Summary
Aksenik bir böcek elde etmek için, yumurta yüzeyi sterilize edilir ve yumurtadan çıkan larva daha sonra aksenik yapraklar kullanılarak yetiştirilir. Bu yöntem, antibiyotik uygulamadan veya diğer yaprak yiyen böceklere de uygulanabilen yapay bir diyet geliştirmeden aksenik böcek preparatı için etkili bir yol sağlar.
Abstract
Böcek bağırsakları, konağın fizyolojik özelliklerini derinden etkileyebilecek çeşitli bakteriler tarafından kolonize edilir. Belirli bir bakteri suşunu aksenik bir böceğe sokmak, bağırsak mikrobiyal fonksiyonunu doğrulamak ve bağırsak mikrobu-konakçı etkileşimlerinin altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için güçlü bir yöntemdir. Antibiyotik uygulamak veya yumurta yüzeylerini sterilize etmek, bağırsak bakterilerini böceklerden uzaklaştırmak için yaygın olarak kullanılan iki yöntemdir. Bununla birlikte, antibiyotiklerin böcekler üzerindeki potansiyel olumsuz etkilerine ek olarak, önceki çalışmalar, beslenme antibiyotiklerinin bağırsak bakterilerini ortadan kaldıramayacağını göstermiştir. Bu nedenle, mikropsuz yapay diyetler genellikle doğal gıdalardaki besin bileşenlerine tam olarak benzeyemeyen sıkıcı ve emek yoğun bir süreç olan aksenik böcekleri korumak için kullanılır. Burada tarif edilen, bir yaprak böceğinin (Plagiodera versicolora) aksenik larvalarını hazırlamak ve sürdürmek için etkili ve basit bir protokoldür. Spesifik olarak, böcek yumurtalarının yüzeyleri sterilize edildi, ardından aksenik larvaları desteklemek için mikropsuz kavak yaprakları kullanıldı. Böceklerin aksenik durumu, kültüre bağımlı ve kültürden bağımsız analizlerle daha da doğrulandı. Toplu olarak, yumurta dezenfeksiyonu ve mikropsuz yetiştiriciliği birleştirerek, diğer yaprak yiyen böcekler için kolayca aktarılabilir bir araç sağlayan aksenik P. versicolora elde etmek için verimli ve uygun bir yöntem geliştirilmiştir.
Introduction
Memelilere benzer şekilde, böcek sindirim sistemi, gıda sindirimi ve emilimi için bir boşluktur. Çoğu böcek, bağırsaklarında gelişen ve konakçılar tarafından sağlanan beslenmeyle yaşayan çeşitli kommensal bakterileri barındırır1. Bağırsak komensal topluluğu, gıda sindirimi ve detoksifikasyonu 2,3,4, beslenme ve gelişme 5,6,7, patojenlere ve parazitlere karşı savunma 8,9,10,11, kimyasal iletişim 12,13 ve davranışlar 14 dahil olmak üzere böceklerdeki çoklu fizyolojik süreçler üzerinde derin bir etkiye sahiptir. ,15. İlginçtir ki, bazı bağırsak mikrobiyotaları fakültatif olarak patojenik olabilir veya enfeksiyonu şiddetlendirmek için patojenleri istila ederek manipüle edilebilir, bu da bağırsak bakterilerinin bazı durumlarda zararlı olabileceğini gösterir16,17,18. Bağırsak bakterileri ayrıca biyoteknik uygulamalar ve haşere yönetimi için mikrobiyal bir kaynak olarak da hizmet edebilir. Örneğin, fitofajlı ve ksilofajik böceklerden gelen lignoselüloz sindiren bakteriler, biyoyakıt geliştirmek için bitki hücrelerini sindirmek için kullanılmıştır19. Biyoaktif molekülleri ifade eden mühendislik ürünü bağırsak simbiyontlarının dağılımı, tarım ve ormancılık zararlılarını ve bulaşıcı hastalıkları ileten sivrisinekleri yönetmek için yeni ve umut verici bir taktiktir 19,20,21, faydalı böceklerin uygunluğunu artırmak için de kullanılabilir 22. Bir bağırsak bakterisinin in vivo olarak nasıl davrandığını göstermek, işlevini tam olarak kullanmak ve çeşitli uygulamalar için daha fazla kullanmak için bir öncelik olarak kabul edilir.
Hayvanlar bağırsakta 1 ila 1000 > simbiyotik mikrobiyal türbarındırabilir 1. Sonuç olarak, bireysel bakteri taksonlarının veya montajlarının bir hayvanın içinde nasıl performans gösterdiğini ve konakçının veya mikrobiyal ortaklarının belirli bir işlevi sürdürüp sürdürmediğini doğru bir şekilde doğrulamak zordur. Bu nedenle, mono- veya çok türlü kolonizasyon yoluyla gnotobiyotik böcekler elde etmek için aksenik larvaların hazırlanması, bakteriyel fonksiyonu ve böceklerle etkileşimi araştırmak için gereklidir23. Şu anda, antibiyotik kokteyllerinin uygulanması ve böcek yumurtalarının yüzeyinin sterilize edilmesi, bağırsak bakterilerini gidermek için yaygın yöntemlerdir 14,24,25,26. Ancak antibiyotik diyetleri bağırsak bakterilerini tamamen yok edememekte ve konakçı böcek fizyolojisi üzerinde olumsuz etki yaratmaktadır27,28. Sonuç olarak, antibiyotik ile tedavi edilen böceklerin kullanımı, bazı bağırsak bakterilerinin gerçek yeteneklerini gizleyebilir. Neyse ki, yumurtaların yüzey sterilizasyonu, deneysel böcekler üzerinde hiçbir etkisi olmayan veya ihmal edilebilir etkileri olan bu sorunu23,29 olumsuzlayabilir. Ayrıca, yapay diyetler doğal böcek gıdalarına tam olarak benzeyemez ve yapay bir diyet geliştirmek maliyetli ve emek tüketen bir süreçtir30,31.
Söğüt yaprağı böceği, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), esas olarak söğütler (Salix) ve kavak (Populus L.) gibi tuzlu ağaçlarla beslenen yaygın bir yaprak yiyen zararlıdır. 32,33. Burada, söğüt yaprağı böceği, mikropsuz bir böceği hazırlamak ve yetiştirmek için bir protokol geliştirmek için temsili bir yaprak yiyen böcek olarak kullanılmıştır. Sterilize edilmiş yumurtalardan P. versicolora aksenik larvalarını arkaya doğru mikropsuz kavak yaprakları elde etmek için bitki doku kültüründen yararlandık. P. versicolora larvalarının aksenik durumu, kültüre bağımlı ve kültürden bağımsız tahlillerle doğrulandı. Bu protokol, vahşi durumu yapay bir diyetle böcek yetiştirmekten daha iyi taklit eden aksenik böcekleri koruyabilir. Daha da önemlisi, bu yöntem çok düşük bir maliyetle uygundur, bu da gelecekteki böcek-bağırsak mikrobiyota etkileşim çalışmaları için, özellikle de iyi gelişmiş yapay diyetler içermeyen model olmayan böcekler için aksenik böceklerin elde edilmesinin fizibilitesini arttırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Böcek yetiştiriciliği
- P. versicolora popülasyonunu bir büyüme odasında 27 °C ve 70 ±% 5 bağıl nem durumunda, 16 saat ışık / 8 saat karanlık fotoperiyodu ile koruyun. Onları fayanslı ıslak emici kağıt ile delikli plastik kutulara yerleştirin ve taze kavak dallarıyla besleyin. Nemi korumak ve dalları her iki günde bir değiştirmek için emici kağıda temiz su püskürtün.
- Yavrudan sonra yumurtlama için yetişkinleri izole edin. Daha fazla yumurta elde etmek için onları yumuşak yapraklarla besleyin.
- Yeni bırakılan yumurtaları toplayın (24 saat içinde). Aksenik larvaları hazırlamak için yumurtaları 60 saat boyunca nemli emici kağıda yerleştirin.
NOT: Yeni serilmiş yumurtalar ~ 72 saat sonra yumurtadan çıkacaktır. Yumurta yüzeylerini sterilize etmek için en iyi zaman yumurtadan çıkmadan önceki gündür; Aksi takdirde, başarılı bir şekilde yumurtadan çıkan yumurtaların sayısı azalacaktır.
2. Mikropsuz kavak kültürü
- Murashige ve Skoog (MS) besiyeri ve 1 mg/mL α-naftalin asetik asit (NAA) stok çözeltileri hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu).
- Bir biyogüvenlik başlığında, 500 mL MS ortamına 50 μL 1 mg / mL NAA stok çözeltisi ekleyin, iyice karıştırmak için çalkalayın ve doku kültürü kabı başına ~ 50 mL dökün ve katılaşma için bekleyin.
- Neşter, alkol lambası ve forseps hazırlayın; biyogüvenlik başlığındaki alkol lambası alevindeki neşter ve forsepsleri sterilize edin.
- Kavak fidelerinden apikal tomurcuklar veya yanal tomurcuklar ile 3-4 cm gövde segmentlerini ~ 1 aylık büyümede kesin (mikropsuz doku kültürlü fideler) ve bunları kültür ortamına, kap başına bir veya iki kök segmentine yerleştirin.
- Bu kök segmentlerini 25 ° C'de bir büyüme odasında ve 50 ± 10 cd ışık yoğunluğunda, yaklaşık 30 gün boyunca 16 saat ışık / 8 saat karanlık fotoperiyodu ile inkübe edin. Aksenik larvaları beslemek için mikropsuz yaprakları kullanın.
3. Yumurta yüzeyi sterilizasyonu ve yetiştirme aksenik larvaları
- Otoklav Petri tabakları, boya fırçaları, filtre kağıdı, damıtılmış su ve LB (Luria-Bertani) agar ortamı içeren bir Petri kabı.
- Yapışkan yumurtalı yaprakları bir Petri kabına yerleştirin, forseps kullanarak yumurtaları yapraklardan dikkatlice çıkarın ve başka bir Petri kabına aktarın.
NOT: Bu adım çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır çünkü yumurtalar yapraklara yapışır. - Bu yumurtaları 8 dakika boyunca% 75 etanol ile yıkayın ve yıkamayı steril suyla dört kez tekrarlayın.
- Kuluçka için nemi korumak için yumurtaları LB agar ortamına aktarın.
NOT: LB agar ortamının kullanılması, dezenfekte edilen yumurtanın mikropsuz olup olmadığını doğrulamaya yardımcı olabilir. - Petri kabını bir büyüme odasına yerleştirin ve yumurtaların 24 saat içinde yumurtadan çıkmasını bekleyin.
- Bir biyogüvenlik başlığında, Petri kabına üç parça ıslak filtre kağıdı döşeyin, kağıda mikropsuz kavak yaprakları yerleştirin, larvaları toplayın ve yaprakların üzerine yerleştirin, Petri kabını parafilm ile kapatın ve 27 ° C'de bir büyüme odasında ve 70 ±% 5 bağıl nemde 16 saat ışık / 8 saat karanlık fotoperiyotla inkübe edin.
NOT: Doku kültürlü yapraklar hassastır ve hızlı bir şekilde su kaybedebilir. Bu nedenle, yaprakları Petri kabına aktarırken nemli filtre kağıdı kullanmak gerekir. - Yaprakları iki günde bir değiştirin.
- Geleneksel olarak yetiştirilen gruplar için, yumurtaları yapraklardan nemli filtre kağıdı içeren bir Petri kabına aktarın ve bu larvaları mikropsuz kavak yaprakları ile besleyin.
4. Aksenik larvaların kültüre bağımlı tahlillerle doğrulanması
- Mikropsuz ve geleneksel olarak yetiştirilen gruplardan rastgele üç adet 1st, 2 nd ve 3rd instar larvası seçin.
- 3. instar larvalarını steril makas ve forseps ile stereomikroskop altında disseke edin ve bağırsaklarını mikrosantrifüj tüplerinde toplayın. Tüplerde bozulmamış 1. ve 2. instar larvalarını toplayın.
NOT: 1. ve 2. instar larvalarının tamamını toplayın, çünkü bunlar diseke edilemeyecek kadar küçüktür ve bağırsaklarını sağlam tutun. - 1,5 mL tüplere 100 μL fosfat tamponlu salin ve üç çelik bilye ekleyin ve boncuk çırpan bir homojenizatör kullanarak dokuları homojenatlar halinde öğütün.
- LB agar ortamına 100 μL homojenat ekleyin ve steril bir cam yayma çubuğu kullanarak plakalayın.
- Plakaları 24 saat boyunca 37 ° C'ye yerleştirin ve bakteri kolonilerini gözlemleyin.
5. Aksenik bireylerin kültürden bağımsız tahlillerle doğrulanması
- Bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak dokuların toplam DNA'sını (bölüm 4'te elde edilen) çıkarın.
- DNA konsantrasyonunu 260 nm'de bir spektrofotometre kullanarak ölçün.
- PCR ile evrensel 16S rRNA primerleri kullanarak bakteriyel 16S rRNA genini yükseltin. Reaksiyon sistemini 18 μL 1.1x PCR ana karışımı ( Malzeme Tablosuna bakınız), 0.5 μL 27F astar (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0.5 μL 1495R primer (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') ve 100 ng şablon DNA ile kurun. PCR koşullarını 3 dakika boyunca 95 °C'ye ayarlayın; 30 s için 95 °C, 1 dakika için 55 °C ve 1 dakika için 72 °C'lik 28 döngü; ardından 10 dakika boyunca 72 °C takip eder. PCR ürünlerini bir sonraki analize kadar 4 °C'de saklayın.
- PCR ürünlerini nükleik asit boyası ile karıştırın ve 1x TAE tamponunda% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde elektroforez kullanarak analiz edin. Referans olarak 10 μL DNA belirteci kullanın.
- Jeli bir UV transilluminatörü ile gözlemleyin ve 1.500 bp civarında hedef parçayı arayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
P. versicolora'nın yaşam evreleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Yetişkin erkek, yetişkin dişiden daha küçüktür (Şekil 1A). Tarlada, böcek yumurtalarını bir yaprak üzerinde kümeler; burada bir yapraktan dört yumurta ayrılmıştır (Şekil 1B). Aksenik böcek yetiştiriciliği için kullanılan kavak sapı segmentleri ve fideleri Şekil 2'de gösterilmiştir. 3. instar larvasının bağırsağı Şekil 3'te gösterilmiştir ve bağırsak segmentleri beyaz parantezlerle işaretlenmiştir.
Herhangi bir mikropsuz grupta bakteri kolonisi gözlenmemesine rağmen, geleneksel olarak yetiştirilen tüm gruplarda gözlenmiştir (Şekil 4), doku kültürlü kavak yaprakları ile beslenen sterilize yumurtalardan elde edilen larvaların bakteri içermediğini göstermektedir. ~ 1.500 bp PCR bantları, geleneksel olarak yetiştirilen tüm gruplarda ortaya çıktı. Buna karşılık, mikropsuz gruplarda veya negatif kontrolde hiçbir bant gözlenmedi (Şekil 5), aksenik larvalarda bağırsak bakterisi bulunmadığını ima etti. Larva gelişim süresinde, hayatta kalma hızında veya mikropsuz ve geleneksel olarak yetiştirilen P. versicolora larvaları arasında görünüm açısından hiçbir fark yoktu. Bununla birlikte, mikropsuz larvaların vücut kütlesi, 5. günde geleneksel olarak yetiştirilen larvalarınkinden biraz daha yüksekti, ancak kitleler yavrulaşma16'dan önce benzer hale gelecektir. Bu sonuçlar, bu protokolün aksenik larvaları hazırlamak ve arka plana atmak için fizibilitesini doğruladı.
Resim 1: Söğüt yaprağı böceğinin yaşam evreleri, Plagiodera versicolora. (A) Kadın ve erkek yetişkinler; (B) yumurtalar; (C) 1. instar larvası; (D) 2. instar larva; (E) 3. instar larvası; ve (F) pupa. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Kavak sapı segmentleri ve fideleri. (A) Apikal tomurcuklu kök segmentleri; (B) kök segmentleri 10 gün sonra kök saldı; (C) Bir aylık fide. Ölçek çubukları = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Üçüncü bir instar larvasının bağırsağı. Foregut, midgut ve hindgut parantez ile etiketlenmiştir. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: LB agar plakaları üzerinde bağırsak veya bütün böcek homojenatlarının kültürlenmesiyle bağırsak bakterilerinin eliminasyonunun etkinliğinin doğrulanması. Larvalarla beslenen mikropsuz kavak yapraklarında bakteri gözlenmezken, geleneksel olarak yetiştirilen gruplarda bakteri gözlenmiştir. Tahlil için 1st, 2 nd ve 3rd instar larvaları kullanıldı. Her grupta rastgele üç larva seçildi. Kısaltmalar: GF = mikropsuz larva; CR = geleneksel olarak yetiştirilen larvalar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Evrensel 16S rRNA gen primerleri kullanılarak PCR testi ile bağırsak bakterilerinin eliminasyonunun etkinliğinin doğrulanması. 16S rRNA geninin hedef bandı ~ 1.500 bp'dir. 1st, 2 nd ve 3rd instar larvaları tahlil için kullanılmıştır. GF gruplarında hedef bant gözlenmedi. Kısaltmalar: NC = negatif kontrol; GF = mikropsuz; CR = geleneksel olarak yetiştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikropsuz larvaların hazırlanması ve spesifik bakteri suşlarının yeniden sokulmasıyla gnotobiyotik larvaların elde edilmesi, konakçı-mikrop etkileşimlerinin altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için güçlü yöntemlerdir. Yeni yumurtadan çıkan larvalar bağırsak mikrobiyotasını iki ana yolla elde eder: anneden yavrulara dikey geçiş veya kardeşlerden yatay edinim ve çevre34. İlki, yumurta yüzeyinin kirlenmesi yoluyla yavrulara ebeveyn transferi ile yerine getirilebilir35. Bu nedenle, böcek yumurtası yüzeylerini sterilize ederek aksenik larva elde etmek oldukça mümkündür27,28,29. Birkaç antibiyotikten oluşan bir kokteylin uygulanması, aksenik böcekler geliştirmenin başka bir yoludur, ancak birkaç dezavantajı vardır28. Buna karşılık, yumurta yüzeyi sterilizasyonu ve ardından aksenik bir diyet, aksenik böceklerin gelişimi için daha iyidir23,28,29.
Çoğu yaprak tüketen böceğin yumurtaları görülebilir, kolayca elde edilir ve dezenfekte edilmesi kolaydır. Benzer çalışmalara kıyasla dezenfeksiyon için basit bir reaktifin (% 75 etanol) ve daha kısa bir sürenin (8 dakika) kullanılmasının ana nedeni budur (örneğin,% 75 etanol ve aksenik böcekler elde etmek için% 75 etanol ve formaldehit ile kokuşmuş böcek Plautia stali için 40 dakika yumurta dezenfeksiyonu; % 1 aktif klor ve% 75 etanol ile Drosophila'nın 6 dakika yumurta yüzeyi sterilizasyonu; ve kırmızı palmiye böceği Rhynchophorus ferrugineus'un% 10 sodyum hipoklorit ile 10 dakika yumurta yüzeyi sterilizasyonu. çözüm)23,29,36. Küçük yumurtalı böcek türleri için, tedavi sonuçları önemli ölçüde etkileyebileceğinden, dezenfektörlerin kullanımı ve sterilizasyon süresinin optimize edilmesi gerekir.
Bazı durumlarda, yumurta yüzeyi sterilizasyonundan sonra aksenik böcek yetiştiriciliği için mikropsuz yapay diyetler kullanılır29,37. Bununla birlikte, böcekler için uygun bir yapay diyet geliştirmek sıkıcı ve emek tüketen bir süreçtir. Diyetteki besinler, böcek fizyolojisini (örneğin, gelişim süresi, bağışıklık) ve bağırsak mikrobiyotasını büyük ölçüde etkiler 6,35. Bu nedenle, bir böcek için nitelikli bir yapay diyet, özellikle fitofajlı böcekler için elde edilmesi zor olan doğal gıdaya benzer bir besin bileşimi içermelidir. Bu protokolde, böcekleri yapay bir diyetin eksikliklerinin üstesinden gelen aksenik konakçı bitkilerle besledik. Daha da önemlisi, burada kullanılan kavak bitkisinde olduğu gibi, tohum yüzey sterilizasyonu veya kök kesit dezenfeksiyonu yoluyla tütün, patates, domates, buğday ve pirinç gibi ekonomik açıdan önemli birçok üründen doku kültürlü fide elde etmek de zor değildir38. Not olarak, bitkilerdeki endofitler doku kültürlü fidelerde bulunabilir39 ve sürgün ucu meristem kültürü teknolojisi40 ile elimine edilebilir. Sonuç olarak, bu protokol, böcek-bağırsak bakteri etkileşim çalışmalarını kolaylaştırmak için kullanışlı bir araç olan mikropsuz böcekleri korumak için yeni bir yöntem sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31971663) ve CAST (2020QNRC001) tarafından Genç Elit Bilim İnsanları Sponsorluk Programı tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
| 250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
| 50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
| 500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
||
| 75% ethanol | Xingheda trade | ||
| α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
| Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
| Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
| Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
||
| Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
||
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
| Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
| pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
| Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
| Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Plastic box | 2.35 L | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
| Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
References
- Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Tokuda, G., et al. Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
- Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).
- Salem, H., et al. Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host. Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838 (2014).
- Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).
- Cirimotich, C. M., et al. Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae. Science. 332 (6031), 855-858 (2011).
- Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation. Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).
- Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera. Insect Science. , (2021).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust. Nature. 403 (6772), 851 (2000).
- Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production. Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
- Jia, Y., et al. Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling. Nature Communications. 12 (1), 2698 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Xu, L., et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle. Microbiome. 9 (1), 98 (2021).
- Xu, L., et al. Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality. Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).
- Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. Potential applications of insect symbionts in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).
- Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites. BMC Microbiology. 16 (1), 202 (2016).
- Wang, S., et al. Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).
- Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Berasategui, A., et al. Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness. Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).
- Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-protocol. 9 (24), 3456 (2019).
- Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Science. 1, 7 (2001).
- Bengtson, D. A. A comprehensive program for the evaluation of artificial diets. Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).
- Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant. Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).
- Ishihara, M., Ohgushi, T. Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).
- Bright, M., Bulgheresi, S. A complex journey: transmission of microbial symbionts. Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Hosokawa, T., et al. Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations. Nature Microbiology. 1, 15011 (2016).
- Habineza, P., et al. The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism. Frontiers in Microbiology. 10, 1212 (2019).
- Meilan, R., Ma, C.
- Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).
- Grout, B. W.
