Summary
ACT1-CUP1-analysen, en koppartillväxtanalys, ger en snabb avläsning av prekursorbudbärar-RNA (pre-mRNA) skarvning och den inverkan mutanta skarvningsfaktorer har på skarvningsfunktionen. Denna studie ger ett protokoll och belyser den anpassning som är möjlig för att ta itu med skarvfrågan av intresse.
Abstract
Mutationer som införts i skarven eller dess substrat har väsentligt bidragit till vår förståelse av komplikationerna med spliceosomal funktion. Oavsett om det är sjukdomsrelaterat eller funktionellt utvalt har många av dessa mutationer studerats med hjälp av tillväxtanalyser i modellorganismen Saccharomyces cerevisiae (jäst). Den skarvningsspecifika koppartillväxtanalysen, eller ACT1-CUP1-analysen, ger en omfattande analys av mutation på fenotypisk nivå. ACT1-CUP1-analysen använder reportrar som ger koppartolerans när de är korrekt skarvade. Således, i närvaro av koppar, korrelerar förändringar i jästens livskraft med förändringar i mRNA-produktion genom skarvning. I ett typiskt experiment utmanas jästskarvningssomen med olika icke-konsensusskarvningsreportrar och skarvningsfaktormutationen av intresse för att upptäcka någon synergistisk eller antitetisk inverkan på skarvning. Här ges en fullständig beskrivning av kopparplattberedning, plätering av jästceller och datautvärdering. Ett urval av kompletterande experiment beskrivs, vilket belyser mångsidigheten hos ACT1-CUP1-reportrarna. ACT1-CUP1-analysen är ett praktiskt verktyg i skarvningsverktygslådan tack vare den direkta avläsningen av mutationseffekter och de jämförande möjligheterna från den fortsatta användningen i fält.
Introduction
Spliceosomen är en stor, biologisk maskin som katalyserar avlägsnandet av introner, icke-kodande regioner i prekursorbudbärar-RNA (pre-mRNA)1,2. Att karakterisera effekten av en enpunktsmutant i 1 av de nästan 100 proteinerna och 5 icke-kodande RNA är ofta tvetydigt när man studerar proteinet eller RNA isolerat. Förändringen i den muterade komponentens funktion kan bäst utvärderas in vivo i samband med den fullständiga, fungerande skarvosomen.
Koppartillväxtanalysen som beskrivs här är en snabb mätare av skarvningseffektivitet i Saccharomyces cerevisiae eller spirande jäst. Utvecklad av C.F. Lesser och C. Guthrie och publicerad 1993, kombinerar denna analys lättheten att arbeta med en enkel modellorganism och den enkla avläsningen av cellviabilitet3. Livskraften korrelerar med hur väl skarvskaperna i dessa celler kan känna igen och skarva reporterutskriften.
Denna koppartillväxtanalys kallas oftare ACT1-CUP1-analysen. Namnet ACT1-CUP1 härstammar från de två gener som smälts samman för att skapa en reporter av skarvningseffektivitet. ACT1 är jästens aktingen, som är starkt uttryckt och har en effektivt skarvad intron 4,5. Cup1p är en kopparkelatator som binder koppar i cellen för att förhindra störningar i vanliga cellulära funktioner 6,7,8. ACT1-CUP1-reportern innehåller dessa gener i följd så att CUP1 endast är i rätt läsram om pre-mRNA-skarvning av ACT1: s intron inträffar (figur 1). Det resulterande fusionsproteinet innehåller de första 21 aminosyrorna av aktin och Cup1p-proteinet i full längd, vilket ökar jästens livskraft i en kopparrik miljö3. Således resulterar en ökning av mängden skarvning av reportern i en högre koncentration av Cup1p och ett högre kopparmotstånd (Figur 1). I jämförelse med andra reportergener påverkar CUP1 cellviabiliteten även vid låga nivåer, har ett brett känslighetsområde och kan användas för att direkt välja för skarvningsmutationer 3,6,7. Dessutom är CUP1 inte nödvändigt för standardjästtillväxt, och därmed påverkas inte cellulär homeostas under installationen för denna analys. Som komplement till deletions- eller temperaturtillväxtanalyser ger ACT1-CUP1 information om effekterna på skarvning under annars optimala jästtillväxtförhållanden.
Spliceosomen känner igen sitt substrat genom tre introniska sekvenser, nämligen 5'-skarvplatsen (5' SS), grenplatsen (BS) och 3'-skarvplatsen (3' SS). Många ACT1-CUP1-reportrar har genererats som innehåller icke-konsensussekvenser på dessa webbplatser. Ett urval av de vanligaste ACT1-CUP1-reportrarna visas i figur 1 och tabell 1. Eftersom skarven interagerar med varje skarvplats unikt vid olika punkter i skarvningscykeln, kan skarvasomens robusthet testas i olika steg baserat på vilken icke-konsensusreporter som används. Icke-konsensusreportrar är uppkallade efter den muterade positionen inom intronen och basen den muterades till. Till exempel är A3c en reporter med en mutation vid 5 'SS, specifikt position 3 från konsensus adenosin till en cytosin. Denna reporter kommer att interagera starkt med skarvmutationer som påverkar 5 'SS urval och användning. I sin första studie bestämde Lesser och Guthrie vilka 5 'SS -mutationer som hämmade skarvning3. Senare samma år publicerades icke-konsensusreportrar på alla tre skarvplatser av Burgess och Guthrie i en suppressorskärm av mutationer i ATPase Prp16p9. Genom att jämföra konsensus med icke-konsensusreportrar har ACT1-CUP1-analysen varit en viktig nyckel för att förstå robustheten och selektiviteten hos jästsklyven och för att dra slutsatsen om funktionen hos andra eukaryoters spliceosomer.
Eftersom icke-konsensus ACT1-CUP1-reportrar sensibiliserar skarven för ytterligare störning, kan effekten av en enda skarvfaktormutation karakteriseras genom de reportrar som den positivt eller negativt påverkar. Detta har tillämpats på skarvning av forskningsfrågor på olika sätt. För det första kan och har ACT1-CUP1-analysen använts som en genetisk skärm för mutationer i skarvningsfaktorer. Till exempel fungerar Prp8p, det största skarvningsproteinet, som en plattform på vilken RNA-kärnan i skarvningsgraden katalyserar skarvningsreaktionen. Detta härleddes delvis genom hur Prp8p-mutanter förbättrade eller minskade skarvningen av olika ACT1-CUP1-reportrar 10,11,12,13,14,15,16,17. Andra proteinkomponenter i skarven har också undersökts med ACT1-CUP1, inklusive Hsh155p, Cwc2p, Cef1p och Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. De energiska trösklarna för Prp16p och fyra andra ATPaser som är involverade i skarvsosomal övergång har också studerats med denna analys 9,26,27,28,29,30. De små nukleära RNA (snRNA) har också studerats omfattande med hjälp av ACT1-CUP1 för att identifiera de pre-mRNA-sekvenser de samordnar och förändringarna i sekundär struktur som snRNA genomgår under skarvning 3,31,32,33,34,35,36,37.
ACT1-CUP1-analysen kräver en jäststam där alla kopior av CUP1-genen har slagits ut. Eftersom CUP1 kan ha ett högt kopieringsnummer 6,38, kan förberedelse av en fullständig knock-out-stam kräva flera omgångar eller omfattande screening. Som ett resultat har koppar1Δ-jäststammar ofta delats mellan laboratorier, liksom reportrarna.
Om mutation(er) i en skarvningsfaktor bedöms från en plasmidkopia, bör genen av vildtyp för denna faktor slås ut. Dessutom bör jästbakgrunden möjliggöra val av minst två plasmider, en innehållande en ACT1-CUP1-reporter, historiskt på en leukeminutrient-selektionsplasmid och en som innehåller en mutation eller störning i skarvningsmaskineriet som kommer att studeras (figur 2). Vanligtvis, i en enda analys, kommer flera jäststammar, var och en med frågeskarvningsstörning (QSP) och en annan reporter, att testa frågans inverkan på skarvning.
De oberoende variablerna i ACT1-CUP1-analysen gör det möjligt för en forskare att bedöma svårighetsgraden av en QSP. Dessa oberoende variabler är koncentrationen av koppar och valet av flera icke-konsensusskarvningsreportrar. För det första, eftersom jäststammarna odlas på plattor som innehåller ett intervall av kopparkoncentrationer (figur 2), innefattar upprättandet av analysen att välja gradienten av de koncentrationer som används. Studier kan använda en kurskopparkoncentrationsgradient för att få en första avläsning av livskraften och sedan upprepa analysen med en finare gradient för att identifiera subtila viabilitetsskillnader. Den andra variabeln är det breda utbudet av ACT1-CUP1-reportrar som är möjliga att testa (figur 1 och tabell 1). Om QSP påverkar jästens livskraft annorlunda i närvaro av en icke-konsensusreporter jämfört med vildtyp, kan en slutsats dras att QSP påverkar ett steg i skarvning eller en region av skarven som är viktig under igenkänningen eller bearbetningen av den regionen av intronen.
Jästverktygslådan är omfattande och ACT1-CUP1-analysen är en integrerad del av skarvningsforskningen. ACT1-CUP1-analysen utförs ofta tillsammans med en mer djupgående genetisk, strukturell och/eller biokemisk analys av effekten av en QSP. Eftersom dessa mer detaljerade studier i allmänhet har ett längre förfarande och/eller högre prislapp, är ett vanligt tillvägagångssätt screening för intressanta mutanter med ACT1-CUP1 först.
Här tillhandahålls ett ACT1-CUP1-analysprotokoll, inklusive kopparplåtberedning. Denna analys ger forskare ett första svar på en QSP: s effekt på skarvning och vilka introniska regioner som påverkas mest av störningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Jäststamkonstruktion
- Generera eller erhålla en S. cerevisiae-stam vars bakgrund inkluderar leu2 och cup1Δ. För att generera denna bakgrund, använd den väletablerade jästmetoden som använder litiumacetat och enkelsträngat DNA39.
OBS: Haploida jäststammar kan innehålla en, två eller flera kopior av CUP1 6,38. Se genomisk information för den valda jäststammen när du utformar knock-out-primers för att flankera CUP1-genplatsen. - Utför en jästtransformation för att införliva QSP antingen via genomisk inkorporering eller på en plasmid. Använd ett väletablerat protokoll som de som beskrivits i tidigare forskning40,41,42.
- Utför en jästtransformation med den eller de resulterande stammarna från steg 1.2. för att lägga till önskad ACT1-CUP1 reporterplasmid.
OBS: Cellerna måste underhållas på leucinavtappningsplattor (-Leu) och medier för att säkerställa retention av ACT1-CUP1-reporterplasmiderna efter denna transformation. - Utför steg 1.2. och 1.3. för varje QSP och varje ACT1-CUP1-rapportörsplasmid som ska testas, inklusive kontrollstammar.
2. Beredning av kopparplåt
- Välj ett kopparkoncentrationsintervall som passar de reportrar som ska testas (se tabell 1 för ofta använda reportrars dödlighet).
OBS: Ett exempel på ett omfattande kopparkoncentrationsområde är 30 olika kopparkoncentrationer på 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM och 2,5 mM Cu2+. - Gör en stamlösning av 1 M CuSO4 och sterilt filter genom ett 0,22 μm PES (polyetersulfon) sterilt filter.
- Bered per önskad kopparplatta en 2 ml utspädning av CuSO 4-buljongen i sterilt vatten.
OBS: Eftersom plattan med 0 mM Cu 2+ alltid kommer att analyseras och avbildas som referens, rekommenderas att göra två 0 mM Cu2+ plattor, en i början och en i slutet av pläteringssteget (steg 3.4.).- Beräkna mängden lager för den slutliga önskade kopparkoncentrationen i 40 ml av plattvolymen (kompletterande tabell 1).
- Tillsätt den beräknade mängden sterilt vatten och 1 M CuSO4 lager till ett sterilt rör på 2 ml.
- Häll plattor för ACT1-CUP1-analysen.
OBS: Ett alternativ till protokollet nedan är att initialt kombinera media och agar i en stor behållare och alikvot efter autoklavering i mindre behållare för att uppnå olika kopparkoncentrationer för varje platta. Oavsett vilken metod som används är det viktigt att se till att mediekoncentrationen är konsekvent mellan alla plattor trots att var och en har olika kopparkoncentration.- Märk varje tom platta som ska hällas med den slutliga kopparkoncentrationen den kommer att innehålla. Bered minst en fyrkantig platta per kopparkoncentration som ska testas.
- Märk en 100 ml flaska per kopparkoncentration som ska testas.
- Till varje flaska, tillsätt 790 mg agar (2% w / v agar) och en omrörningsstång.
- I en stor bägare, kombinera -Leu tillväxtmedia för alla kopparplattor som ska hällas. Lös upp 265 mg jästkvävebas (YNB) och 64 mg drop-out-blandning minus leucin (och andra näringsämnen som kan krävas för att bibehålla QSP-plasmiden i cellerna) per platta som ska göras i 34 ml avjoniserat vatten.
- Tillsätt 34 ml av -Leu tillväxtmedielösning till varje beredd 100 ml flaska och lock med aluminiumfolie. Märk folien med den avsedda kopparkoncentrationen.
- Autoklav för att sterilisera och lösa upp agar med den rekommenderade vätskecykeln för autoklaven.
- Så snart som möjligt, tillsätt 4 ml 20% w / v glukos (sterilt filtrerat) till varje flaska.
- Matcha etiketterna och tillsätt 2 ml utspädningar av CuSO4 till den avsedda flaskan.
OBS: Eftersom tiotals kopparplattor kan tillverkas samtidigt, var och en med olika koncentration, kommer märkning av alla flaskor, rör och plattor tydligt med den avsedda kopparkoncentrationen att förhindra förvirring under platthällning. - Använd en omrörningsplatta för att blanda i ~ 30 s och häll eller pipett 35 ml i den märkta plattan, undvik bubblor. Låt svalna innan förvaring eller användning.
OBS: Ofta görs plattorna 1 dag eller 2 dagar före analysen och förvaras vid 4 ° C tills några timmar före användning. Plattorna ska vara vid rumstemperatur (RT) innan plätering börjar (steg 3.4.).
3. ACT1-CUP1-analys
- Stryk ut önskade stammar på -Leu-plattor.
OBS: Om du arbetar från kryobestånd bör du se till att cellerna återupplivas tillräckligt från lagring före plätering. Ett rekommenderat förfarande för detta är att stryka från det kryogena beståndet och låta det växa i 3-5 dagar vid 30 °C. Restreaka sedan en liten färgruta och låt den växa i ytterligare 2-3 dagar vid 30 °C. - Odla över natten kulturer i 10 ml media.
- Förbered -Leu tillväxtmedia med samma förhållanden som beskrivs i steg 2.4.2. Tillsätt 66 mg jästkvävebas (YNB) och 16 mg drop-out-blandning minus leucin till 9 ml avjoniserat vatten per 10 ml media. Passera genom ett 0,22 μm PES sterilt filter.
- Per jäststam, tillsätt 9 ml -Leu tillväxtmedium och 1 ml 20% w / v glukos (sterilt filtrerat) till ett sterilt 50 ml koniskt rör.
- Använd en steril pinne eller pipettspets, samla en liten (~ 1 mm rund) svamp och inokulera mediet.
- Skaka alla nattkulturer vid 180 rpm och 30 °C.
OBS: Om det finns tillgängligt kan rotatorer användas istället för en shaker.
- Späd stammarna till en OD600 0,5 ± 0,05 i 10% glycerol.
- Tillsätt 100 μl odling per stam till en kyvett som innehåller 900 μl vatten.
- Mät OD600 med en spektrofotometer.
- Beräkna den utspädning som krävs för att vara vid en OD600 på 0,5 i en slutlig volym på 2 ml.
- Späd varje stam till OD600 0,5 i 10% glycerol (steril).
- Mät om OD600 för att bekräfta att celldensiteten ligger inom önskat intervall på 0,5 ± 0,05.
- Plåta stammarna på kopparplattorna.
OBS: En mängd olika metoder kan användas för att platta stammarna, inklusive handpipettering 5-10 μL volymer, med hjälp av en upprepad eller flerkanalig pipettor, eller stämpling med en stiftreplikator. Den sista metoden beskrivs nedan, även om de flesta steg kommer att vara lika oavsett metod.- Sätt upp en steril arbetsplats och en tänd Bunsenbrännare.
- För en 48-polig replikator, pipett 200 μL av varje utspädd stam i en separat brunn av en 96-brunnsplatta. Fyll de tomma utrymmena i 6 x 8-gallret med 200 μl 10% glycerol (steril).
OBS: Ett exempel på ett pläteringsschema för nio jäststammar finns i kompletterande tabell 2. - Doppa replikatorn i en grund skål med 95% (v / v) etanol och flamma för att sterilisera. Låt det svalna i minst 2 minuter efter att lågan släckts för att undvika att värmen chockar cellerna.
- Placera fyra plattor nära brännaren och ta bort locken.
- Doppa replikatorn i 96-brunnsplattan och lyft upp den i en snabb rörelse.
- Lägg försiktigt på plattan och gunga lätt fram och tillbaka för att underlätta en bra överföring.
- Lyft upp i en snabb rörelse och placera i exakt samma riktning i 96-brunnsplattan.
- Upprepa för upp till tre andra plattor. Upprepa processen att doppa replikatorn i etanol, flamma för att sterilisera och vänta på att kyla var fjärde platta.
- När en platta har pläterats, rör dig med en jämn rörelse åt sidan men fortfarande inom flammans steriliseringsparaply.
OBS: Det rekommenderas att göra jästutspädningarna och plätering nära en flamma. Plattorna kan lätt bli förorenade under torkning. - Låt plattorna torka helt innan du lägger på locken, vanligtvis 3-5 min.
- Inkubera plattorna i 3 dagar vid 30 °C.
4. Insamling och analys av uppgifter
- Ta bort plattorna från inkubatorn och inspektera dem visuellt.
- Spela in bilderna på plattorna med en tillgänglig kamera eller annat digitalt bildsystem.
- Registrera (eller poäng) för varje stam den sista synliga kopparkoncentrationen observeras.
OBS: Cellerna kan skarva och förbli livskraftiga fram till den koncentrationen. För konsistens, använd alltid samma metod, antingen med ögat eller från plattbilderna, för att poängsätta den sista livskraftiga kopparkoncentrationen. Mycket små kolonier syns ibland av ögat men inte på bilden. Skillnaden mellan direkt visuell inspektion eller inspelning från bilder är liten, vanligtvis ett steg i lutningen. Eftersom bilder av kolonierna ofta används i publikationer rekommenderas poängsättning av bilderna. - Kombinera data från flera ACT1-CUP1-analyser för samma stam för att dra slutsatser om hur QSP påverkar skarvning.
OBS: Publikationssiffror visar vanligtvis bilder av jästkolonierna vid 0 mM Cu2+ koncentration, den sista livskraftiga kopparkoncentrationen och den efterföljande koncentrationen där kolonin har dött. Data kan också visas som ett stapeldiagram med felstaplar för standardavvikelsen mellan replikat. Data behöver inte normaliseras men kan vara genom att ställa in livskraften för WT-skarvfaktorkontrollen till 1 och jämföra effekten av den eller de mutationer som införts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tillväxtanalyser, som ACT1-CUP1, kräver visuell, jämförande bedömning av flera kolonier. Här odlades varje stam till mättnad över natten, späddes till en OD600 på 0,5 och pläterades på 20 plattor innehållande ett intervall av kopparkoncentrationer från 0 mM till 1,1 mM CuSO4 (Figur 3). Detta intervall är mindre än det som anges i protokollet eftersom det möjliggjorde en fullständig bedömning av effekterna av QSP: erna och ACT1-CUP1-reportrarna som används och beskrivs nedan. Plattorna avbildades och poängsattes (figur 3 och kompletterande tabell 3).
För detta representativa experiment inkluderar jästbakgrunden en störd ADE2-gen, vilket resulterar i att kolonierna är olika nyanser av rött (figur 3A,B). Denna vanliga jäststörning i adenosinproduktionsvägen orsakar en uppbyggnad av en rödpigmenterad föregångare för adenosin. Således är den röda färgen en indikator på jästkolonimognad (dvs mängden och åldern hos de närvarande cellerna). För en ACT1-CUP1-analys kan den röda färgen fungera som en indikator på förorenande svamparter om den är vit eller gul i färg. Färgen kan vara en sekundär bekräftelse på koppartolerans eftersom mer livskraftiga kolonier kommer att vara en djupare röd nyans.
Vid plätering med en stiftreplikator finns det flera vanliga avvikelser. För det första är det möjligt att skapa kolonier som är ovala om replikatorn lyfts upp medan du rör dig åt vänster eller höger (figur 3B, orange pil). Dessutom kan mikrokolonier också bildas från små droppar celllösning om stiftreplikatorn förs in i en vinkel eller om den skakas ovanför plattan (figur 3B, röd pil). Ofta oskyldiga, ibland kan mikrokolonierna blandas med en stämplad koloni, och detta förhindrar tolkning av den kolonin. Ytterligare pläteringsproblem inkluderar otillräcklig väntetid efter sterilisering för att replikatorstiften ska svalna och otillräcklig kontakt mellan plattan och stiften så att dålig överföring av odlingsmediet uppstår. I båda fallen kommer få, om några, celler att växa på plattan, inklusive för kontrollstammarna som innehåller vildtypsreportern. Som med alla tillväxtanalyser, oavsett pläteringsmetod, är det viktigt att utföra ACT1-CUP1 i tre exemplar för att bekräfta att resultaten är konsekventa och repeterbara. Helst bör dessa olika replikat utföras på kopparplattor framställda vid olika tidpunkter för att säkerställa reproducerbarhet.
För dessa representativa experiment valdes A3c-reportern för att belysa effekten av en icke-konsensussekvens på koppartolerans i frånvaro av ytterligare skarvosomstörningar. A3c minskar signifikant mängden CUP1 mRNA som produceras eftersom det stör skarvasomens förmåga att känna igen och använda 5 'SS15. Jäst med A3c-reportern överlevde till 0,15 mM Cu2+, medan reportercellerna av vildtyp bibehöll livskraften till slutet av det testade kopparkoncentrationsintervallet (figur 3C). Den vilda rapportören som innehåller celler växer till 2,5 mM Cu2+ utan påverkan på livskraften (data visas inte).
U6 snRNA är en väsentlig katalytisk komponent i skarvosomen. Flera studier har använt ACT1-CUP1 för att studera effekten mutationer kan ha på detta RNA 16,32,34. Duplicerad för denna studie studerades tre U6 snRNA-sekvenser, nämligen vildtypssekvensen (WT), position 57 substituerad från en uridin till en cytosin (U57c) och position 57 substituerad från en uridin till en adenosin (U57a) (Figur 3 och Figur 4). I kombination med ACT1-CUP1-reportrar som påverkar de katalytiska stegen i skarvning, bestämdes det att U57c gynnar det första katalytiska steget, och U57a gynnar utvecklingen till det andra steget16,32.
För att ställa in för ACT1-CUP1-analysen skapades en stam med den genomiska kopian av U6 snRNA raderad och U6 snRNA vildtyp eller muterade sekvenser inkluderade på plasmider. Eftersom U6 snRNA är en väsentlig komponent i cellen användes tre separata transformationer för att först slå ut det genomiska U6-snRNA samtidigt som cellviabiliteten upprätthölls, därefter införa muterade U6 snRNA på plasmider och slutligen lägga till ACT1-CUP1-reportrarna. För den första transformationen användes en cup1Δ-jäststam vid knock-out av den genomiska kopian av U6 snRNA samtidigt som WT U6 snRNA tillsattes på en URA-urvalsmarkörplasmid för att bibehålla livskraften. En efterföljande transformation lade till antingen vildtyp eller muterat U6 snRNA på en TRP-urvalsmarkörplasmid och valde mot URA-markören via 5-FOA-urval. Således genererades tre cup1Δ-jäststammar, var och en med en av U6-snRNA-sekvenserna, nämligen WT, U57a och U57c. En slutlig jästtransformation för varje stam tillsatte en av de tre olika ACT1-CUP1-reporterplasmiderna som skulle användas i detta experiment. De utvalda reportrarna var den vilda reportern, A3c, och en mutation av grenplatsen adenosin till guanin (BS-G). Totalt nio stammar genererades för detta experiment, var och en innehållande en U6 snRNA-sekvens och en ACT1-CUP1-reporter (kompletterande tabell 4 och kompletterande tabell 5).
Resultaten visade att de olika baserna vid U6 snRNA position 57 har unika effekter på skarven i kombination med en 5' SS- eller BS-mutation (figur 4). Både A3c- och BS-G-reportrarna hämmar främst skarvning genom att stabilisera den första katalytiska stegkonformationen14,15. Således är U57c en additiv mutation som minskar koppartoleransen i kombination med någon av dessa reportrar (figur 4B). Däremot ökar U57a koppartoleransen eftersom det främjar progression till det andra steget (figur 4B)16,32. BS-G-reporterstammens minskade koppartolerans med U57a jämfört med U6 snRNA WT belyser en sannolik sekundär inverkan av BS-G på det andra steget i skarvning16.
Dessa resultat belyser också den kvalitativa karaktären hos denna analys och varför vildtypsfrågor och reportersekvenser bör testas. Medan det allmänna mönstret för ökad eller minskad koppartolerans gäller för dessa U6 snRNA-mutationer jämfört med U6-snRNA av vild typ, kan den exakta koncentrationen av koppar som cellerna överlever skilja sig mellan studier (tabell 1) och skilde sig mellan dessa representativa data och andra publicerade resultat. Detta beror sannolikt på bakgrunden till stammen som innehåller CUP1-raderingen men kan också bero på stammarnas allmänna hälsa före plätering (dvs. hur snart efter generering av stammen eller restreak från kryo analysen utfördes), skillnader i hur plattorna är beredda och variation mellan olika inkubatorer. En liknande varians noterades i Mayerle et al. för Prp8-frågemutationer i litteraturen43. Således kan jämförelse av koppartoleranstrender utföras för olika ACT1-CUP1-analyser, men den numeriska jämförelsen av kopparkoncentrationerna bör endast göras inom samma laboratorium och ibland med samma uppsättning kopparplattor.
Figur 1: ACT1-CUP1 reporterdesign. Koncentrationen av skarvad reporter korrelerar direkt med jästkoppartolerans. Reporterns diagram innehåller de tre skarvplatserna på 5'-skarvplatsen (5' SS), grenplatsen (BS) och 3'-skarvplatsen (3' SS). Jästkonsensussekvenserna för dessa platser visas, med de som är inriktade på klyvning angivna i fetstil och numrerade baserat på deras placering i intronen. Vanliga icke-konsensus ACT1-CUP1-reportersekvenser visas med gemener under motsvarande konsensussekvensplatser och listas i tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Arbetsflöde för ACT1-CUP1-analys. För denna analys måste en jäststam vara cup1Δ leu2 och innehålla den önskade ACT1-CUP1-reporterplasmiden och QSP-genen, märkt Gen i figuren. QSP-genen måste antingen vara genomiskt införd eller på en plasmid. Protokollet med hjälp av en stiftreplikator innefattar fyra steg för att förbereda jästcellerna. Steg 1 är att växa cellerna till mättnad. Steg 2 är att mäta kulturens OD 600 och späda ut till en OD600 på 0,5. Steg 3 är att fördela över en 96-brunnsplatta. Steg 4 är att plåta på plattor som innehåller ökande koncentrationer av koppar (indikerad med ökande blå färg). Steg 1, steg 2 och steg 4 skulle vara identiska för handpipettering. När plattorna har pläterats inkuberas de i 3 dagar vid 30 °C och poängsätts sedan för viabilitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa vyer av ACT1-CUP1-data. För detta experiment utmanas jästskliceosomer med två olika U6 snRNA-mutationer och testas i närvaro av tre icke-konsensusreportrar. Tre replikat av denna analys presenteras på samma plattor för demonstrationsändamål. Det rekommenderas för denna analys att göra replikat på separata plattor och på separata dagar. (A) Ett färdigt test med en koppargradient på 0 mM till 1,1 mM över 20 plattor visas. När kopparkoncentrationen ökar visar stammar med lägre skarvning minskad sammanflöde till den punkt där kopparkoncentrationen blir dödlig. Jästbakgrunden var ade2, och därmed är mogna kolonier röda i färgen. (B) Jämförelse av samma plattor vid 0 mM och 0,1 mM CuSO4 avbildade med en handhållen kamera kontra ett digitalt bildsystem. Detta är ett exempel på hur ett antal icke-konsensusreportrar kan jämföras sida vid sida och med den vilda reportern. Vanliga observationer på plattor inkluderar en falsk droppe odlingsmedier som föll från stiftreplikatorn (röd pil) och lätt ovaling av kolonierna på grund av glidning av stiftet längs plattans yta eller plattans rörelse innan kulturdroppen har torkat tillräckligt (orange pil). (C) Exempel på A3c-reporterns effekt på cellviabiliteten jämfört med den vilda rapportören. Bilder som de som visas i (B) beskärs och justeras för att markera tillväxtskillnaderna vid olika kopparkoncentrationer. Koppartoleransen för A3c-reporterstammen minskar till 0,15 mM Cu2+ jämfört med vildtypsreporterstammens livskraft till slutet av det testade intervallet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa ACT1-CUP1-resultat övervakar skarvning i jäst med skarvningskomponentmutationer . (A) Schematisk bild av RNA-komponenterna på det aktiva stället omedelbart efter det första katalytiska steget. U2- och U6-snRNA är duplexerade, vilket ger 5 'SS och BS för intron i närheten. Den introniska bindningen mellan A259 (BS) och G1 (5 'SS) indikeras av den orange pricken. Platserna för de icke-konsensussekvenssubstitutionerna i ACT1-CUP1-reportern som testades i detta experiment indikeras i fet svart. Den muterade positionen i U6 snRNA (U57) är i fet grön och de ersatta baserna är i antingen blått eller rosa. (B) En möjlighet att presentera ACT1-CUP1-data i en publikation inkluderar flera bilder av kolonier från relevanta Cu2+ -koncentrationer. WT-reportern överlevde förbi kopparkoncentrationen som testades för alla tre U6 snRNA-stammar som ifrågasattes. (C) Ett stapeldiagram som jämför effekterna per reporter och per U6 snRNA-mutant. Normalisering utförs för varje ACT1-CUP1-reporter genom att ställa in koppartoleransen för U6 snRNA WT till 1 och beräkna förhållandet för U57c- och U57a-mutationerna. Felstaplar representerar standardavvikelsen från tre replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Ytterligare metoder för att komplettera ACT1-CUP1-resultaten. (A) Primerförlängning utförs via en primerglödgning i 3' ACT1-exonen och förlängs sedan in i intronen. I detta exempel är primern ändmärkt med IR700-färgämne och primerförlängningen utfördes enligt beskrivningen i 20,21. Primerförlängning av U6 snRNA utförs i samma reaktion för att fungera som en lastkontroll. 7% 19: 1 bis / akrylamid, denatureringsgel löser pre-mRNA-, mRNA- och lariatprodukterna efter primerförlängning med hjälp av en nära infraröd gelavbildningsanordning som beskrivs i van der Feltz et al.22. Intensiteten hos de olika banden kan användas för att mäta den totala skarvningseffektiviteten samt skilja de skarvningsskillnader som uppstår vid det första eller andra steget, vilket kvantifieras med ImageJ44 eller annan gelbandskvantifieringsprogramvara. Både skarvningseffektiviteten och skarvningsstegets effektivitet beräknas enligt beskrivningen i Query och Konarska14. (B) Mutationsskärmar med ACT1-CUP1-reportrar kan använda kopparval för att identifiera mutanter som påverkar skarvning. Genen/generna av intresse kan sedan sekvenseras i de resulterande stammarna för att avgöra om mutationen inträffade i den genen. (C) Ändringar kan göras till rapportören utanför skarvplatserna för att övervaka skarvningsförändringar i förhållande till intronstruktur, exoniska sekvenser, antal exoner eller kärnexport av oskarvat RNA. Regioner i grått är valfria expansionsregioner att inkludera på en reporter, och områden i rött är regioner där sekvensen och strukturella förändringar kan testas för deras potentiella inverkan på skarvning med hjälp av ACT1-CUP1-analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reporterns namn | Intronic region | Sekvens | Senast livskraftig Cu2+ koncentration (mM) | |
| WT | 5' | GUAUGU | > 2.5 | |
| G1a | 5ʹ | en UAUGU | 0,0133 eller 0,0532 | |
| A3c | 5ʹ | GUcUGU | 0,15^,18 eller 0,216 | |
| G5a | 5ʹ | GUAUaU | 0,303 eller 0,259 | |
| WT | Filial-plats | UACUAAC | > 2.5 | |
| C256a | Filial-plats | UAenUAAC | 0,1526 eller 0,1832 | |
| U257c/a | Filial-plats | UACc/aAAC | 0,226 eller 0,332 eller 0,545 | 0,059,32 |
| A258c/u | Filial-plats | UACUc/uAC | 0,826 | 1,045 eller 1,646 |
| BS-C | Filial-plats | UACUAcC | 0,153 eller 0,1832,56 eller 0,2 26 | |
| BS-G | Filial-plats | UACUAgC | 0,0516,32 eller 0,625 eller 0,846 | |
| C260g | Filial-plats | UACUAAg | 0,826 | |
| WT | 3' | UAG | > 2.5 | |
| U301g | 3ʹ | G AG | 0.1518 | |
| A302g/u | 3' | Ug/uG | 0,0139 | 0,07516 eller 0,1824 |
| G303c | 3ʹ | UAc | 0,0532 | |
Tabell 1: Lista över vanliga rapportörer och cu2+ koncentrationsdödlighet rapporterad. Det finns över 100 citat av Lesser och Guthrie3. Medan ett litet urval av dessa citat användes för att skapa denna tabell, belyser de den allmänna trenden med små till måttliga skillnader mellan studier i rapporterade kopparviabilitetskoncentrationer. I ACT1-CUP1 är det viktigt att jämföra protein av vild typ eller RNA med mutanterna alla med samma jäststambakgrund med hjälp av de publicerade koncentrationerna som vägledning men förutse att de observerade koncentrationerna kan skilja sig åt. Data som samlats in från figur 3 (^) och flera publikationer kommenterade med följande citat 3,9,16,18,24,25,26,32,45,46.
Kompletterande tabell 1: Innehållet i en enda kopparplatta och ett exempel på beräkningar som gjorts för att uppnå kopparutspädningar från 0 mM till 2,5 mM från ett 1 MCuSO4-lager . Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande tabell 2: Exempel på ett pläteringsschema för 48-stifts replikatorn. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande tabell 3: Exempel på viabilitet från kopparplattor som inkuberats i 3 dagar vid 30 °C. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande tabell 4: Förteckning över jäststammar som använts för att generera representativa data. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande tabell 5: Lista över plasmider som används för att generera representativa data. U6 snRNA-plasmider genererade och publicerade i tidigare forskning22,47. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ACT1-CUP1 är en tillväxtanalys, och man måste se till att observerade tillväxtskillnader endast kan hänföras till skarvningsfel. Alla stammar bör hanteras på ett liknande sätt före plätering, inklusive att ha en liknande längd och typ av tillväxt- och lagringsförhållanden. Vid användning av temperaturkänsliga stammar bör ACT1-CUP1-analyser endast utföras under förhållanden där dessa stammar växer jämförbart med vild typ. För QSP-komponenten rekommenderas det att ha identiska jästbakgrunder och uttrycksnivåer för QSP-gener för att inte fördunkla tolkningen av resultaten. När man överväger antalet QSP: er och reportrar som ska användas rekommenderas det inte att analysera mer än 30 stammar åt gången med stiftreplikatormetoden. Med den extra tiden att utföra varje steg kommer cellerna att lösa sig och analysresultaten blir inkonsekventa på grund av minskad cellviabilitet.
Förutom de begränsningar ACT1-CUP1 i sig har som tillväxtanalys kan en QSP ha en mer komplex inverkan på skarvning än vad som kan lösas med denna metod. Eftersom skarvning är en flerstegsprocess och faktorer återvinns kan den observerade fenotypen resultera i att störningen påverkar mer än ett skarvningssteg. Detta gäller även för de efterföljande analyserna som kan följa upp ACT1-CUP1, varav några beskrivs nedan. Data kommer att markera det mest störda steget i processen, även om andra steg kan påverkas av skarvningsfaktorns förändrade funktion.
Primerförlängning av ACT1-CUP1-reportrar användes först i Lesser och Guthries ursprungliga papper och utförs ofta om ACT1-CUP1-resultaten visar en tillväxtdefekt3. Denna analys riktar sig till reportern och använder längden på PCR-produkterna för att bestämma de relativa mängderna oskarvad, delvis skarvade och helt skarvade reporter närvarande (figur 5A). Den totala skarvningseffektiviteten och om defekten påverkar det första eller andra katalytiska steget mer bestäms genom att ta förhållanden mellan PCR-produktmängderna14. Till exempel har 5 'SS-reporter G5a minskat skarvning jämfört med vildtypsreportern, men dess första och andra stegeffektivitet följer ett liknande mönster som vildtyp (figur 5A). Detta pekar mot en defekt före det första katalytiska steget, eventuellt i skarvsammansättning, eftersom båda stegen påverkas på samma sätt31.
Nya analyser har utvecklats från den kanoniska ACT1-CUP1-analysen, såsom screening för mutanter som förbättrar skarvning i närvaro av andra skarvningsfaktormutanter och/eller icke-konsensusskarvningssekvenser (figur 5B). Att till exempel utsätta jäst som innehåller ACT1-CUP1-reportern för UV och sedan välja i närvaro av koppar gav Prp8- och Hsh155-mutanter som förbättrade skarvningen av icke-konsensussekvenser14,19.
Genom att expandera förbi studien av effekten av skarvställen och konstitutiva skarvningsfaktorer har CUP1-tillväxtberoende använts för att studera multipel intronskarvning, kärnexportkontroll och effekten av UTR och andra perifera sekvenser på skarvning (Figur 5C). Några av dessa studier har skapat reportrar med CUP1 och andra intronhaltiga jästgener som kan ha mer komplexa skarvningsmönster för att studera effekten på intronisk sekundärstruktur och multi-intron-transkriptskarvning 48,49,50,51,52. Kopplingen mellan skarvning och kärnexport studerades genom att antingen ha skarvade eller oskarvade transkript som kodar för CUP1 i ram53,54. Längden på pyrimidinspåret och skarvplatsvalets avståndsberoende på grund av specifika faktorer har också testats 20,55,56,57. Dessa exempel och många andra belyser mångsidigheten hos ACT1-CUP1 och andra CUP1-tillväxtanalyser.
ACT1-CUP1-analysen länkar störningar till en komplex reaktionscykel med en enkel tillväxtfenotyp med ett brett känslighetsområde. Denna äldre analys har använts av flera laboratorier för att lägga grunden för förståelsen av skarvningscykeln. På senare tid har ACT1-CUP1 använts för att svara på frågor som uppstår från den mängd strukturdata som nu finns tillgängliga21,22,25. Strukturella studier av skarvosomer bundna till icke-konsensussekvenser kan paras ihop med ACT1-CUP1-resultat för att tolka hur förändrad struktur och förändrad funktion korrelerar. ACT1-CUP1 är en idealisk första skärm för skarvning av mutationer som kan komplettera mer komplex analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja.
Acknowledgments
Tack till Aaron Hoskins och Hoskins labbmedlemmar vid University of Wisconsin-Madison för användning av jäststammar och utrustning i genereringen av figurerna 3-5. Tack till Harpreet Kaur och Xingyang Fu för deras insiktsfulla kommentarer om manuskriptet. Tack till de stödjande studenterna, personalen och fakulteten vid Northwest University under skrivandet, redigeringen och inspelningen av detta papper. Tack till Isabelle Marasigan för hjälp med att filma denna metod.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 2 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 07-201-332 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 96-well round bottom microplate | Fisher Scientific | 07-200-760 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 190 proof ethanol | Fisher Scientific | 22-032-600 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 500 mL Filter System (0.22 µm) | CellTreat Scientific Products | 229707 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | Any molecular grade agar will work. |
| Autoclave | Tuttnauer | 3870EA | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Bunsen burner | Humboldt | PN6200.1 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Cell Density Meter | VWR | 490005-906 | Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm. |
| Copper sulfate Pentahydrate | Fisher Scientific | LC134051 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Digital imaging system | Cytiva | 29399481 | ImageQuant 4000 (used for Figure 3), Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer. |
| Dropout mix (-Leu) | USBiological Life Sciences | D9525 | Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu |
| D-Glucose | Fisher Scientific | AAA1682836 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Gel band quantifying software | Cytiva | 29-0006-05 | ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer. |
| Hand held camera | Nikon | D3500 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Near infra-red gel imaging device | Cytiva | 29238583 | Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade clamp | Fisher Scientific | 05-769-7Q | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade stand and clamp | Fisher Scientific | 12-000-101 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-51 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Pin replicator | VP Scientific | VP 407AH | |
| Semi-micro disposable cuvettes | VWR | 97000-590 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Shaker | JEIO Tech | IST-3075 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Spectrophotometer | Biowave | 80-3000-45 | Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm. |
| Square plates | VWR | 102091-156 | Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator. |
| Stir plate | Fisher Scientific | 11-520-16S | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Yeast nitrogen base | USBiological Life Sciences | Y2025 | Or comparable item from a different manufacturer. |
References
- Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
- Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K.
- Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
- Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
- Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
- Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
- Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
- Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
- Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
- Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
- Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
- Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3' splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
- Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
- Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
- Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
- Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
- MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5' splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
- Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
- Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
- Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
- Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315 (2020).
- vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
- Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
- Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O'Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
- Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
- Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
- Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5' splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
- Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
- Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
- Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
- Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
- McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
- Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
- Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
- Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
- Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
- Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
- Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
- Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
- JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
- Gietz, R. D., Woods, R. A.
- Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
- vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
- Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
- Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
- Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
- Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
- Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
- Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
- Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
- Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
- Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
- Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).
