Summary
Om een axeeninsect te verkrijgen, wordt het eioppervlak gesteriliseerd en wordt de uitgekomen larve vervolgens grootgebracht met behulp van axeenbladeren. Deze methode biedt een efficiënte manier voor axeeninsectenbereiding zonder antibiotica toe te dienen of een kunstmatig dieet te ontwikkelen, dat ook kan worden toegepast op andere bladetende insecten.
Abstract
Insectendarmen worden gekoloniseerd door diverse bacteriën die de fysiologische eigenschappen van de gastheer diepgaand kunnen beïnvloeden. Het introduceren van een bepaalde bacteriestam in een axeeninsect is een krachtige methode om de microbiële darmfunctie te verifiëren en de mechanismen op te helderen die ten grondslag liggen aan interacties tussen darmmicroben en gastheer. Het toedienen van antibiotica of het steriliseren van eioppervlakken zijn twee veelgebruikte methoden om darmbacteriën van insecten te verwijderen. Naast de mogelijke nadelige effecten van antibiotica op insecten, gaven eerdere studies echter aan dat het voeren van antibiotica darmbacteriën niet kon elimineren. Kiemvrije kunstmatige diëten worden dus over het algemeen gebruikt om axeeninsecten te behouden, wat een vervelend en arbeidsintensief proces is dat niet volledig kan lijken op voedingscomponenten in natuurlijk voedsel. Hier wordt een efficiënt en eenvoudig protocol beschreven om axeenlarven van een bladkever (Plagiodera versicolora) te bereiden en te onderhouden. In het bijzonder werden oppervlakken van de kevereieren gesteriliseerd, waarna kiemvrije populierenbladeren werden gebruikt om axeenlarven op te voeden. De axeenstatus van de insecten werd verder bevestigd door middel van cultuurafhankelijke en cultuuronafhankelijke testen. Gezamenlijk, door het combineren van eierdesinfectie en kiemvrije teelt, werd een efficiënte en handige methode ontwikkeld om axeen P. versicolora te verkrijgen, een gemakkelijk overdraagbaar hulpmiddel voor andere bladetende insecten.
Introduction
Net als bij zoogdieren is het spijsverteringskanaal van insecten een holte voor voedselvertering en -absorptie. De meeste insecten herbergen diverse commensale bacteriën die gedijen in hun darmen en leven van voeding geleverd door gastheren1. De darmcommensale gemeenschap heeft een diepgaande invloed op meerdere fysiologische processen bij insecten, waaronder voedselvertering en ontgifting 2,3,4, voeding en ontwikkeling 5,6,7, verdediging tegen pathogenen en parasieten 8,9,10,11, chemische communicatie 12,13 en gedragingen14 ,15. Intrigerend genoeg kunnen sommige darmmicrobiota facultatief pathogeen zijn of worden gemanipuleerd door pathogenen binnen te dringen om de infectie te verergeren, wat aangeeft dat darmbacteriën in sommige gevallen schadelijk kunnen zijn 16,17,18. Darmbacteriën kunnen ook dienen als een microbiële hulpbron voor biotechnische toepassingen en ongediertebestrijding. Lignocellulose-verterende bacteriën uit fytofagote en xylofagische insecten werden bijvoorbeeld gebruikt om plantencellen te verteren voor de ontwikkeling van biobrandstoffen19. De verspreiding van gemanipuleerde darmsymbionten die bioactieve moleculen tot expressie brengen, is een nieuwe en veelbelovende tactiek om land- en bosbouwplagen en muggen die infectieziekten overbrengen te beheren 19,20,21, die ook kunnen worden gebruikt om de fitheid van nuttige insecten te verbeteren 22. Illustreren hoe een darmbacterie zich in vivo gedraagt, wordt daarom als een prioriteit beschouwd om zijn functie volledig te benutten en verder te benutten voor verschillende toepassingen.
Dieren kunnen 1 tot >1000 symbiotische microbiële soorten in de darmherbergen 1. Als gevolg hiervan is het moeilijk om nauwkeurig te verifiëren hoe individuele bacteriële taxa of hun assemblage in een dier presteren en of de gastheer of zijn microbiële partners een specifieke functie aansturen. Daarom is het voorbereiden van axeenlarven om gnotobiotische insecten te verkrijgen door mono- of multi-species kolonisatie noodzakelijk om de bacteriële functie en interactie met insecten te onderzoeken23. Op dit moment zijn het toedienen van antibioticacocktails en het steriliseren van het oppervlak van insecteneieren gebruikelijke methoden om darmbacteriën te verwijderen 14,24,25,26. Antibioticadiëten kunnen darmbacteriën echter niet volledig elimineren en hebben een negatief effect op de fysiologie van gastheerinsecten27,28. Bijgevolg kan het gebruik van met antibiotica behandelde insecten de ware vermogens van sommige darmbacteriën verdoezelen. Gelukkig kan oppervlaktesterilisatie van eieren dit probleemtenietdoen 23,29, wat geen of verwaarloosbare effecten heeft op experimentele insecten. Bovendien kunnen kunstmatige diëten niet volledig lijken op natuurlijk insectenvoer en het ontwikkelen van een kunstmatig dieet is een kostbaar en arbeidsintensief proces30,31.
De wilgenbladkever, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), is een wijdverspreide bladetende plaag die zich voornamelijk voedt met heilzame bomen, zoals wilgen (Salix) en populier (Populus L.) 32,33. Hier werd de wilgenbladkever gebruikt als representatief bladetende insect om een protocol te ontwikkelen om een kiemvrij insect voor te bereiden en groot te brengen. We maakten gebruik van plantenweefselkweek om kiemvrije populierenbladeren te verkrijgen om P. versicolora axeenlarven uit gesteriliseerde eieren te kweken. De axeenstatus van P. versicolora-larven werd geverifieerd via cultuurafhankelijke en cultuuronafhankelijke testen. Dit protocol kan axeeninsecten in stand houden die de wilde toestand beter nabootsen dan het fokken van insecten met een kunstmatig dieet. Wat nog belangrijker is, deze methode is handig tegen zeer lage kosten, wat de haalbaarheid verhoogt van het verkrijgen van axeeninsecten voor toekomstige interactiestudies tussen insecten en darmmicrobiota, vooral voor niet-modelinsecten zonder goed ontwikkelde kunstmatige diëten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insectenopfok
- Houd de P. versicolora populatie in een groeikamer op de conditie van 27 °C en 70 ± 5% relatieve vochtigheid met een fotoperiode van 16 h licht/8 h donker. Leg ze in geperforeerde plastic dozen met betegeld nat absorberend papier en voer ze verse populierentakken. Spuit schoon water op absorberend papier om vocht vast te houden en ververs de takken om de twee dagen.
- Isoleer volwassenen voor ovipositie na verpopping. Voer ze zachte bladeren om meer eieren te krijgen.
- Verzamel nieuw gelegde eieren (binnen 24 uur). Leg de eieren gedurende 60 uur op vochtig absorberend papier om axeenlarven te bereiden.
OPMERKING: Nieuw gelegde eieren komen na ~ 72 uur uit. De beste tijd om eioppervlakken te steriliseren is de dag voor het uitkomen; anders zal het aantal met succes uitgekomen eieren afnemen.
2. Kiemvrije populieren kweken
- Bereid Murashige en Skoog (MS) medium en 1 mg/ml α-naftaleen azijnzuur (NAA) stamoplossingen (zie de tabel met materialen).
- Voeg in een bioveiligheidskap 50 μL 1 mg / ml NAA-stamoplossing toe aan 500 ml MS-medium, schud om goed te mengen en giet ~ 50 ml per weefselkweekcontainer en wacht op stolling.
- Bereid scalpels, alcohollamp en tang voor; steriliseer de scalpels en tangen in de alcohollampvlam in de bioveiligheidskap.
- Snijd 3-4 cm stengelsegmenten met apicale knoppen of laterale knoppen van populierenzaailingen bij ~ 1 maand groei (kiemvrije weefselgekweekte zaailingen) en breng ze in het kweekmedium, een of twee stengelsegmenten per container.
- Incubeer deze stengelsegmenten in een groeikamer bij 25 °C en 50 ± 10 cd lichtintensiteit met een fotoperiode van 16 h licht/8 h donker gedurende ongeveer 30 dagen. Gebruik de kiemvrije bladeren om de axeenlarven te voeden.
3. Sterilisatie van het eioppervlak en het fokken van axeenlarven
- Autoclaaf Petrischalen, verfborstels, filtreerpapier, gedestilleerd water en een petrischaal met LB (Luria-Bertani) agar medium.
- Leg bladeren met aanhangende eieren in een petrischaaltje, verwijder de eieren voorzichtig van de bladeren met een tang en breng ze over naar een andere petrischaal.
OPMERKING: Deze stap moet zeer voorzichtig worden uitgevoerd omdat de eieren zich aan de bladeren hechten. - Was deze eieren gedurende 8 minuten met 75% ethanol en herhaal de was vier keer met steriel water.
- Breng de eieren over op LB-agarmedium om vocht te behouden voor het uitkomen.
OPMERKING: Het gebruik van LB-agarmedium kan helpen om te controleren of het gedesinfecteerde ei kiemvrij is. - Plaats de petrischaal in een groeikamer en wacht tot de eieren binnen 24 uur uitkomen.
- Tegel in een bioveiligheidskap drie stukken nat filterpapier in een petrischaaltje, leg kiemvrije populierenbladeren op het papier, verzamel de larven en leg ze op de bladeren, sluit de petrischaal af met parafilm en incubeer ze in een groeikamer bij 27 °C en 70 ± 5% relatieve vochtigheid met een fotoperiode van 16 uur licht / 8 uur donker.
OPMERKING: De weefsel gekweekte bladeren zijn delicaat en kunnen snel water verliezen. Het gebruik van vochtig filterpapier is dus noodzakelijk bij het overbrengen van de bladeren naar de petrischaal. - Vervang de bladeren om de twee dagen.
- Breng voor de conventioneel gekweekte groepen de eieren van de bladeren over naar een petrischaal met vochtig filterpapier en voed deze larven met kiemvrije populierenbladeren.
4. Verificatie van axeenlarven met cultuurafhankelijke assays
- Selecteer willekeurig drie1e,2e en3e instarlarven uit de kiemvrije en conventioneel gekweekte groepen.
- Ontleed de3e instarlarven met een steriele schaar en tang onder een stereomicroscoop en verzamel hun ingewanden in microcentrifugebuizen. Verzamelintacte 1e en2e instarlarven in buizen.
OPMERKING: Verzamel hele1e en2e instarlarven omdat ze te klein zijn om te ontleden en houd hun ingewanden intact. - Voeg 100 μL fosfaat gebufferde zoutoplossing en drie stalen kogels toe aan buizen van 1,5 ml en maal de weefsels tot homogenaten met behulp van een kralenkerende homogenisator.
- Voeg 100 μL homogenaat toe aan LB-agarmedium en -plaat met behulp van een steriele glazen uitspreidstaaf.
- Plaats de platen gedurende 24 uur op 37 °C en observeer de bacteriekolonies.
5. Verificatie van axeen individuen met cultuuronafhankelijke assays
- Extraheer het totale DNA van weefsels (verkregen in sectie 4) met behulp van een DNA-extractiekit.
- Meet de DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer bij 260 nm.
- Versterk het bacteriële 16S rRNA-gen met behulp van universele 16S rRNA-primers met PCR. Stel het reactiesysteem in met 18 μL van 1,1x PCR-mastermix (zie de tabel met materialen), 0,5 μL 27F-primer (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0,5 μL 1495R-primer (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') en 100 ng template DNA. Stel de PCR-omstandigheden in op 95 °C gedurende 3 minuten; 28 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 1 minuut en 72 °C gedurende 1 minuut; gevolgd door 72 °C gedurende 10 min. Bewaar de PCR-producten bij 4 °C tot verdere analyse.
- Meng de PCR-producten met nucleïnezuurkleurstof en analyseer ze met behulp van elektroforese op een 1% agarosegel in 1x TAE-buffer. Gebruik 10 μL van een DNA-marker als referentie.
- Observeer de gel met een UV-transilluminator en zoek naar het doelfragment rond 1.500 bp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De levensfasen van P. versicolora zijn weergegeven in figuur 1. Het volwassen mannetje is kleiner dan het volwassen vrouwtje (figuur 1A). In het veld clustert de kever zijn eieren op een blad; hier werden vier eieren losgemaakt van een blad (figuur 1B). De populierenstengelsegmenten en zaailingen die worden gebruikt voor het fokken van axeeninsecten zijn weergegeven in figuur 2. De darm van een3e instarlarve is weergegeven in figuur 3 en darmsegmenten zijn gemarkeerd met witte beugels.
Hoewel er geen bacteriekolonies werden waargenomen in een kiemvrije groep, werden ze waargenomen in alle conventioneel gekweekte groepen (figuur 4), wat aangeeft dat larven uit gesteriliseerde eieren die weefsel gekweekte populierenbladeren kregen, geen bacteriën bevatten. De ~ 1.500 bp PCR-banden verschenen in alle conventioneel gekweekte groepen. Daarentegen werd geen band waargenomen in de kiemvrije groepen of de negatieve controle (figuur 5), wat impliceert dat er geen darmbacteriën bestonden in axeenlarven. Er waren geen verschillen in larvale ontwikkelingstijd, overlevingskans of uiterlijk tussen kiemvrije en conventioneel gekweekte P. versicolora-larven . De lichaamsmassa van kiemvrije larven was echter iets hoger dan die van conventioneel gekweekte larven op de5e dag, hoewel de massa's vergelijkbaar zullen worden vóór de verpopping16. Deze resultaten bevestigden de haalbaarheid van dit protocol voor het bereiden en achtervolgen van axeenlarven.
Figuur 1: Levensstadia van de wilgenbladkever, Plagiodera versicolora. (A) Vrouwelijke en mannelijke volwassenen; B) eieren; (C)1e instarlarve; D) 2e instarlarve; (E)3e instarlarve; en (F) pop. Schaalbalken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Populierenstengelsegmenten en zaailingen. (A) Stengelsegmenten met apicale knoppen; (B) stengelsegmenten groeiden na 10 dagen wortels; C) een zaailing van een maand oud. Schaalbalken = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De darm van een derde-instar larve. Foregut, midgut en hindgut zijn gelabeld met beugels. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Bevestiging van de werkzaamheid van de eliminatie van darmbacteriën door darm- of hele insectenhomogenaten op LB-agarplaten te kweken. Er werden geen bacteriën waargenomen in larven die kiemvrije populierenbladeren kregen, terwijl bacteriën werden waargenomen in conventioneel gekweekte groepen. Voor de test werden1e, 2e en 3e instarlarven gebruikt. Drie larven werden willekeurig geselecteerd in elke groep. Afkortingen: GF = kiemvrije larven; CR = conventioneel gekweekte larven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Bevestiging van de werkzaamheid van de eliminatie van darmbacteriën door pcr-assay met behulp van universele 16S rRNA-genprimers. De doelband van het 16S rRNA-gen is ~ 1.500 bp. 1st, 2nd en 3rd instar larven werden gebruikt voor de test. Er werd geen doelband waargenomen in de GF-groepen. Afkortingen: NC = negatieve controle; GF = kiemvrij; CR = conventioneel gekweekt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bereiding van kiemvrije larven en het verkrijgen van gnotobiotische larven door specifieke bacteriestammen opnieuw te introduceren, zijn krachtige methoden om de mechanismen die ten grondslag liggen aan gastheer-microbe-interacties op te helderen. Pas uitgekomen larven verkrijgen darmmicrobiota op twee belangrijke manieren: verticale overdracht van de moeder naar het nageslacht of horizontale acquisitie van broers en zussen en de omgeving34. De eerste kan worden vervuld door ouderlijke overdracht aan het nageslacht door besmetting van het eioppervlak35. Het is dus zeer goed mogelijk om axeenlarven te verkrijgen door insecteneioppervlakken te steriliseren 27,28,29. Toediening van een cocktail van verschillende antibiotica is een andere manier om axeeninsecten te ontwikkelen, maar heeft verschillende nadelen28. Daarentegen is sterilisatie van het eioppervlak gevolgd door een axeendieet beter voor het ontwikkelen van axeeninsecten 23,28,29.
De eieren van de meeste bladverslindende kevers zijn zichtbaar, gemakkelijk te verkrijgen en eenvoudig te desinfecteren. Dit is de belangrijkste reden waarom een eenvoudig reagens (75% ethanol) en een kortere tijd (8 min) werden gebruikt voor desinfectie in vergelijking met vergelijkbare studies (bijv. 40 min eierdesinfectie voor stinkbug Plautia stali met 75% ethanol en formaldehyde om axeeninsecten te verkrijgen; 6 min eioppervlaksterilisatie van Drosophila met 1% actief chloor en 75% ethanol; en 10 min eioppervlaksterilisatie van rode palmkever Rhynchophorus ferrugineus met 10% natriumhypochloriet oplossing)23,29,36. Voor insectensoorten met kleine eieren moet het gebruik van desinfectiemiddelen en de sterilisatieduur worden geoptimaliseerd, omdat de behandeling de resultaten aanzienlijk kan beïnvloeden.
In sommige gevallen worden kiemvrije kunstmatige diëten gebruikt voor het fokken van axeeninsecten na sterilisatie van het eioppervlak29,37. Het ontwikkelen van een geschikt kunstmatig dieet voor insecten is echter een vervelend en arbeidsintensief proces. Voedingsstoffen in het dieet hebben een grote invloed op de insectenfysiologie (bijv. Ontwikkelingstijd, immuniteit) en darmmicrobiota 6,35. Een gekwalificeerd kunstmatig dieet voor een insect moet dus een vergelijkbare voedingssamenstelling bevatten als het natuurlijke voedsel, wat moeilijk te bereiken is, vooral voor fytofagote insecten. In dit protocol voedden we insecten met axeen waardplanten, wat de tekortkomingen van een kunstmatig dieet overwint. Belangrijk is dat, net als bij de populierenplant die hier wordt gebruikt, het ook niet moeilijk is om weefselgekweekte zaailingen te verkrijgen van veel economisch belangrijke gewassen zoals tabak, aardappel, tomaat, tarwe en rijst door sterilisatie van het zaadoppervlak of desinfectie van stengelsectie38. Van belang is dat endofyten in planten kunnen voorkomen in weefselkweekte zaailingen39 en kunnen worden geëlimineerd door middel van scheutpunt meristeemkweektechnologie40. Kortom, dit protocol biedt een nieuwe methode om kiemvrije insecten te behouden, wat een handig hulpmiddel is om interactiestudies tussen insecten en darmbacteriën te vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (31971663) en het Young Elite Scientists Sponsorship Program door CAST (2020QNRC001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
| 250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
| 50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
| 500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
||
| 75% ethanol | Xingheda trade | ||
| α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
| Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
| Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
| Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
||
| Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
||
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
| Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
| pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
| Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
| Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Plastic box | 2.35 L | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
| Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
References
- Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Tokuda, G., et al. Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
- Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).
- Salem, H., et al. Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host. Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838 (2014).
- Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).
- Cirimotich, C. M., et al. Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae. Science. 332 (6031), 855-858 (2011).
- Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation. Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).
- Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera. Insect Science. , (2021).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust. Nature. 403 (6772), 851 (2000).
- Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production. Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
- Jia, Y., et al. Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling. Nature Communications. 12 (1), 2698 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Xu, L., et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle. Microbiome. 9 (1), 98 (2021).
- Xu, L., et al. Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality. Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).
- Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. Potential applications of insect symbionts in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).
- Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites. BMC Microbiology. 16 (1), 202 (2016).
- Wang, S., et al. Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).
- Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Berasategui, A., et al. Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness. Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).
- Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-protocol. 9 (24), 3456 (2019).
- Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Science. 1, 7 (2001).
- Bengtson, D. A. A comprehensive program for the evaluation of artificial diets. Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).
- Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant. Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).
- Ishihara, M., Ohgushi, T. Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).
- Bright, M., Bulgheresi, S. A complex journey: transmission of microbial symbionts. Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Hosokawa, T., et al. Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations. Nature Microbiology. 1, 15011 (2016).
- Habineza, P., et al. The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism. Frontiers in Microbiology. 10, 1212 (2019).
- Meilan, R., Ma, C.
- Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).
- Grout, B. W.
