Summary
ACT1-CUP1-analysen, et kobbervækstassay, giver en hurtig aflæsning af precursor messenger RNA (pre-mRNA) splejsning og den indvirkning, mutante splejsningsfaktorer har på splejsningsfunktionen. Denne undersøgelse giver en protokol og fremhæver den tilpasning, der er mulig for at løse splejsningsspørgsmålet af interesse.
Abstract
Mutationer introduceret i spliceosomet eller dets substrat har bidraget væsentligt til vores forståelse af forviklingerne ved splejseosomal funktion. Uanset om de er sygdomsrelaterede eller funktionelt udvalgte, er mange af disse mutationer blevet undersøgt ved hjælp af vækstassays i modelorganismen Saccharomyces cerevisiae (gær). Det splejsningsspecifikke kobbervækstassay eller ACT1-CUP1-assay giver en omfattende analyse af mutation på fænotypisk niveau. ACT1-CUP1-analysen bruger journalister, der giver kobbertolerance, når de er korrekt splejset. I nærværelse af kobber korrelerer ændringer i gærlevedygtighed således med ændringer i mRNA-produktion gennem splejsning. I et typisk eksperiment udfordres gærsplejsningsomet med forskellige ikke-konsensussplejsningsreportere og splejsningsfaktormutationen af interesse for at opdage enhver synergetisk eller antitetisk indvirkning på splejsning. Her gives en fuldstændig beskrivelse af kobberpladeforberedelse, plettering af gærceller og dataevaluering. Et udvalg af gratis eksperimenter er beskrevet, hvilket fremhæver alsidigheden af ACT1-CUP1-journalisterne. ACT1-CUP1-analysen er et praktisk værktøj i splejsningsværktøjskassen takket være den direkte aflæsning af mutationseffekt(er) og de komparative muligheder fra den fortsatte brug i marken.
Introduction
Spliceosomet er en stor, biologisk maskine, der katalyserer fjernelsen af introns, ikke-kodende regioner i precursor messenger RNA (pre-mRNA)1,2. At karakterisere effekten af en enkeltpunktsmutant i 1 af de næsten 100 proteiner og 5 ikke-kodende RNA'er er ofte tvetydigt, når man studerer proteinet eller RNA'et isoleret. Ændringen i den muterede komponents funktion kan bedst evalueres in vivo i sammenhæng med det fulde, fungerende splejseosom.
Kobbervækstanalysen beskrevet her er en hurtig måling af splejsningseffektiviteten i Saccharomyces cerevisiae eller spirende gær. Udviklet af C.F. Lesser og C. Guthrie og udgivet i 1993, kombinerer dette assay letheden ved at arbejde med en simpel modelorganisme og den ligefremme aflæsning af cellelevedygtighed3. Levedygtigheden korrelerer med, hvor godt splejsningsomerne i disse celler kan genkende og splejse reporterudskriften.
Dette kobbervækstassay kaldes mere almindeligt ACT1-CUP1-analysen. Navnet ACT1-CUP1 stammer fra de to gener, der er smeltet sammen for at skabe en reporter af splejsningseffektivitet. ACT1 er gærens actingen, som udtrykkes meget og har en effektivt splejset intron 4,5. Cup1p er en kobberchelator, der binder kobber i cellen for at forhindre interferens med regelmæssige cellulære funktioner 6,7,8. ACT1-CUP1-reporteren indeholder disse gener i rækkefølge, således at CUP1 kun er i den korrekte læseramme, hvis præ-mRNA-splejsning af ACT1's intron forekommer (figur 1). Det resulterende fusionsprotein indeholder de første 21 aminosyrer af actin og cup1p-proteinet i fuld længde, hvilket øger gærens levedygtighed i et kobberrigt miljø3. Således resulterer en stigning i mængden af splejsning af reporteren i en højere koncentration af Cup1p og en højere kobbermodstand (figur 1). I sammenligning med andre reportergener påvirker CUP1 cellelevedygtigheden selv ved lave niveauer, har et bredt følsomhedsområde og kan bruges til direkte at vælge til splejsning af mutationer 3,6,7. Derudover er CUP1 ikke essentiel for standard gærvækst, og derfor påvirkes cellulær homeostase ikke under opsætningen til dette assay. Som supplement til sletnings- eller temperaturvækstassays giver ACT1-CUP1 information om virkningerne på splejsning under ellers optimale gærvækstbetingelser.
Spliceosomet genkender sit substrat gennem tre introniske sekvenser, nemlig 5'splejsningsstedet (5' SS), grenstedet (BS) og 3'splejsningsstedet (3' SS). Talrige ACT1-CUP1-journalister er blevet genereret, der indeholder ikke-konsensussekvenser på disse websteder. Et udvalg af de mest almindelige ACT1-CUP1-reportere er vist i figur 1 og tabel 1. Da splejsningssomet interagerer med hvert splejsningssted unikt på forskellige punkter i splejsningscyklussen, kan splejsningsprogrammets robusthed testes på forskellige trin baseret på, hvilken ikke-konsensusreporter der bruges. Ikke-konsensusreportere er opkaldt efter den muterede position inden for intron og den base, den blev muteret til. For eksempel er A3c en reporter med en mutation ved 5 'SS, specifikt position 3 fra konsensusadenosin til en cytosin. Denne reporter vil interagere stærkt med splejseosommutationer, der påvirker 5 'SS-udvælgelse og brug. I deres indledende undersøgelse bestemte Lesser og Guthrie, hvilke 5 'SS-mutationer der hæmmede splejsning3. Senere samme år blev ikke-konsensusreportere på alle tre splejsningssteder offentliggjort af Burgess og Guthrie i en suppressorskærm af mutationer i ATPase Prp16p9. Ved at sammenligne konsensus med ikke-konsensusjournalister har ACT1-CUP1-analysen været en vigtig nøgle til at forstå robustheden og selektiviteten af gærsplejsningsomet og til at udlede funktionen af andre eukaryoters splejsningsomer.
Da ikke-konsensus ACT1-CUP1-journalister sensibiliserer splejsningsomet til yderligere forstyrrelse, kan virkningen af en enkelt splejsningsfaktormutation karakteriseres gennem de journalister, den påvirker positivt eller negativt. Dette er blevet anvendt til splejsning af forskningsspørgsmål på forskellige måder. For det første kan og er ACT1-CUP1-analysen blevet brugt som en genetisk skærm for mutationer i splejsningsfaktorer. For eksempel tjener Prp8p, det største splejsningsprotein, som en platform, hvorpå RNA-kernen i splejseosomet katalyserer splejsningsreaktionen. Dette blev delvist udledt af, hvordan Prp8p-mutanter forbedrede eller reducerede splejsningen af forskellige ACT1-CUP1-journalister 10,11,12,13,14,15,16,17. Andre proteinkomponenter i splejseosomet er også blevet undersøgt ved anvendelse af ACT1-CUP1, herunder Hsh155p, Cwc2p, Cef1p og Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. De energiske tærskler for Prp16p og fire andre ATPaser involveret i spliceosomal overgang er også blevet undersøgt med dette assay 9,26,27,28,29,30. De små nukleare RNA'er (snRNA'er) er også blevet grundigt undersøgt ved hjælp af ACT1-CUP1 til at identificere de pre-mRNA-sekvenser, de koordinerer, og ændringerne i sekundær struktur, som snRNA'erne gennemgår under splejsning 3,31,32,33,34,35,36,37.
ACT1-CUP1-analysen kræver en gærstamme, hvor alle kopier af CUP1-genet er blevet slået ud. Da CUP1 kan have et højt kopinummer 6,38, kan forberedelse af en fuld knock-out-stamme kræve flere runder eller omfattende screening. Som et resultat er cup1Δ gærstammer ofte blevet delt mellem laboratorier, ligesom journalisterne.
Hvis mutation(er) i en splejsningsfaktor vurderes ud fra en plasmidkopi, skal vildtypegenet for denne faktor slås ud. Derudover bør gærbaggrunden give mulighed for udvælgelse af mindst to plasmider, en indeholdende en ACT1-CUP1-reporter, historisk på et leucin næringsstofudvælgelsesplasmid, og en indeholdende en mutation eller forstyrrelse i splejsningsmaskineriet, der vil blive undersøgt (figur 2). Normalt vil flere gærstammer, der hver bærer forespørgselssplejsningsforstyrrelsen (QSP) og en anden reporter, i et enkelt assay teste forespørgslens indvirkning på splejsning.
De uafhængige variabler i ACT1-CUP1-analysen gør det muligt for en forsker at vurdere sværhedsgraden af en QSP. Disse uafhængige variabler er koncentrationen af kobber og udvælgelsen af flere ikke-konsensussplejsende journalister. For det første, da gærstammerne dyrkes på plader, der indeholder en række kobberkoncentrationer (figur 2), omfatter oprettelsen af analysen valg af gradienten af anvendte koncentrationer. Undersøgelser kan bruge et kursus kobberkoncentrationsgradient til at få en indledende aflæsning af levedygtighed og derefter gentage analysen med en finere gradient for at identificere subtile levedygtighedsforskelle. Den anden variabel er den brede vifte af ACT1-CUP1-reportere, der er mulige at teste (figur 1 og tabel 1). Hvis QSP påvirker gærens levedygtighed forskelligt i nærværelse af en ikke-konsensusreporter versus vildtype, kan der drages en konklusion om, at QSP påvirker et trin i splejsning eller en region af splejsningen, der er vigtig under anerkendelsen eller behandlingen af den pågældende region i intron.
Gærværktøjskassen er omfattende, og ACT1-CUP1-analysen er en integreret del af splejsningsforskningen. ACT1-CUP1-analysen udføres ofte sammen med en mere dybtgående genetisk, strukturel og / eller biokemisk analyse af virkningen af en QSP. Da disse mere detaljerede undersøgelser generelt har en længere procedure og / eller højere pris, er en hyppig tilgang screening for interessante mutanter med ACT1-CUP1 først.
Forudsat her er en ACT1-CUP1 assay protokol, herunder kobberplade forberedelse. Dette assay giver forskere et indledende svar på en QSP's effekt på splejsning, og hvilke introniske regioner der er mest påvirket af forstyrrelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gærstamme konstruktion
- Generer eller opnå en S. cerevisiae-stamme , hvis baggrund inkluderer leu2 og cup1Δ. For at generere denne baggrund skal du bruge den veletablerede gærmetode, der anvender lithiumacetat og enkeltstrenget DNA39.
BEMÆRK: Haploide gærstammer kan indeholde en, to eller flere kopier af CUP1 6,38. Se genomisk information for den valgte gærstamme, når du designer knock-out primere til at flankere CUP1-genplaceringen (e). - Udfør en gærtransformation for at inkorporere QSP enten via genomisk inkorporering eller på et plasmid. Brug en veletableret protokol som dem, der er beskrevet i tidligere forskning40,41,42.
- Udfør en gærtransformation med den eller de resulterende stammer fra trin 1.2. for at tilføje det ønskede ACT1-CUP1 reporter plasmid.
BEMÆRK: Celler skal opretholdes på leucin drop-out (-Leu) plader og medier for at sikre opbevaring af ACT1-CUP1 reporter plasmider efter denne transformation. - Udfør trin 1.2. og 1.3. for hvert QSP og hvert ACT1-CUP1 reporterplasmid, der skal testes, herunder kontrolstammer.
2. Fremstilling af kobberplade
- Vælg et kobberkoncentrationsområde, der passer til de journalister, der skal testes (se tabel 1 for hyppigt anvendte journalisters dødelighed).
BEMÆRK: Et eksempel på et omfattende kobberkoncentrationsområde er 30 forskellige kobberkoncentrationer på 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM og 2,5 mM Cu2+. - Der fremstilles en stamopløsning på 1 M CuSO4 og sterilt filter gennem et 0,22 μm PES (polyethersulfon) sterilt filter.
- Pr. ønsket kobberplade fremstilles en 2 ml fortynding af CuSO 4-stammen i sterilt vand.
BEMÆRK: Da pladen med 0 mM Cu 2+ altid vil blive analyseret og afbildet som reference, anbefales det at lave to 0 mM Cu2+ plader, en i begyndelsen og en i slutningen af belægningstrinnet (trin 3.4.).- Mængden af lager for den endelige ønskede kobberkoncentration beregnes i 40 ml af pladevolumenet (supplerende tabel 1).
- Tilsæt den beregnede mængde sterilt vand og 1 M CuSO4-lager til et sterilt 2 ml rør.
- Hæld plader til ACT1-CUP1-analysen.
BEMÆRK: Et alternativ til nedenstående protokol er først at kombinere medier og agar i en stor beholder og aliquot efter autoklavering i mindre beholdere for at opnå forskellige kobberkoncentrationer for hver plade. Uanset hvilken metode der vælges, er det vigtigt at sikre, at mediekoncentrationen er konsistent mellem alle pladerne, på trods af at hver har en anden kobberkoncentration.- Mærk hver tom plade, der skal hældes, med den endelige kobberkoncentration, den indeholder. Der fremstilles mindst én kvadratisk plade pr. kobberkoncentration, der skal testes.
- Mærk en 100 ml flaske pr. kobberkoncentration, der skal testes.
- Til hver flaske tilsættes 790 mg agar (2% w/v agar) og en rørestang.
- I et stort bægerglas kombineres -Leu-vækstmediet til alle kobberplader, der skal hældes. Pr. plade, der skal fremstilles, opløses 265 mg gærkvælstofbase (YNB) og 64 mg drop-out-blanding minus leucin (og andre næringsstoffer, der kan være nødvendige for at opretholde QSP-plasmidet i cellerne) i 34 ml deioniseret vand.
- Tilsæt 34 ml -Leu vækstmedieopløsning til hver forberedt 100 ml flaske og hætte med aluminiumsfolie. Mærk folien med den tilsigtede kobberkoncentration.
- Autoklave til sterilisering og opløsning af agar ved hjælp af den anbefalede væskecyklus til autoklaven.
- Tilsæt så hurtigt som muligt 4 ml 20% w/v glucose (sterilt filtreret) til hver flaske.
- Match etiketterne, og tilsæt 2 ml fortyndinger af CuSO4 til den tilsigtede flaske.
BEMÆRK: Da snesevis af kobberplader kan fremstilles på samme tid, hver med en anden koncentration, vil mærkning af alle flasker, rør og plader tydeligt med den tilsigtede kobberkoncentration forhindre forvirring under pladehældning. - Brug en røreplade til at blande i ~ 30 s og hæld eller pipet 35 ml i den mærkede plade, undgå bobler. Lad afkøle inden opbevaring eller brug.
BEMÆRK: Ofte fremstilles pladerne 1 dag eller 2 dage før analysen og opbevares ved 4 ° C indtil et par timer før brug. Pladerne skal være ved stuetemperatur (RT), før pletteringen begynder (trin 3.4.).
3. ACT1-CUP1 analyse
- Stribe de ønskede stammer på -Leu plader.
BEMÆRK: Hvis man arbejder fra kryolagre, skal man sørge for, at cellerne genoplives tilstrækkeligt fra opbevaring inden plettering. En anbefalet fremgangsmåde til dette er at stryge fra den kryogene bestand og lade den vokse i 3-5 dage ved 30 °C. Derefter skal du trække en lille farveprøve tilbage og lade den vokse i yderligere 2-3 dage ved 30 °C. - Dyrk kulturer natten over i 10 ml medier.
- Forbered -Leu-vækstmedier ved hjælp af de samme forhold som beskrevet i trin 2.4.2. Pr. 10 ml medie tilsættes 66 mg gærkvælstofbase (YNB) og 16 mg drop-out blanding minus leucin til 9 ml deioniseret vand. Pass gennem et 0,22 μm PES sterilt filter.
- Pr. gærstamme tilsættes 9 ml -Leu vækstmedier og 1 ml 20% w/v glucose (sterilt filtreret) til et sterilt 50 ml konisk rør.
- Brug en steril pind eller pipetspids til at samle en lille (~ 1 mm rund) gærprøve og pode mediet.
- Ryst alle overnatningskulturer ved 180 o / min og 30 ° C.
BEMÆRK: Hvis de er tilgængelige, kan rotatorer bruges i stedet for en ryster.
- Fortynd stammerne til en OD600 0,5 ± 0,05 i 10% glycerol.
- Pr. stamme tilsættes 100 μL kultur til en kuvette indeholdende 900 μL vand.
- Mål OD600 med et spektrofotometer.
- Den fortynding, der kræves, beregnes ved en OD600 på 0,5 i et slutvolumen på 2 ml.
- Fortynd hver stamme til OD600 0,5 i 10% glycerol (steril).
- Mål OD600 igen for at bekræfte, at celletætheden ligger inden for det ønskede område på 0,5 ± 0,05.
- Plade stammerne på kobberpladerne.
BEMÆRK: En række forskellige metoder kan bruges til at plade stammerne, herunder håndpipettering af 5-10 μL volumener, ved hjælp af en gentagelses- eller flerkanalspipettor eller stempling med en pinreplikator. Denne sidste metode er beskrevet nedenfor, selvom de fleste trin vil være ens uanset metoden.- Opret et sterilt arbejdssted og en tændt Bunsen-brænder.
- For en 48-benet replikator pipetteres 200 μL af hver fortyndet stamme i en separat brønd af en 96-brøndsplade. Fyld de tomme rum i 6 x 8 gitteret med 200 μL 10% glycerol (steril).
BEMÆRK: Et eksempel på en pletteringsordning for ni gærstammer findes i supplerende tabel 2. - Dyp replikatoren i en lav skål med 95% (v / v) ethanol og flamme for at sterilisere. Lad det køle af i mindst 2 minutter efter, at flammen er slukket for at undgå, at varmen chokerer cellerne.
- Placer fire plader i nærheden af brænderen, og fjern lågene.
- Dyp replikatoren i 96-brøndspladen, og løft den op i en hurtig bevægelse.
- Placer forsigtigt på pladen og rock let frem og tilbage for at lette en god overførsel.
- Løft op i en hurtig bevægelse og placer i nøjagtig samme retning i 96-brøndspladen.
- Gentag for op til tre andre plader. Gentag processen med at dyppe replikatoren i ethanol, flamme for at sterilisere og vente på at afkøle hver fjerde plade.
- Når en plade er blevet belagt, skal du bevæge dig med en jævn bevægelse til siden, men stadig inden for flammens steriliseringsparaply.
BEMÆRK: Det anbefales at gøre gærfortyndinger og plettering nær en flamme. Pladerne kan let blive forurenet under tørring. - Lad pladerne tørre helt, inden lågene sættes på, normalt 3-5 min.
- Pladerne inkuberes i 3 dage ved 30 °C.
4. Dataindsamling og analyse
- Fjern pladerne fra inkubatoren og inspicer dem visuelt.
- Optag billederne af pladerne med et tilgængeligt kamera eller andet digitalt billedbehandlingssystem.
- Registrer (eller score) for hver stamme observeres den sidste kobberkoncentration synlig vækst.
BEMÆRK: Cellerne er i stand til at splejse og forblive levedygtige indtil denne koncentration. For konsistens skal du altid bruge den samme metode, enten med øjet eller fra pladebillederne, for at score den sidste levedygtige kobberkoncentration. Meget små kolonier er undertiden synlige ved øjet, men ikke på billedet. Forskellen mellem direkte visuel inspektion eller optagelse fra billeder er lille, normalt et trin i gradienten. Da billeder af kolonierne ofte bruges i publikationer, anbefales det at score ved billederne. - Kombiner data fra flere ACT1-CUP1-assays for den samme stamme for at drage konklusioner om, hvordan QSP påvirker splejsning.
BEMÆRK: Publikationstal viser sædvanligvis billeder af gærkolonierne i koncentrationen 0 mM Cu2+ , den sidste levedygtige kobberkoncentration og den efterfølgende koncentration, hvor kolonien er død. Data kan også vises som et søjlediagram med fejllinjer for standardafvigelsen mellem replikater. Data behøver ikke at blive normaliseret, men kan være ved at indstille levedygtigheden af WT-splejsningsfaktorkontrollen til 1 og sammenligne effekten af den eller de indførte mutationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vækstanalyser, som ACT1-CUP1, kræver visuel, sammenlignende vurdering af flere kolonier. Her blev hver stamme dyrket til mætning natten over, fortyndet til en OD600 på 0,5 og belagt på 20 plader indeholdende en række kobberkoncentrationer fra 0 mM til 1,1 mM CuSO4 (figur 3). Dette interval er mindre end det, der er anført i protokollen, da det gav mulighed for en fuldstændig vurdering af virkningen af de QSP'er og ACT1-CUP1-reportere, der blev brugt og beskrevet nedenfor. Pladerne blev afbildet og scoret (figur 3 og supplerende tabel 3).
Til dette repræsentative eksperiment inkluderer gærbaggrunden et forstyrret ADE2-gen , hvilket resulterer i, at kolonierne er forskellige nuancer af rødt (figur 3A, B). Denne almindelige gærforstyrrelse i adenosinproduktionsvejen forårsager en opbygning af en rødpigmenteret forløber for adenosin. Således er den røde farve en indikator for gærkoloniens modenhed (dvs. mængden og alderen af de tilstedeværende celler). Med henblik på et ACT1-CUP1-assay kan den røde farve tjene som en indikator for forurenende svampearter, hvis den er hvid eller gul i farven. Farven kan være en sekundær bekræftelse af kobbertolerance, da mere levedygtige kolonier vil være en dybere rød nuance.
Ved plettering med en pin replikator er der flere almindelige afvigelser. For det første er det muligt at oprette kolonier, der er ovalformede, hvis replikatoren løftes op, mens den bevæger sig til venstre eller højre (figur 3B, orange pil). Derudover kan mikrokolonier også dannes fra små dråber celleopløsning, hvis stiftreplikatoren bringes ind i en vinkel, eller hvis den rystes over pladen (figur 3B, rød pil). Ofte uskadelig, lejlighedsvis kan mikrokolonierne blandes med en stemplet koloni, og dette forhindrer fortolkning af denne koloni. Yderligere pletteringsproblemer inkluderer utilstrækkelig ventetid efter sterilisering for replikatorstifterne til afkøling og utilstrækkelig kontakt mellem pladen og stifterne, således at der opstår dårlig overførsel af kulturmediet. I begge tilfælde vil få, hvis nogen, celler vokse på pladen, herunder for kontrolstammerne, der indeholder vildtypereporteren. Som med ethvert vækstassay, uanset belægningsmetoden, er det vigtigt at udføre ACT1-CUP1 i tre eksemplarer for at bekræfte, at resultaterne er konsistente og repeterbare. Ideelt set bør disse forskellige replikater udføres på kobberplader fremstillet på forskellige tidspunkter for at sikre reproducerbarhed.
Til disse repræsentative eksperimenter blev A3c-reporteren valgt for at fremhæve virkningen af en ikke-konsensussekvens på kobbertolerance i mangel af yderligere splejseosomforstyrrelser. A3c reducerer signifikant mængden af produceret CUP1 mRNA, da det forstyrrer splejsningsomets evne til at genkende og udnytte 5 'SS15. Gær med A3c-reporteren overlevede til 0,15 mM Cu2+, mens vildtypereportercellerne opretholdt levedygtigheden til slutningen af det testede kobberkoncentrationsområde (figur 3C). Wildtype-reporteren, der indeholder celler, vokser til 2,5 mM Cu2+ uden indflydelse på levedygtigheden (data vises ikke).
U6 snRNA er en væsentlig katalytisk komponent i splejsningen. Flere undersøgelser har brugt ACT1-CUP1 til at studere den effekt, mutationer kan have på dette RNA 16,32,34. Duplikeret til denne undersøgelse blev tre U6 snRNA-sekvenser undersøgt, nemlig vildtypesekvensen (WT), position 57 substitueret fra en uridin til en cytosin (U57c) og position 57 substitueret fra en uridin til en adenosin (U57a) (figur 3 og figur 4). Kombineret med ACT1-CUP1-journalister, der påvirker de katalytiske trin i splejsning, blev det fastslået, at U57c favoriserer det første katalytiske trin, og U57a favoriserer progressionen til det andet trin 16,32.
For at oprette ACT1-CUP1-assayet blev der oprettet en stamme med den genomiske kopi af U6 snRNA slettet og U6 snRNA vildtype eller muterede sekvenser inkluderet på plasmider. Da U6 snRNA er en væsentlig komponent i cellen, blev tre separate transformationer brugt til først at slå det genomiske U6 snRNA ud, samtidig med at cellens levedygtighed blev opretholdt, efterfølgende introducere muterede U6 snRNA'er på plasmider og endelig tilføje ACT1-CUP1-journalisterne. Til den første transformation blev en cup1Δ gærstamme brugt til knock-out af den genomiske kopi af U6 snRNA, samtidig med at WT U6 snRNA blev tilføjet på et URA-selektionsmarkørplasmid for at opretholde levedygtigheden. En efterfølgende transformation tilføjede enten vildtype eller muteret U6 snRNA på et TRP-selektionsmarkørplasmid, der valgte mod URA-markøren via 5-FOA-selektion. Således blev der genereret tre cup1Δ gærstammer, hver med en af U6 snRNA-sekvenserne, nemlig WT, U57a og U57c. En endelig gærtransformation for hver stamme tilføjede en af de tre forskellige ACT1-CUP1 reporterplasmider, der skulle bruges i dette eksperiment. De udvalgte journalister var vildtypereporteren A3c og en mutation af grenstedets adenosin til guanin (BS-G). I alt ni stammer blev genereret til dette eksperiment, der hver indeholdt en U6 snRNA-sekvens og en ACT1-CUP1-reporter (supplerende tabel 4 og supplerende tabel 5).
Resultaterne viste, at de forskellige baser ved U6 snRNA-position 57 har unikke virkninger på splejseosomet i kombination med en 5 'SS- eller BS-mutation (figur 4). Både A3c- og BS-G-journalisterne hæmmer primært splejsning ved at stabilisere den første katalytiske trinkonformation14,15. Således er U57c en additiv mutation, der reducerer kobbertolerancen i kombination med en af disse journalister (figur 4B). I modsætning hertil øger U57a kobbertolerancen, fordi den fremmer progression til andet trin (figur 4B)16,32. BS-G-reporterstammens nedsatte kobbertolerance med U57a sammenlignet med U6 snRNA WT fremhæver en sandsynlig sekundær virkning af BS-G på det andet trin af splejsning16.
Disse resultater fremhæver også den kvalitative karakter af denne analyse, og hvorfor wild-type forespørgsel og reporter sekvenser bør testes. Mens det generelle mønster af øget eller nedsat kobbertolerance gælder for disse U6 snRNA-mutationer sammenlignet med vildtype U6 snRNA, kan den nøjagtige koncentration af kobber, som cellerne overlever, variere mellem undersøgelser (tabel 1) og varierede mellem disse repræsentative data og andre offentliggjorte resultater. Dette skyldes sandsynligvis baggrunden for stammen, der indeholder CUP1-sletningen , men kan også skyldes stammernes generelle sundhed før plettering (dvs. hvor hurtigt efter generering af stammen eller restreak fra cryo analysen blev udført), forskelle i, hvordan pladerne fremstilles, og variabilitet mellem forskellige inkubatorer. En lignende varians blev noteret i Mayerle et al. for Prp8-forespørgselsmutationer i litteraturen43. Således kan sammenligning af kobbertolerancetendenser udføres for forskellige ACT1-CUP1-assays, men den numeriske sammenligning af kobberkoncentrationerne bør kun udføres inden for samme laboratorium og til tider med det samme sæt kobberplader.
Figur 1: ACT1-CUP1 reporter design. Koncentrationen af splejset reporter korrelerer direkte med gærkobbertolerance. Diagrammet over reporteren inkluderer de tre splejsningssteder på 5'splejsningsstedet (5' SS), grenstedet (BS) og 3' splejsningsstedet (3' SS). Gærkonsensussekvenserne for disse websteder vises, med dem, der er målrettet mod spaltning, angivet med fed skrift og nummereret baseret på deres placering i intronen. Almindeligt anvendte ikke-konsensus ACT1-CUP1 reportersekvenser vises med små bogstaver under deres tilsvarende konsensussekvensplaceringer og er angivet i tabel 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: ACT1-CUP1 assay workflow. Til dette assay skal en gærstamme være cup1Δ leu2 og indeholde det ønskede ACT1-CUP1 reporterplasmid og QSP-genet, mærket Gene i figuren. QSP-genet skal enten indsættes genomisk eller på et plasmid. Protokollen ved hjælp af en pin-replikator involverer fire trin til at forberede gærcellerne. Trin 1 er at dyrke cellerne til mætning. Trin 2 er at måle OD600 af kulturen og fortynde til en OD600 på 0,5. Trin 3 er at fordele over en 96-brøndsplade. Trin 4 er at plade på plader indeholdende stigende koncentrationer af kobber (angivet med stigende blå farve). Trin 1, trin 2 og trin 4 ville være identiske for håndpipettering. Når pladerne er belagt, inkuberes de i 3 dage ved 30 °C og scores derefter for levedygtighed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative visninger af ACT1-CUP1-data. Til dette eksperiment udfordres gærsplejsningsomer med to forskellige U6 snRNA-mutationer og testes i nærværelse af tre ikke-konsensusrapporter. Tre replikater af dette assay præsenteres på de samme plader til demonstrationsformål. Det anbefales, at dette assay replikerer på separate plader og på separate dage. (A) Der vises et afsluttet assay med en kobbergradient på 0 mM til 1,1 mM over 20 plader. Når kobberkoncentrationen stiger, viser stammer med lavere splejsning nedsat sammenløb til det punkt, hvor kobberkoncentrationen bliver dødelig. Gærbaggrunden var ade2, og dermed er modne kolonier røde i farven. (B) Sammenligning af de samme plader ved 0 mM og 0,1 mM CuSO4 afbildet med et håndholdt kamera versus et digitalt billedbehandlingssystem. Dette er et eksempel på, hvordan en række ikke-konsensusjournalister kan sammenlignes side om side og med vildtypejournalisten. Almindelige observationer på plader inkluderer en falsk dråbe kulturmedier, der faldt fra stiftreplikatoren (rød pil) og let ovalering af kolonierne på grund af glidning af stiften langs pladens overflade eller bevægelse af pladen, før kulturdråben er tørret tilstrækkeligt (orange pil). (C) Eksempel på A3c-indberetterens indvirkning på cellelevedygtigheden sammenlignet med vildtypereporteren. Billeder som dem, der er vist i (B), beskæres og justeres for at fremhæve vækstforskellene ved forskellige kobberkoncentrationer. Kobbertolerancen for A3c-reporterstammen falder til 0,15 mM Cu2+ sammenlignet med vildtypereporterstammens levedygtighed til slutningen af det testede område. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative ACT1-CUP1-resultater, der overvåger splejsning i gær med splejsningskomponentmutationer . (A) Skematisk af RNA-komponenterne i det aktive sted umiddelbart efter det første katalytiske trin. U2 og U6 snRNA'erne er duplexed, hvilket bringer 5 'SS og BS af intron i nærheden. Den introniske binding mellem A259 (BS) og G1 (5' SS) er angivet med den orange prik. Placeringen af de ikke-konsensussekvenssubstitutioner i ACT1-CUP1-reporteren, der blev testet i dette eksperiment, er angivet med fed skrift. Den muterede position i U6 snRNA (U57) er i fed grøn, og de substituerede baser er i enten blå eller lyserød. (B) En mulighed for præsentation af ACT1-CUP1-data i en publikation omfatter flere billeder af kolonier fra relevante Cu2+ koncentrationer. WT-reporteren overlevede forbi kobberkoncentrationen testet for alle tre U6 snRNA-stammer, der blev forespurgt. (C) Et søjlediagram, der sammenligner effekterne pr. reporter og pr. U6 snRNA-mutant. Normalisering udføres for hver ACT1-CUP1-reporter ved at indstille kobbertolerancen for U6 snRNA WT til 1 og beregne forholdet for U57c- og U57a-mutationerne. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen fra tre replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Yderligere metoder til at komplimentere ACT1-CUP1-resultater. (A) Primerforlængelse udføres via en primerudglødning i 3' ACT1 exon og forlænges derefter ind i intron. I dette eksempel er primeren slutmærket med IR700-farvestof, og primerforlængelsen blev udført som beskrevet i 20,21. Primerforlængelse af U6 snRNA udføres i samme reaktion for at tjene som en belastningskontrol. 7% 19: 1 bis / acrylamid, denatureringsgel løser præ-mRNA-, mRNA- og lariatprodukterne efter primerforlængelse ved hjælp af en nær infrarød gelbilleddannelsesenhed som beskrevet i van der Feltz et al.22. Intensiteten af de forskellige bånd kan bruges til at måle den samlede splejsningseffektivitet samt skelne mellem de splejsningsforskelle, der opstår ved første eller andet trin, som kvantificeret med ImageJ44 eller anden gelbåndskvantificeringssoftware. Både splejsningseffektiviteten og splejsningstrineffektiviteten beregnes som beskrevet i Query og Konarska14. (B) Mutationsskærme med ACT1-CUP1-reportere kan bruge kobberselektion til at identificere mutanter, der påvirker splejsning. Genet (e) af interesse kan derefter sekventeres i de resulterende stammer for at afgøre, om mutationen opstod i dette gen. (C) Der kan foretages ændringer til reporteren uden for splejsningsstederne for at overvåge splejsningsændringer i forhold til intronstruktur, exoniske sekvenser, antal exoner eller nuklear eksport af usplejset RNA. Regioner i gråt er valgfrie udvidelsesregioner, der skal medtages på en reporter, og områder med rødt er regioner, hvor rækkefølgen og strukturelle ændringer kan testes for deres potentielle indvirkning på splejsning ved hjælp af ACT1-CUP1-analysen. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Journalistens navn | Intronic-regionen | Sekvens | Sidste levedygtige Cu2+ koncentration (mM) | |
| WT | 5' | GUAUGU | > 2,5 | |
| G1a | 5ʹ | en UAUGU | 0,0133 eller 0,0532 | |
| A3c | 5ʹ | GUcUGU | 0,15^,18 eller 0,216 | |
| G5a | 5ʹ | GUAUaU | 0.303 eller 0.259 | |
| WT | Filial-websted | UACUAAC | > 2,5 | |
| C256a | Filial-websted | UAaUAAC | 0,1526 eller 0,1832 | |
| U257c/a | Filial-websted | UACc/aAAC | 0,226 eller 0,332 eller 0,545 | 0,059,32 |
| A258c/u | Filial-websted | UACUc / uAC | 0,826 | 1.045 eller 1.646 |
| BS-C | Filial-websted | UACUAcC | 0,153 eller 0,1832,56 eller 0,2 26 | |
| BS-G | Filial-websted | UACUAgC | 0,0516,32 eller 0,625 eller 0,846 | |
| C260g | Filial-websted | UACUAAg | 0,826 | |
| WT | 3' | UAG | > 2,5 | |
| U301g | 3ʹ | g AG | 0,1518 | |
| A302g/u | 3' | Ug/uG | 0,0139 | 0,07516 eller 0,1824 |
| G303c | 3ʹ | UAc | 0,0532 | |
Tabel 1: Liste over almindelige indberettere og den rapporterede Cu2+-koncentration. Der er over 100 citater af Lesser og Guthrie3. Mens et lille udvalg af disse citater blev brugt til at oprette denne tabel, fremhæver de den generelle tendens til små til moderate forskelle mellem undersøgelser i rapporterede kobberlevedygtighedskoncentrationer. I ACT1-CUP1 er det vigtigt at sammenligne vildtypeprotein eller RNA med mutanterne alle med samme gærstammebaggrund ved hjælp af de offentliggjorte koncentrationer som vejledning, men i forventning om, at de observerede koncentrationer kan variere. Data indsamlet fra figur 3 (^) og flere publikationer kommenteret med følgende citater 3,9,16,18,24,25,26,32,45,46.
Supplerende tabel 1: Indhold af en enkelt kobberplade og et eksempel på beregninger udført for at opnå kobberfortyndinger fra 0 mM til 2,5 mM fra en 1 M CuSO4-bestand . Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 2: Eksempel på et pletteringsskema for replikatoren med 48 ben. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 3: Eksempel på levedygtighed scoret fra kobberplader inkuberet i 3 dage ved 30 °C. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 4: Liste over gærstammer, der anvendes til at generere de repræsentative data. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 5: Liste over plasmider, der anvendes til at generere de repræsentative data. U6 snRNA-plasmider genereret og offentliggjort i tidligere forskning22,47. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ACT1-CUP1 er et vækstassay, og man skal sørge for, at observerede vækstforskelle kun kan tilskrives splejsningsdefekter. Alle stammer skal håndteres på en lignende måde inden plettering, herunder have en lignende længde og type vækst- og opbevaringsforhold. Hvis der anvendes temperaturfølsomme stammer, bør ACT1-CUP1-assays kun udføres under forhold, hvor disse stammer vokser sammenligneligt med vildtypen. Relateret anbefales det for QSP-komponenten at have identiske gærbaggrunde og ekspressionsniveauer for QSP-gen (er) for ikke at skygge for fortolkningen af resultaterne. Når man overvejer antallet af QSP'er og journalister, der skal bruges, anbefales det ikke at analysere mere end 30 stammer ad gangen med pin-replikatormetoden. Med den ekstra tid til at udføre hvert trin vil cellerne sætte sig, og analyseresultaterne vil være inkonsekvente på grund af nedsat cellelevedygtighed.
Ud over de begrænsninger, ACT1-CUP1 i sagens natur har som vækstanalyse, kan en QSP have en mere kompleks indvirkning på splejsning, end der kan løses med denne metode. Da splejsning er en proces i flere trin, og faktorer genbruges, kan den observerede fænotype resultere i, at forstyrrelsen påvirker mere end et splejsningstrin. Dette gælder også for de efterfølgende analyser, der kan følge op på ACT1-CUP1, hvoraf nogle er beskrevet nedenfor. Dataene vil fremhæve det mest forstyrrede trin i processen, selvom andre trin kan blive påvirket af den ændrede funktion af splejsningsfaktoren.
Primerudvidelse af ACT1-CUP1-reportere blev først brugt i Lesser og Guthries originale papir og udføres ofte, hvis ACT1-CUP1-resultaterne viser en vækstfejl3. Dette assay er rettet mod indberetteren og bruger længden af PCR-produkterne til at bestemme de relative mængder af ikke-splejset, delvist splejset og fuldt splejset reporter, der er til stede (figur 5A). Den samlede splejsningseffektivitet, og om defekten i højere grad påvirker det første eller andet katalytiske trin, beregnes ved at tage forhold mellem PCR-produktmængderne14. For eksempel har 5' SS-reporter G5a reduceret splejsning sammenlignet med wildtype-reporteren, men dens effektivitet i første og andet trin følger et lignende mønster som wild-type (figur 5A). Dette peger mod en defekt forud for det første katalytiske trin, muligvis i splejseosomsamling, fordi begge trin påvirkes på samme måde31.
Nye assays er udviklet fra det kanoniske ACT1-CUP1-assay, såsom screening for mutanter, der forbedrer splejsning i nærværelse af andre splejsningsfaktormutanter og / eller ikke-konsensussplejsningssekvenser (figur 5B). For eksempel udsatte gær indeholdende ACT1-CUP1-reporteren for UV og derefter valgte i nærværelse af kobber Prp8 og Hsh155 mutanter, der forbedrede splejsningen af ikke-konsensussekvenser14,19.
CUP1-vækstafhængighed er blevet udvidet ud over undersøgelsen af effekten af splejsningssteder og konstitutive splejsningsfaktorer og er blevet brugt til at studere flere intronsplejsninger, nuklear eksportkontrol og virkningen af UTR og andre perifere sekvenser på splejsning (figur 5C). Nogle af disse undersøgelser har skabt journalister med CUP1 og andre intronholdige gærgener, der kan have mere komplekse splejsningsmønstre for at studere effekten på intronisk sekundær struktur og multi-intron transkription, der splejser 48,49,50,51,52. Forbindelsen mellem splejsning og nuklear eksport blev undersøgt ved at have enten splejsede eller ikke-splejsede udskrifter, der koder for CUP1 i ramme53,54. Længden af pyrimidinsporet og splejsningsstedets afstandsafhængighed på grund af specifikke faktorer er også blevet testet 20,55,56,57. Disse eksempler og mange andre fremhæver alsidigheden af ACT1-CUP1 og andre CUP1 vækstanalyser.
ACT1-CUP1-analysen forbinder forstyrrelser med en kompleks reaktionscyklus med en ligetil vækstfænotype med et bredt følsomhedsområde. Dette ældre assay er blevet brugt af flere laboratorier til at lægge grundlaget for forståelsen af splejsningscyklussen. For nylig er ACT1-CUP1 blevet brugt til at besvare spørgsmål, der opstår som følge af det væld af strukturelle data, der nu er tilgængelige21,22,25. Strukturelle undersøgelser af splejseosomer bundet til ikke-konsensussekvenser kunne parres med ACT1-CUP1-resultater for at fortolke, hvordan ændret struktur og ændret funktion korrelerer. ACT1-CUP1 er en ideel første skærm til splejsning af mutationer, der kan supplere mere komplekse analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at afsløre.
Acknowledgments
Tak til Aaron Hoskins og Hoskins-laboratoriemedlemmerne ved University of Wisconsin-Madison for brug af gærstammer og udstyr i generationen af figur 3-5. Tak til Harpreet Kaur og Xingyang Fu for deres indsigtsfulde kommentarer til manuskriptet. Tak til de støttende studerende, medarbejdere og fakulteter ved Northwest University under skrivning, redigering og filmoptagelse af dette papir. Tak til Isabelle Marasigan for hjælp til at filme denne metode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 2 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 07-201-332 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 96-well round bottom microplate | Fisher Scientific | 07-200-760 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 190 proof ethanol | Fisher Scientific | 22-032-600 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 500 mL Filter System (0.22 µm) | CellTreat Scientific Products | 229707 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | Any molecular grade agar will work. |
| Autoclave | Tuttnauer | 3870EA | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Bunsen burner | Humboldt | PN6200.1 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Cell Density Meter | VWR | 490005-906 | Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm. |
| Copper sulfate Pentahydrate | Fisher Scientific | LC134051 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Digital imaging system | Cytiva | 29399481 | ImageQuant 4000 (used for Figure 3), Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer. |
| Dropout mix (-Leu) | USBiological Life Sciences | D9525 | Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu |
| D-Glucose | Fisher Scientific | AAA1682836 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Gel band quantifying software | Cytiva | 29-0006-05 | ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer. |
| Hand held camera | Nikon | D3500 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Near infra-red gel imaging device | Cytiva | 29238583 | Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade clamp | Fisher Scientific | 05-769-7Q | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade stand and clamp | Fisher Scientific | 12-000-101 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-51 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Pin replicator | VP Scientific | VP 407AH | |
| Semi-micro disposable cuvettes | VWR | 97000-590 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Shaker | JEIO Tech | IST-3075 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Spectrophotometer | Biowave | 80-3000-45 | Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm. |
| Square plates | VWR | 102091-156 | Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator. |
| Stir plate | Fisher Scientific | 11-520-16S | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Yeast nitrogen base | USBiological Life Sciences | Y2025 | Or comparable item from a different manufacturer. |
References
- Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
- Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K.
- Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
- Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
- Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
- Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
- Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
- Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
- Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
- Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
- Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
- Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3' splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
- Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
- Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
- Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
- Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
- MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5' splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
- Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
- Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
- Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
- Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315 (2020).
- vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
- Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
- Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O'Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
- Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
- Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
- Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5' splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
- Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
- Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
- Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
- Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
- McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
- Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
- Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
- Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
- Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
- Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
- Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
- Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
- JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
- Gietz, R. D., Woods, R. A.
- Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
- vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
- Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
- Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
- Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
- Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
- Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
- Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
- Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
- Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
- Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
- Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).
