 ° C og 70 ± 5% relativ luftfugtighed med en fotoperiode på 16 timer lys / 8 timer mørk. Læg dem i perforerede plastkasser med flisebelagt vådt absorberende papir og fodre dem friske poppelgrene. Sprøjt rent vand på absorberende papir for at opretholde fugt og skifte grene hver anden dag.
- Isoler voksne til oviposition efter hvalp. Foder dem ømme blade for at få flere æg.
- Saml nylagte æg (inden for 24 timer). Læg æggene på fugtigt absorberende papir i 60 timer for at forberede axeniske larver.
BEMÆRK: Nylagte æg klækkes efter ~72 timer. Det bedste tidspunkt at sterilisere ægoverflader er dagen før udklækning; Ellers vil antallet af vellykkede klækkede æg falde.
2. Kimfri poppeldyrkning
- Der fremstilles Stamopløsninger af Murashige og Skoog (MS) og 1 mg/ml α-naphthaleneddikesyre (NAA) (se materialetabellen).
- I en biosikkerhedshætte tilsættes 50 μL 1 mg/ml NAA-stamopløsning til 500 ml MS-medium, rystes for at blande godt, og hæld ~ 50 ml pr. Vævskulturbeholder og vent på størkning.
- Forbered skalpeller, alkohollampe og tang; sterilisere skalpeller og tang i alkohollampeflammen i biosikkerhedshætten.
- Skær 3-4 cm stammesegmenter med apikale knopper eller laterale knopper fra poppelplanter ved ~ 1 måneds vækst (kimfri vævskulturelle frøplanter), og indsæt dem i kulturmediet, et eller to stammesegmenter pr. Beholder.
- Inkuber disse stammesegmenter i et vækstkammer ved 25 °C og 50 ± 10 cd lysintensitet med en fotoperiode på 16 timer lys/8 timer mørk i ca. 30 dage. Brug de kimfrie blade til at fodre de axeniske larver.
3. Sterilisering af ægoverflade og opdræt af axeniske larver
- Autoklave petriskåle, pensler, filterpapir, destilleret vand og en petriskål indeholdende LB (Luria-Bertani) agarmedium.
- Læg blade med klæbende æg i en petriskål, fjern forsigtigt æggene fra bladene ved hjælp af tang, og overfør dem til en anden petriskål.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres meget omhyggeligt, fordi æggene klæber til bladene. - Vask disse æg med 75% ethanol i 8 min, og gentag vasken fire gange med sterilt vand.
- Overfør æggene til LB agar medium for at bevare fugt til ruge.
BEMÆRK: Brug af LB agar medium kan hjælpe med at kontrollere, om det desinficerede æg er kimfrit. - Læg petriskålen i et vækstkammer og vent på, at æggene klækkes inden for 24 timer.
- I en biosikkerhedshætte skal du flise tre stykker vådt filterpapir i en petriskål, placere kimfrie poppelblade på papiret, samle larverne og placere dem på bladene, forsegle petriskålen med parafilm og inkubere dem i et vækstkammer ved 27 ° C og 70 ± 5% relativ luftfugtighed med en fotoperiode på 16 timer lys / 8 timer mørkt.
BEMÆRK: De vævskulturerede blade er sarte og kan hurtigt miste vand. Således er det nødvendigt at bruge fugtigt filterpapir, når bladene overføres til petriskålen. - Skift bladene hver anden dag.
- For de konventionelt opdrættede grupper overføres æggene fra bladene til en petriskål indeholdende fugtigt filterpapir og fodrer disse larver med kimfrie poppelblade.
4. Verifikation af axeniske larver med kulturafhængige assays
- Vælg tilfældigt tre 1st, 2nd og 3rd instar larver fra de kimfrie og konventionelt opdrættede grupper.
- Dissekere de 3. instar larver med steril saks og tang under et stereomikroskop og samle deres tarme i mikrocentrifugerør. Saml intakte 1. og 2. instar larver i rør.
BEMÆRK: Saml hele 1. og 2. instar larver, da de er for små til at dissekere, og hold deres tarme intakte. - Tilsæt 100 μL fosfatbufret saltvand og tre stålkugler til 1,5 ml rør og slib vævene i homogenater ved hjælp af en perleslagende homogenisator.
- Der tilsættes 100 μL af homogenatet til LB agar medium og plade ved hjælp af en steril glasspedstang.
- Anbring pladerne ved 37 °C i 24 timer, og observer bakteriekolonierne.
5. Verifikation af axeniske individer med kulturuafhængige assays
- Det samlede DNA fra væv (opnået i punkt 4) ekstraheres ved hjælp af et DNA-ekstraktionssæt.
- Mål DNA-koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer ved 260 nm.
- Amplify det bakterielle 16S rRNA-gen ved hjælp af universelle 16S rRNA-primere med PCR. Opsæt reaktionssystemet med 18 μL 1,1x PCR-mastermix (se materialetabellen), 0,5 μL 27F-primer (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0,5 μL 1495R-primer (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') og 100 ng skabelon-DNA. Indstil PCR-betingelserne til 95 °C i 3 minutter; 28 cyklusser på 95 °C i 30 s, 55 °C i 1 min og 72 °C i 1 min. efterfulgt af 72 °C i 10 minutter. PCR-produkterne opbevares ved 4 °C indtil yderligere analyse.
- Bland PCR-produkterne med nukleinsyrefarvestof og analyser dem ved hjælp af elektroforese på en 1% agarosegel i 1x TAE-buffer. Brug 10 μL af en DNA-markør som reference.
- Overhold gelen med en UV-transilluminator, og kig efter målfragmentet omkring 1.500 bp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Livsstadierne i P. versicolora er vist i figur 1. Den voksne han er mindre end den voksne hun (figur 1A). I marken klynger billen sine æg på et blad; her blev fire æg løsrevet fra et blad (figur 1B). Poppelstammesegmenterne og kimplanterne, der anvendes til axenisk insektopdræt, er vist i figur 2. Tarmen hos en 3. instar larve er vist i figur 3, og tarmsegmenter er markeret med hvide parenteser.
Selvom der ikke blev observeret bakteriekolonier i nogen kimfri gruppe, blev de observeret i alle konventionelt opdrættede grupper (figur 4), hvilket indikerer, at larver fra steriliserede æg, der blev fodret med vævskulturerede poppelblade, ikke indeholder bakterier. De ~ 1.500 bp PCR-bånd optrådte i alle konventionelt opdrættede grupper. I modsætning hertil blev der ikke observeret noget bånd i de kimfrie grupper eller den negative kontrol (figur 5), hvilket antyder, at der ikke eksisterede tarmbakterier i axeniske larver. Der var ingen forskelle i larveudviklingstid, overlevelsesrate eller udseende mellem kimfri og konventionelt opdrættede P. versicolora larver. Imidlertid var kropsmassen af kimfrie larver lidt højere end for konventionelt opdrættede larver på den 5. dag, selvom masserne vil blive ens før hvalp16. Disse resultater bekræftede gennemførligheden af denne protokol til at forberede og bagakseniske larver.
Figur 1: Livsstadier af pilebladbillen, Plagiodera versicolora. (A) Kvindelige og mandlige voksne; B) æg C) 1st instar larve D) 2. instar larve E) 3. instar larve og (F) puppe. Skalabjælker = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Poppelstammesegmenter og frøplanter. (A) Stammesegmenter med apikale knopper; B) stammesegmenter voksede rødder efter 10 dage C) en en måned gammel frøplante. Skalabjælker = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tarmen hos en tredje instar larve. Foregut, midgut og hindgut er mærket med parenteser. Skalabjælke = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Bekræftelse af effekten af eliminering af tarmbakterier ved dyrkning af tarm- eller hele insekthomogenater på LB-agarplader. Der blev ikke observeret bakterier i larver, der blev fodret med kimfrie poppelblade, mens bakterier blev observeret i konventionelt opdrættede grupper. 1st, 2nd og 3rd instar larver blev brugt til analysen. Tre larver blev tilfældigt udvalgt i hver gruppe. Forkortelser: GF = kimfrie larver; CR = konventionelt opdrættede larver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Bekræftelse af effekten af eliminering af tarmbakterier ved PCR-assay ved anvendelse af universelle 16S rRNA-genprimere. Målbåndet for 16S rRNA-genet er ~ 1.500 bp. 1st, 2nd og 3rd instar larver blev brugt til analysen. Der blev ikke observeret noget målbånd i GF-grupperne. Forkortelser: NC = negativ kontrol; GF = kimfri; CR = konventionelt opdrættet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremstilling af kimfrie larver og opnåelse af gnobiotiske larver ved at genindføre specifikke bakteriestammer er kraftfulde metoder til at belyse de mekanismer, der ligger til grund for værtsmikrobeinteraktioner. Nyklækkede larver opnår tarmmikrobiota på to hovedmåder: vertikal transmission fra moderen til afkom eller vandret erhvervelse fra søskende og miljøet34. Førstnævnte kan opfyldes ved forældreoverførsel til afkom gennem forurening af ægoverfladen35. Det er således meget muligt at opnå axeniske larver ved at sterilisere insektægoverflader 27,28,29. Administration af en cocktail af flere antibiotika er en anden måde at udvikle axeniske insekter på, men har flere ulemper28. I modsætning hertil er ægoverfladesterilisering efterfulgt af en axenisk diæt bedre til udvikling af axeniske insekter 23,28,29.
Æggene fra de fleste bladforbrugende biller er synlige, let erhvervede og enkle at desinficere. Dette er hovedårsagen til, at et simpelt reagens (75% ethanol) og kortere tid (8 min) blev anvendt til desinfektion sammenlignet med lignende undersøgelser (f.eks. 40 minutters ægdesinfektion til stinkbug Plautia stali med 75% ethanol og formaldehyd for at opnå axeniske insekter; 6 min ægoverfladesterilisering af Drosophila med 1% aktivt chlor og 75% ethanol; og 10 minutters ægoverfladesterilisering af rød palmevæv Rhynchophorus ferrugineus med 10% natriumhypochlorit opløsning)23,29,36. For insektarter med små æg skal brugen af desinfektionsmidler og steriliseringsvarighed optimeres, da behandlingen kan påvirke resultaterne betydeligt.
I nogle tilfælde anvendes kimfri kunstig kost til axenisk insektopdræt efter sterilisering af ægoverfladen29,37. At udvikle en passende kunstig kost til insekter er imidlertid en kedelig og arbejdskrævende proces. Næringsstoffer i kosten påvirker i vid udstrækning insektfysiologi (f.eks. Udviklingstid, immunitet) og tarmmikrobiota 6,35. Således bør en kvalificeret kunstig diæt til et insekt indeholde en lignende ernæringsmæssig sammensætning som den naturlige mad, hvilket er vanskeligt at opnå, især for fytofagiske insekter. I denne protokol fodrede vi insekter med axeniske værtsplanter, som overvinder manglerne ved en kunstig kost. Det er vigtigt, at det som med poppelplanten, der anvendes her, heller ikke er svært at opnå vævsdyrkede frøplanter fra mange økonomisk vigtige afgrøder såsom tobak, kartoffel, tomat, hvede og ris ved frøoverfladesterilisering eller desinfektion af stammeafsnit38. Bemærk, at endofytter i planter kan eksistere i vævsdyrkede frøplanter39 og kan elimineres gennem shoot tip meristem kultur teknologi40. Afslutningsvis giver denne protokol en ny metode til at opretholde bakteriefrie insekter, som er et praktisk værktøj til at lette insekt-tarmbakterieinteraktionsundersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (31971663) og Young Elite Scientists Sponsorship Program af CAST (2020QNRC001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
| 250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
| 50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
| 500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
||
| 75% ethanol | Xingheda trade | ||
| α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
| Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
| Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
| Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
||
| Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
||
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
| Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
| pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
| Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
| Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Plastic box | 2.35 L | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
| Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
References
- Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Tokuda, G., et al. Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
- Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).
- Salem, H., et al. Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host. Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838 (2014).
- Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).
- Cirimotich, C. M., et al. Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae. Science. 332 (6031), 855-858 (2011).
- Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation. Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).
- Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera. Insect Science. , (2021).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust. Nature. 403 (6772), 851 (2000).
- Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production. Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
- Jia, Y., et al. Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling. Nature Communications. 12 (1), 2698 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Xu, L., et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle. Microbiome. 9 (1), 98 (2021).
- Xu, L., et al. Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality. Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).
- Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. Potential applications of insect symbionts in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).
- Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites. BMC Microbiology. 16 (1), 202 (2016).
- Wang, S., et al. Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).
- Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Berasategui, A., et al. Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness. Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).
- Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-protocol. 9 (24), 3456 (2019).
- Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Science. 1, 7 (2001).
- Bengtson, D. A. A comprehensive program for the evaluation of artificial diets. Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).
- Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant. Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).
- Ishihara, M., Ohgushi, T. Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).
- Bright, M., Bulgheresi, S. A complex journey: transmission of microbial symbionts. Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Hosokawa, T., et al. Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations. Nature Microbiology. 1, 15011 (2016).
- Habineza, P., et al. The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism. Frontiers in Microbiology. 10, 1212 (2019).
- Meilan, R., Ma, C.
- Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).
- Grout, B. W.
