Summary
Здесь мы описываем простой и воспроизводимый метод, который может индуцировать инфаркт миокарда или ишемически-реперфузионное повреждение миокарда у мышей путем прецизионного перевязки левой передней нисходящей коронарной артерии с помощью микроманипуляций.
Abstract
Острый инфаркт миокарда является распространенным сердечно-сосудистым заболеванием с высокой смертностью. Реперфузионное повреждение миокарда может противодействовать благотворному эффекту сердечного оттока и индуцировать вторичное повреждение миокарда. Простая и воспроизводимая модель инфаркта миокарда и ишемически-реперфузионного повреждения миокарда является хорошим инструментом для исследователей. Описан настраиваемый метод создания модели инфаркта миокарда (ИМ) и МИРИ путем прецизионного перевязки левой передней нисходящей коронарной артерии (ЛДП) с помощью микроманипуляций. Точное и воспроизводимое расположение лигатуры LAD помогает получить стабильные результаты при травме сердца. Изменения сегмента ST могут помочь определить точность модели. Для оценки повреждения миокарда используется сывороточный уровень сердечного тропонина Т (cTnT), для оценки систолической функции миокарда используется ультразвуковое исследование сердца, а для измерения размера инфаркта используется окрашивание Evans-Blue/трифенилтетразолия хлоридом. В целом, этот протокол сокращает продолжительность процедуры, обеспечивает контролируемый размер инфаркта и улучшает выживаемость мышей.
Introduction
Острый инфаркт миокарда (ОИМ) является распространенным сердечно-сосудистым заболеванием во всем мире и сопровождается высокойсмертностью1. Достижения в области технологий делают раннюю и эффективную реваскуляризацию доступной для пациентов с ОИМ. После этих процедур у некоторых пациентов может возникнуть ишемически-реперфузионное повреждение миокарда (MIRI)2. Таким образом, большое значение имеет понимание механизмов действия и способов улучшения ИМ/МИРИ. Мыши широко используются в качестве моделей из-за их низкой стоимости, быстрого времени размножения и легкости внесениягенетических изменений. Ученые разработали различные методы моделирования MIRI и MI у животных 4,5,6,7,8,9. Эта стратегия способствует проведению исследований, но различные критерии и методы, используемые исследовательскими группами, усложняют интерпретацию результатов исследовательскими группами.
У мышей инфаркт миокарда индуцировался изопротеренолом10, криотравмой 11,12 или прижиганием13. Инфаркт миокарда может быть легко индуцирован изопротеренолом, но патофизиологический процесс отличается от такового при клиническом инфаркте миокарда. Криотравма-индуцированный инфаркт миокарда имеет плохую консистенцию, вызывает чрезмерное повреждение миокарда вокруг левой передней нисходящей коронарной артерии (LAD) и может легко индуцировать аритмию. Инфаркт миокарда, индуцированный прижиганием, значительно отличается от естественного процесса инфаркта миокарда, и воспалительная реакция в области ожога более интенсивна; Кроме того, хирургический доступ имеет технические трудности. Кроме того, некоторыелаборатории разрабатывают модель инфаркта миокарда у минипигов с использованием баллонной блокады или эмболизации или метода тромбоза с помощью интервенционной техники. Все эти методы могут вызвать окклюзию коронарных артерий напрямую, но необходимость в коронарных ангиографических аппаратах и, прежде всего, слишком тонкие коронарные артерии мыши делают эти операции нецелесообразными. Для MIRI различия между разными моделями были довольно скромными, например, использование респираторов/микроманипуляций или нет 5,6.
Здесь описан простой и надежный метод, который может индуцировать ИМ и модель MIRI, адаптированная из ранее опубликованных методов 4,5,6,7,8,9,15. Этот метод позволяет моделировать патофизиологические процессы путем прямой блокады LAD посредством лигирования. Более того, снимая лигирование, эта модель также может имитировать реперфузионное повреждение. В этом протоколе для визуализации LAD используется препарирующий микроскоп. После этого исследователь может легко идентифицировать LAD. Впоследствии точное лигирование LAD приводит к воспроизводимой и предсказуемой окклюзии крови и ишемии желудочков. Кроме того, изменения электрокардиографии (ЭКГ) могут быть использованы для подтверждения ишемии и реперфузии в дополнение к изменениям цвета LAD, наблюдаемым под микроскопом. Эта стратегия приводит к сокращению продолжительности процедуры, снижению риска хирургических осложнений и меньшему количеству экспериментальных мышей. Также описаны методы теста на тропонин-Т, УЗИ сердца и окрашивания трифенилтетразолия хлорида (ТТС). В целом, этот протокол полезен для изучения механизма ИМ/МИР, а также для разработки лекарственных препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Хуачжунского университета науки и технологий (Ухань, Китай).
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве моделей используются самцы мышей C57BL/6J (8-10 недель). Мыши имеют свободный доступ к пище и воде и размножаются в определенных условиях, свободных от патогенов. В помещении поддерживается контролируемая температура (22 °C ± 2 °C) и влажность (45%-65%). Мыши подвергаются воздействию 12-часовой светлой/темной среды в учреждении по уходу за животными Медицинской школы Тунцзи (Ухань, Китай) в соответствии с рекомендациями, установленными этим учреждением. Используйте стерильные микрохирургические инструменты и хирургические принадлежности. На протяжении всей процедуры необходимо носить хирургические перчатки и маски. Экспериментальный рабочий процесс показан на рисунке 1A.
1. Предоперационная подготовка
- Используйте прямоугольный операционный стол (ОТ) с предварительно нагретой грелкой (37 °C) на протяжении всей хирургической процедуры (Рисунок 1B). Перед началом процедуры продезинфицируйте доску ультрафиолетом и 70% спиртом.
- Тщательно взвесьте всех мышей, чтобы рассчитать необходимую дозу обезболивающих препаратов. Затем обезболивают мышей кетамином (80 мг/кг) и ксилазином (10 мг/кг) путем внутрибрюшинной инъекции. Обеспечьте надлежащую глубину анестезии за счет отсутствия рефлекса отведения к защемлению пальцев ног и морганию рефлексов.
- Положите мышь лежа на ОТ с марлей под голову, чтобы избежать перегрева глаз. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить их пересыхание.
- Сбрейте шерсть на левой пограничной груди электробритвой. Нанесите крем для удаления шерсти на предварительно выбритую грудную клетку и равномерно помассируйте стерильным ватным тампоном в течение ~1 мин. Лишнюю выпавшую шерсть протрите марлей.
- Используйте повидон-йод с последующим 70% спиртом для очистки участка. Накройте грудную клетку марлей.
- Используйте шов 4-0 под верхними резцами и закрепите его в точке фиксации (близко к краю ОТ над носом), чтобы рот оставался слегка открытым и облегчал канюлю.
- Потяните хвост, чтобы тело оставалось прямым, и закрепите хвост к ОТ с помощью скотча. Закрепите четыре конечности и затяните их на других опорных точках. Главное, не перенапрягайте передние конечности; В противном случае может возникнуть дыхательная недостаточность.
- Используйте изогнутые щипцы и щипцы, чтобы открыть челюсть и приподнять язык. Используйте осветитель, чтобы четко визуализировать горло и голосовую щель.
- Осторожно введите канюлю 22G с затупленной и усеченной иглой в трахею через рот на ~1 см вниз по горлу. Одной рукой придерживайте язык, слегка приведите его вверх тупыми щипцами, а другой рукой осторожно введите трубку в трахею. Будьте осторожны, чтобы не ввести трубку в пищевод.
- Аккуратно извлеките иглу. Проверьте интубацию, поместив трубку в воду, чтобы образовались пузырьки, прежде чем подключаться к аппарату искусственной вентиляции легких.
- Подключите эндотрахеальную трубку к аппарату искусственной вентиляции легких, настроенному на 120 мкм в минуту и дыхательному объему 250 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка аппарата ИВЛ регулируется в зависимости от массы тела (как правило, более высокая масса тела требует большего дыхательного объема). - Проверьте интубацию, проверив двустороннее симметричное расширение грудной клетки. Затем соединение фиксируется к ОТ скотчем, чтобы избежать падения трубки.
- Поместите электроды ЭКГ на лапы и подключите их к регистратору ЭКГ. Контролируйте электрофизиологию сердца на протяжении всей процедуры.
2. Торакотомия
- Снимите марлю с грудной клетки. Снова продезинфицируйте области разрезов 70% спиртом, используя три цикла скрабирования. Затем накройте мышь стерильной хирургической простыней с отверстием над операционным полем, чтобы уменьшить загрязнение места операции.
- Сделайте стерильным скальпелем косой разрез кожи (0,8-1,0 см) по левой среднеключичной линии.
- Проводят тупое рассечение подкожных тканей, чтобы обнажить ребра под ними. Будьте осторожны, чтобы не повредить сосуды, ребра и легкие. Остановите кровотечение с помощью стерильных ватных аппликаторов.
- Определите и сделайте разрез около 6-8 мм в третьем межреберье. Затем проводят тупое рассечение тканей в межприбрежном пространстве для вскрытия грудной полости. Будьте осторожны, чтобы не травмировать внутреннюю грудную артерию.
- Используйте щипцы, чтобы охватить межреберье. Вставьте предварительно стерилизованные самодельные ретракторы (рис. 1C) в грудную клетку и потяните назад, чтобы расширить разрез до ~6 мм в ширину. Прикрепите втягивающие устройства к ОТ с помощью резинок.
- Осторожно удалите окружающие ткани, чтобы полностью обнажить сердце. Аккуратно оттяните перикард изогнутыми щипцами, не травмируя сердце. Теперь ясно видно сердце.
3. Лигирование LAD
ПРИМЕЧАНИЕ: LAD выглядит как тонкая красная линия, идущая перпендикулярно от верхушки и вниз через левый желудочек. LAD ярко-красного цвета, поэтому будьте осторожны, чтобы не перепутать его с веной. Обычно место перевязки находится на ~1-2 мм ниже левой ушной раковины. Эта позиция лигирования будет производить около 40%-50% ишемии в левом желудочке. Более высокое положение создаст более обширную зону инфаркта. Более дистальный участок создаст меньшую зону инфаркта.
- Используйте препарирующий микроскоп и направляйте сфокусированный и подходящий свет для визуализации LAD. Осторожно надавите на участок под выбранным положением лигирования, чтобы временно увеличить LAD (≤5 с за раз). Перепроверьте LAD таким образом.
- Используйте коническую иглу (3/8, 2,5 x 5), чтобы пропустить 8-0 шелковая лигатура под LAD под препарирующим микроскопом. Будьте осторожны с глубиной иглы: не слишком глубоко, чтобы войти в левый желудочек, и не слишком глубоко, чтобы не повредить LAD.
- Завяжите лигатуру свободным двойным узлом. Диаметр петли около 2-3 мм.
- Поместите трубку из ПЭ-10 диаметром 2-3 мм в петлю, параллельную артерии.
- Осторожно затяните лигатурную петлю, пока она не окажется вокруг артерии и трубки. Затем закрепите петлю узелком. Следите за тем, чтобы не повредить стенку миокарда чрезмерным стягивающим давлением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лигирование не проводится для группы фиктивных операций. - Подтвердить прекращение кровотока в ЛДП: наблюдают более бледный цвет передней стенки ЛЖ после перевязки. Кроме того, значительное повышение сегмента ST в течение нескольких ударов сердца также указывает на окклюзию16. Если требуется постоянная перевязка (например, ИМ), снимите трубку PE-10 и завяжите LAD непосредственно узлом. Повторите оставшуюся процедуру, как описано в шаге 4.3 ниже.
- Извлеките втягивающие устройства из разреза. Затем временно закройте рану бульдожьим зажимом. Продолжительность ишемии определяется в соответствии с планом эксперимента. Убедитесь, что мышь по-прежнему подключена к аппарату искусственной вентиляции легких.
4. Реперфузия
- Когда период ишемии закончится, снимите бульдожий зажим и снова вставьте ретракторы, чтобы открыть разрез и обнажить сердце (особенно место перевязки).
- Развяжите скользящий узел и снимите трубку PE-10. Подтвердите восстановление кровотока на этом этапе, наблюдая за изменением цвета обратно на розово-красный в течение 20 секунд. Одновременно внимательно следите за ЭКГ: потенциальное растворение подъема сегмента ST также указывает на реперфузию.
- Оставьте 8-0 лигатура in situ для последующего окрашивания Evans-Blue и TTC. В остальных случаях снимают шов на этом этапе.
- Снимите ретракторы и закройте разрез, зашив третье и четвертое ребра нейлоновым швом 4-0. Будьте осторожны, чтобы не повредить легкое. Вытолкните воздух, который может попасть в грудную полость, осторожно надавливая на грудную клетку и завязывая шовные узлы.
- Закройте мышечные слои непрерывными швами. Закройте кожу нейлоновым швом 4-0; Допустимы непрерывные швы и прерывистые швы.
5. Послеоперационный уход
- Внимательно наблюдайте за мышью на предмет признаков восстановления после анестезии, например, движения хвоста или усов. После этого мышь обычно возобновляет нормальное дыхание с частотой дыхания около 150 ударов в минуту. Экстубируйте мышь, медленно вынимая трубку.
- Понаблюдайте за мышью в течение дополнительных 3-5 минут, чтобы убедиться в отсутствии дыхательной недостаточности.
- Введите 100 мкл бупренорфина (0,1 мг/мл,.к.) после того, как мышь начнет дышать. В течение следующих 24 ч вводите дополнительную дозу каждые 4-6 ч. Назначайте ибупрофен в качестве дополнительного обезболивающего в питьевой воде в виде раствора 0,2 мг/мл в течение 2 дней до и ≤7 дней после операции.
- Держите мышей в тепле и снижайте риск смертности, используя теплоизоляционные одеяла, так как мыши склонны к гипотермии после анестезии.
6. Валидация после процедуры
- Тест на тропонин-Т
- Забор образцов крови из заглазничных сплетений и выделение сыворотки путем центрифугирования (3 000 × г, 10 мин, комнатная температура).
- Разбавьте 20 мкл сыворотки до 100 мкл физиологическим раствором для теста на тропонин-Т. Храните остальные образцы при температуре -80 °C.
- Определите Troponin T (cTnT) с помощью коммерческого набора в соответствии с инструкциями производителя.
- УЗИ сердца
ПРИМЕЧАНИЕ: УЗИ сердца используется для оценки сердечной функции и аномалий движения стенки на разных этапах до и после операции в соответствии с экспериментальным дизайном17,18. Измеряются различные параметры, такие как толщина стенки желудочка, объем желудочков, диаметр полости желудочка, фракция выброса и фракция укорочения короткой оси.- Обезболивайте мышей кетамином (80 мг/кг) и ксилазином (10 мг/кг) путем внутрибрюшинной инъекции.
- Побрейте грудь электробритвой. Используйте крем для удаления шерсти и равномерно помассируйте. Лишнюю выпавшую шерсть протрите марлей.
- Поместите мышь на ОТ и закрепите четыре конечности клейкой лентой.
- Поместите ультразвуковой датчик (30 МГц) на передний отдел сердца под углом ~ 30° к грудине. Зонд на этом снимке выровнен по длинной оси сердца. Установите ультразвук в B-режим; Левый желудочек, левое предсердие, митральный клапан и восходящая аорта могут быть четко идентифицированы. Используйте видеозахват для получения данных для последующего анализа.
- Поворачивая датчик на 90° по часовой стрелке, можно получить парастернальное изображение с короткой осью на уровне папиллярных мышц для четкого обнаружения левого и правого желудочков. Затем используйте B-режим и M-режим для оценки сердечной функции и морфометрии.
- Рассчитайте конечный диастолический диаметр левого желудочка (Dd), конечный систолический диаметр (Ds) и толщину межжелудочковой перегородки, указав соответствующее место на ультразвуковых изображениях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аппарат вручную рассчитывает конечный диастолический объем левого желудочка (LVEDV) и конечный систолический объем (LVESV). Кроме того, машина рассчитает значения дробного укорочения (FS) и фракции выброса (EF) по формулам FS = (Dd-Ds)/Dd × 100% и EF= (LVEDV-LVESV)/LVEDV × 100%. Выберите пять последовательных сердечных циклов и получите их средние значения.
- Измерение размеров инфаркта миокарда
ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения размера инфаркта используется окрашивание Evans-Blue/TTC, поскольку оно позволяет оценить жизнеспособность тканей19. Рекомендуется окрашивать в течение 72 часов после реперфузии, потому что рубец уменьшится. Этот этап выполняется после усыпления животного пентобарбиталом натрия в дозе 200 мг/кг путем внутрибрюшинной инъекции.- Снова обнажите сердце, выполнив предыдущие процедуры, описанные в шагах 2.2-2.5. Затем повторно наложите LAD в исходном месте, валидированном шовным материалом, упомянутым в шаге 4.3, в конце желаемой продолжительности реперфузии.
- Канюлируйте аорту, а затем перфузируйте сердце 0,3 мл 1% раствора Evans Blue. Миокард неишемизированной области окрашен в синий цвет. После перфузии быстро удалите сердце, разрезав аорту ножницами.
- Затем промойте сердце раствором KCl (30 мМ), чтобы остановить сердцебиение. Хранить при температуре -20 °C в течение ≥4 ч после удаления окружающей жировой ткани.
- Разрежьте сердце в поперечном направлении на пять ломтиков толщиной 1 мм с помощью острого скальпеля. Взвесьте ломтики, а затем инкубируйте их с 2% TTC в течение 40 минут при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: После инфаркта инфарктные участки выделяются белым цветом, в то время как жизнеспособные ткани в неинфарктных областях остаются красными. - Зафиксируйте срезы 4% формальдегидом на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это действие усилит контраст между инфарктной областью и неинфарктной областью. Это также уменьшит ломтики. - Сфотографируйте срезы на цифровую камеру. Затем рассчитайте зону риска (AAR), область инфаркта и неишемическую зону с помощью графического программного обеспечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: После двойного окрашивания Evans-Blue/TTC синяя область является «нормальной» областью. Остальные области (в том числе белый и красный) относятся к зонам «риска ишемии»: белая область — это область инфаркта миокарда (IA), а красная область — ишемическая (но не инфарктная) область. Принимая во внимание несоответствие размеров сердечных срезов, результаты корректируются на вес.
Назначать:
A1-A5 для Площадь зоны инфаркта / Область сердечного среза;
B1-B5 для Области неинфарктной зоны / Области сердечного среза;
W1-W5 для веса сердечного среза.
Тогда:
Общая масса инфарктного миокарда: W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5;
Общая масса неинфарктного миокарда: W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4+ W5 × B5;
Общий вес AAR = (П1 + П2 +П3 + Ш4 + Ш5) - (П1 × А1 + П2 × А2 + Ш3 × А3 + П4 × А4 + П5 × А5)
Наконец:
Площадь ишемии миокарда рассчитывается как процент ААР в левом желудочке:
Площадь инфаркта миокарда рассчитывается как процент ИА в ААР:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Экспериментальный рабочий процесс показан на рисунке 1A. Исследователь может запланировать временные узлы в соответствии с планом эксперимента после начала исследования. Продолжительность лигирования LAD определяется в соответствии с целью исследования. Для инфаркта миокарда исследование может игнорировать стадию реперфузии. УЗИ сердца доступно на разных этапах исследования, потому что оно является неинвазивным, в то время как окрашивание по методу Эванса-Блю/ТТС может быть выполнено только тогда, когда мышь принесена в жертву. Для исследований, посвященных фиброзу и ремоделированию желудочков, время наблюдения намного больше.
На рисунке 2А показаны типичные изображения для части экспериментального процесса, от эндотрахеальной интубации, разреза кожи, торакотомии, идентификации LAD, лигирования LAD до реперфузии. Для верификации ишемии и реперфузии миокарда на рисунке 2В представлены репрезентативные изображения ЭКГ со значительным подъемом сегмента ST после перевязки и растворением подъема сегмента ST при развязывании узла.
После получения образцов крови от всех мышей можно провести тест на тропонин-Т для подтверждения инфаркта. На рисунке 3А показано значительное увеличение cTnT в группах MIRI и MI по сравнению с фиктивными группами. На рисунке 3B показано двойное окрашивание по шкале Эванса-Блю и TTC для пяти последовательных поперечных срезов сердца между фиктивной группой и группой MIRI. Синяя область указывает на нормальную область, белая область указывает на область инфаркта миокарда, а красная область указывает на ишемизированную, но не инфарктную область. На рисунке 3C представлены изображения ультразвукового исследования сердца по длинной оси между симуляционной группой и группой инфаркта миокарда. Программные приложения могут быть использованы для расчета различных функциональных параметров, таких как более высокое значение фракции выброса для фиктивной группы на рисунке 3C по сравнению с группой MI.
Рисунок 1: Хирургическая установка. (А) Обзор графика эксперимента. (B) Операционный стол с предварительно разогретой грелкой и подключением электродов ЭКГ. (С) Самодельные втягивающие устройства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изменения экспериментального процесса и ЭКГ. (A)Изображения эндотрахеальной интубации, разреза кожи, торакотомии, идентификации LAD, лигирования LAD и реперфузии показаны на рисунках 1, 2, 3, 4, 5 и 6 соответственно. (B) Типичные ЭКГ-изображения ИМ и МИРИ после лигирования и реперфузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Валидация после процедуры. (А) Экспрессия сердечного тропонина в группах симуляции, MIRI 24 ч и MI 3 d. (B) Двойное окрашивание Evans -Blue/ TTC для симуляции и MIRI 24 часов. (C) УЗИ сердца для симуляций и инфаркта миокарда. ЛВИД; d, конечный диастолический внутренний размер левого желудочка; ЛВИД; s, систолический внутренний размер левого желудочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В последние годы быстрыми темпами развивается создание моделей ИМ и МИРИ в клинических и научных исследованиях20,21. Тем не менее, все еще остаются некоторые вопросы, такие как механизмы действий и способы улучшения ИМ/МИРИ, которые необходимо решить. Здесь описан модифицированный протокол создания мышиной модели ИМ и МИРИ. Необходимо тщательно рассмотреть несколько ключевых моментов.
Первый ключевой момент – эндотрахеальная интубация. Некоторые процедуры6,9 предполагают разрез кожи шейного отдела, отделение тканей с последующим обнажением грудино-идоидной мышцы для осмотра трахеи. Таким образом, исследователь может визуализировать введение трубки в трахею. Это хороший шаг для снижения риска респираторного дистресса. В современном методе исследователь может четко визуализировать закрытие и открытие голосовой щели при дыхании под осветителем, а затем легко ввести трубку в трахею. Следовательно, разрез шейки матки не делается для уменьшения травмы кожи и потенциальных инфекций, что важно в исследованиях воспалительной сигнализации. Визуальные ларингоскопы широко используются в клинической интубации трахеи: возможно, их можно использовать и у мышей. Mares et al.22 сообщили о непрерывной ингаляционной анестезии в маске без эндотрахеальной интубации, которая выполнялась путем ингаляции 2% изофлурана после индукции 5% изофлурана с введением кислорода через неинвазивную маску, надеваемую на нос и рот животного. Это позволяет избежать повреждения тканей и повысить безопасность и эффективность анестезии. Однако необходим специальный аппарат для ингаляционной анестезии. Более того, летучие анестетики могут нанести физический вред оператору.
Вторым и самым важным ключевым моментом является идентификация и лигирование LAD. Каждая ошибка в идентификации и перевязке LAD приводит к противоречивым результатам: либо слишком большой размер инфаркта приводит к смерти, либо слишком маленький размер инфаркта приводит к неудаче. Для идентификации LAD и проверки его лигирования могут применяться различные методы. Здесь для определения местоположения LAD используется диссекционный микроскоп. LAD обычно выглядит как тонкая красная линия, идущая перпендикулярно от верхушки и вниз через левый желудочек. Осторожно надавливая на участок под выбранным положением лигирования, чтобы временно увеличить LAD (≤5 с за один раз), можно снова проверить LAD. После перевязки окклюзия LAD подтверждается более бледным цветом передней стенки левого желудочка и значительным подъемом сегмента ST в течение нескольких ударов сердца. Затем развязывают лигирование, и реперфузия подтверждается изменением цвета обратно на розово-красный в течение 20 с и потенциальным растворением подъема сегмента ST на ЭКГ. Наконец, для оценки повреждения миокарда используются тест на тропонин-Т, окрашивание TTC и ультразвуковое исследование сердца. Эти многочисленные страховки и взаимные проверки делают результаты экспериментов очень надежными. Кроме того, микроманипуляция обеспечивает более высокую точность и меньшее количество осложнений (например, кровотечение). Другим важным вопросом является предположение о том, что кровеносные сосуды мышей в норме, но на самом деле некоторые коронарные артерии сильно различаются, и даже коллатеральное кровообращение может представлять23,24. Следовательно, размеры инфаркта иногда не совпадают, даже если считается, что лигации находятся на одном уровне. Здесь представлены преимущества микроскопа. Перевязка не может быть сделана только на основании опыта или анатомических ориентиров: LAD и его направление должны быть четко выверены перед перевязкой, иначе результаты будут ненадежными. В некоторых экспериментах 6,8 мыши находятся в правостороннем положении пролежней для удобства наблюдения за передней стенкой левого желудочка и коронарными артериями после воздействия на сердце.
У этой модели есть два основных ограничения. Во-первых, LAD-лигирование не может имитировать окклюзию правой коронарной артерии. На самом деле, из-за анатомических различий между животными25, у мышей и крыс LAD обычно распространяется на верхушку сердца, а левые огибающие ветви не развиты, поэтому модели у мышей и крыс устанавливаются путем лигирования LAD. Для крупных и средних животных, таких как кролики и свиньи, LAD относительно короткий, в то время как левая огибающая артерия покрывает большую площадь сердца, поэтому для создания модели выбирается перевязка левой огибающей артерии. Sicard et al.26 сообщили о новом методе исследования дисфункции правого желудочка и бивентрикулярного взаимодействия путем перевязки правой коронарной артерии у мышей, который может исправить это ограничение. Вторым ограничением является непостоянный размер инфаркта из-за вариабельности анатомии коронарных артерий27 и опыта хирурга. Как уже говорилось выше, микроскоп очень важен для повышения консистенции путем проверки LAD и его направления перед лигированием, а для опытного исследователя может быть достигнута корректировка положения лигирования после полной оценки анатомии сосудов.
Заслуживают внимания и некоторые другие вопросы. Например, торакотомия и прокалывание иглой неизбежно приведут к незначительному повреждению мышц и миокарда, что может привести к воспалению. Кроме того, сообщалось, что анальгетики оказывают влияние на ИМ28. Следовательно, эти факторы должны приниматься во внимание при анализе воспаления или его влияния на ИМ. Для устранения неполадок существует несколько факторов, которые могут привести к гибели мышей. Например, осложнения, связанные с инфарктом миокарда, анестезией и кровотечением. Более того, противоречивые результаты в основном связаны с неправильным положением лигирования: слишком высокое положение лигирования может привести к слишком большому размеру инфаркта даже к смерти мышей; между тем, ложная идентификация LAD приведет к отказу модели. В этом методе необходимо доработать некоторые детали. Например, было бы лучше, если бы можно было ввести ректальный зонд для контроля температуры во время процедуры. И последнее, но не менее важное: экспериментатор должен помнить о различиях между исследованиями на животных и клиническими реалиями, особенно о том, что 30-минутное время ишемии действительно довольно мало для клинических исследований. Мы рекомендуем исследователю расположить этапы в соответствии с планом эксперимента, включая время ишемии. Только в этом смысле данный протокол может быть полезен для изучения механизма и лечения ИМ/МИРИ и разработки лекарственных препаратов.
Короче говоря, представлена простая и репродуктивная мышиная модель для MIRI и MI. Данная модель может быть использована для изучения механизмов ИМ/МИРИ и терапевтических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82070317, 81700390 Цзибинь Линь, 8210021880 Бинцзе Лю и 82000428 Боюань Ван) и Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2017YFA0208000 Шаолинь Хэ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % sodium chloride solution | Kelun Industry Group,China | - | |
| 4% paraformaldehyde fixing solution | Servicebio,China | G1101 | - |
| 4-0 silk suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | C412 | - |
| 8-0 suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | H801 | - |
| Buprenorphine | IsoReag,China | IR-11190 | - |
| Camera | Canon,Japan | EOS 80D | - |
| Depilatory cream | Veet,French | - | |
| Elecsys Troponin T hs STAT | Roche,Germany | - | |
| Electrochemical luminescence immunoanalyzer | Roche,Germany | Elecsys 2010 | - |
| Evans blue | Sigma,America | E2129 | - |
| Eye scissors | Shanghai Medical Instruments,China | JC2303 | - |
| Haemostatic forceps | Shanghai Medical Instruments,China | J31020 | - |
| High frequency in vivo imaging systems | Visualsonics,Canada | Vevo2100 | - |
| Ibuprofen | PerFeMiKer,China | CLS-12921 | - |
| Intravenous catheter | Introcan,Germany | 4254090B | - |
| Ketamine | Sigma-Aldrich,America | K2753 | - |
| Medical alcohol | Huichang ,China | - | |
| Microneedle holders | Shanghai Medical Instruments,China | WA2040 | - |
| Microscopic shears | Shanghai Medical Instruments,China | WA1040 | - |
| Microsurgical forceps | Shanghai Medical Instruments,China | WA3020 | - |
| Mouse electrocardiograph | Techman,China | BL-420F | - |
| Needle holders | Shanghai Medical Instruments,China | JC3202 | - |
| operating floor | Chico,China | ZK-HJPT | - |
| PE-10 tube | Huamei,China | - | |
| Pentobarbital | Merck,America | 1030001 | - |
| Rodent Ventilator | Shanghai Alcott Biotech,China | ALC-V8S-P | - |
| Stereo microscope | Aomei Industry,China | SZM0745-STL3-T3 | - |
| Surgical thermostatic heating pad | Globalebio, China | GE0-20W | - |
| Triphenyltetrazolium chloride | Servicebio,China | G1017 | - |
| Xylazine | Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China | 323004 | - |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P.
- Ibanez, B., Heusch, G., Ovize, M., Van de Werf, F. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. Journal of the American College of Cardiology. 65 (14), 1454-1471 (2015).
- Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3896 (2012).
- Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury through ligation of the left anterior descending artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51329 (2014).
- Xu, Z., McElhanon, K. E., Beck, E. X., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Methods in Molecular Biology. 1717, 145-153 (2018).
- Muthuramu, I., Lox, M., Jacobs, F., De Geest, B. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52206 (2014).
- Reichert, K., et al. Murine left anterior descending (LAD) coronary artery ligation: An improved and simplified model for myocardial infarction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55353 (2017).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59591 (2019).
- Li, X., et al. Cardioprotective effects of Puerarin-V on isoproterenol-induced myocardial infarction mice is associated with regulation of PPAR-Y/NF-Kappa B pathway. Molecules. 23 (12), 3322 (2018).
- Vanden Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
- Wang, D., et al. A cryoinjury model to study myocardial infarction in the mouse. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), e59958 (2019).
- Brooks, W. W., Garibaldi, B. A., Conrad, C. H. Myocardial injury in the mouse induced by transthoracic cauterization. Laboratory Animal Science. 48 (4), 374-378 (1998).
- Tao, B., et al. Preclinical modeling and multimodality imaging of chronic myocardial infarction in minipigs induced by novel interventional embolization technique. EJNMMI Research. 6 (1), 59 (2016).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circulation Research. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of myocardial ischemia and reperfusion injury in mice using surface pad electrocardiography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54814 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. High-frequency high-resolution echocardiography: First evidence on non-invasive repeated measure of myocardial strain, contractility, and mitral regurgitation in the ischemia-reperfused murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), e1781 (2010).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. Murine echocardiography and ultrasound imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2100 (2010).
- Shibata, R., et al. Adiponectin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury through AMPK- and COX-2-dependent mechanisms. Nature Medicine. 11 (10), 1096-1103 (2005).
- Anderson, J. L., Morrow, D. A.
- Frank, A., et al. Myocardial ischemia reperfusion injury: From basic science to clinical bedside. Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 16 (3), 123-132 (2012).
- Mares, R. G., et al. Studying the innate immune response to myocardial infarction in a highly efficient experimental animal model. Romanian Journal of Cardiology. 31 (3), 573-585 (2021).
- Fernandez, B., et al. The coronary arteries of the C57bl/6 mouse strains: Implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zhang, R., Hess, D. T., Reynolds, J. D., Stamler, J. S. Hemoglobin S-nitrosylation plays an essential role in cardioprotection. Journal of Clinical Investigation. 126 (12), 4654-4658 (2016).
- Sorop, O., et al. Experimental animal models of coronary microvascular dysfunction. Cardiovascular Research. 116 (4), 756-770 (2020).
- Sicard, P., et al. Right coronary artery ligation in mice: A novel method to investigate right ventricular dysfunction and biventricular interaction. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 316 (3), 684-692 (2019).
- Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).
- Kato, R., Foex, P. Myocardial protection by anesthetic agents against ischemia-reperfusion injury: An update for anesthesiologists. Canadian Journal of Anaesthesia. 49 (8), 777-791 (2002).
