Summary
Dieses Papier beschreibt grundlegende Methoden zur Standardisierung wichtiger Faktoren wie Dichte, Futterverfügbarkeit, Hydratationsquelle und Umweltkontrollen für die langfristige Aufzucht von Laborkulturen der essbaren Grille Gryllus bimaculatus.
Abstract
Gryllus bimaculatus (De Geer) ist eine Grille, die in ganz Afrika und Süd-Eurasien verbreitet ist, wo sie oft als menschliche Nahrung wild geerntet wird. Außerhalb seines natürlichen Verbreitungsgebiets ist die Kultivierung von G. bimaculatus aufgrund seiner diätetischen Plastizität, seines schnellen Fortpflanzungszyklus, des Fehlens von Diapauseanforderung, seiner Toleranz für eine Aufzucht mit hoher Dichte und seiner Robustheit gegen Krankheitserreger möglich. So kann G. bimaculatus ein vielseitiges Modell für Studien der Physiologie, des Verhaltens, der Embryologie oder der Genetik von Insekten sein.
Kulturelle Parameter wie Besatzdichte, Refugien innerhalb des Käfigs, Photoperiode, Temperatur, relative Luftfeuchtigkeit und Ernährung beeinflussen das Wachstum, das Verhalten und die Genexpression von Grillen und sollten standardisiert werden. In der aufkeimenden Literatur über die Zucht von Insekten für den menschlichen Verzehr werden diese Grillen häufig zur Bewertung von Futtermittelzusatzmitteln verwendet, die aus Ernterückständen, Nebenprodukten der Lebensmittelverarbeitung und anderen kostengünstigen Abfallströmen gewonnen werden.
Zur Unterstützung laufender Experimente zur Bewertung der Wachstumsleistung von G. bimaculatus und der Ernährungsqualität als Reaktion auf variable Futtersubstrate wurde ein umfassender Satz von Standardprotokollen für Zucht, Pflege, Handhabung, Messung und Euthanasie im Labor entwickelt, die hier vorgestellt werden. Ein branchenübliches Cricket-Futter hat sich als ernährungsphysiologisch angemessen und funktionell geeignet für die langfristige Pflege von Cricket-Zuchttieren sowie für die Verwendung als experimentelles Kontrollfutter erwiesen. Die Aufzucht dieser Grillen mit einer Dichte von 0,005 Grillen / cm 3 in 29,3-Liter-Polyethylenkäfigen mit Bildschirmspitze bei einer Durchschnittstemperatur von 27 ° C bei einer Photoperiode von 12 hellen (L) / 12 dunklen (D) Lichtverhältnissen, wobei angefeuchteter Kokosnusskokos sowohl als Hydratationsquelle als auch als Eiablagemedium dient, hat gesunde Grillen über einen Zeitraum von 2 Jahren erfolgreich aufrechterhalten. Nach diesen Methoden ergaben Grillen in einem kontrollierten Experiment eine durchschnittliche Masse von 0,724 g 0,190 g bei der Ernte, wobei 89% Überleben und 68,2% Geschlechtsreifung zwischen Besatz (22 Tage) und Ernte (65 Tage) lagen.
Introduction
Wie durch das ikonische Insekt, die Fruchtfliege Drosophila melanogaster , typisiert, bietet die Verwendung von Insekten als Labormodellorganismen deutliche Vorteile für Studien in Genetik, Toxikologie und Physiologie1. Die geringe Größe der Insekten reduziert den Platzbedarf für Kulturen und die Menge an Futter- und Verbrauchsmaterialien. Viele Insekten vermehren sich schnell und eignen sich daher hervorragend für die Erstellung spezialisierter genetischer Linien und Studien, die die Bewertung mehrerer aufeinanderfolgender Generationen erfordern.
Viele Studien konzentrieren sich auf holometabole Insekten wie Drosophila, die eine vollständige Metamorphose und Verpuppung aufweisen. Es sind jedoch auch andere Modelle erhältlich, darunter Gryllus bimaculatus (De Geer), die zweipunktige Feldgrille. G. bimaculatus ist ein paurometaboles Insekt, das zwischen 7 und 11 Nymphenstadien durchläuft, bevor es die Geschlechtsreife erreicht2. Diese Grille zeigt eine breite Palette von Verhaltensweisen im Zusammenhang mit der sexuellen Selektion, einschließlich Stridulation, territorialer Darstellungen und Partnerbewachung3. Unreife Grillen unterscheiden sich von den Larven holometaboler Insektenarten dadurch, dass sie, ähnlich wie viele paurometabole Jungtiere, in der Lage sind, verlorene und beschädigte Gliedmaßen während der Ekdysis4 zu regenerieren. Darüber hinaus wurde das vollständig sequenzierte Genom von G. bimaculatus im Jahr 2021 veröffentlicht5. Diese Eigenschaften machen diese Grillen als Ziel für die Grundlagenforschung attraktiv.
Zweipunkt-Feldgrillen werden häufig für die menschliche Nahrung und das Tierfutter gezüchtet. Der Umfang dieser Operationen ist oft viel größer als bei der Laborforschung 6,7. Trotz des Unterschieds in der Größenordnung überschneiden sich die Herausforderungen, mit denen die Forscher konfrontiert sind, stark mit denen, mit denen kommerzielle Cricket-Landwirte konfrontiert sind. Diese Überlegungen laufen im Kontext der laborbasierten Forschung zusammen, die darauf abzielt, die Produktion von essbaren Insekten zu verbessern. Da sich die essbare Insektenindustrie weiter entwickelt und wächst, ist die Optimierung der Futtereinträge und unzähliger anderer Aspekte der Produktion ein primäres Ziel8. Laborstudien, die gemessene Verbesserungen der Aufzuchteffizienz, des Überlebens oder der Erzeugungszeit in diesen Grillen zeigen, haben das Potenzial, die Rentabilität von Grillenzuchtbetrieben langfristig zu steigern.
Standardisierte Aufzuchtprotokolle ermöglichen einen engeren Vergleich zwischen Studien, die die Zuchtoptimierung untersuchen. Bis heute wurden nur wenige eingehende Protokolle für die Aufzucht von G. bimaculatus im Labor veröffentlicht. Ein ideales Protokoll würde die Bedingungen widerspiegeln, die in realen Cricket-Landwirtschaftsbetrieben auftreten, während die streng kontrollierten Bedingungen beibehalten werden, die notwendig sind, um Änderungen der Wachstumsleistung aus experimentellen Behandlungen genau zu messen und Risikominderungsstrategien hervorzuheben. Die in diesem Artikel beschriebenen Methoden wurden auf der Grundlage veröffentlichter Protokolle, Techniken und Vorrichtungen entwickelt, die zur Aufzucht einer Vielzahl von Grillenarten in einem breiten Spektrum von Labor- und kommerziellen Produktionsmaßstäben 2,9,10,11,12 verwendet werden. Diese Methoden werden auch von mehreren nicht von Experten begutachteten Quellen beeinflusst, darunter unveröffentlichte technische Bulletins und persönliche Kommunikation mit kommerziellen Cricket-Landwirten in Nordamerika. Dieses Protokoll wurde mit der Absicht entwickelt, die Etablierung von Laborkulturen von G. bimaculatus speziell für die Verwendung in Versuchen im Zusammenhang mit der Insektenzucht zu erleichtern.
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Protocol
1. Vorbereitung des Eiablagesubstrats
HINWEIS: Kokoskokos ist ein ideales Eiablagesubstrat für G. bimaculatus. Ausführliche Methoden zur Trennung von Kokos von komprimiertem Kokosstein und einen Hinweis zur Atemsicherheit finden Sie in Schritt 1.1 Ergänzende Materialien .
- Waschen Sie die Hände mit Wasser und Seife.
- Tränken Sie einen sauberen Behälter auf einer Waage und wiegen Sie eine Masse trockenen Kokosnusskokos, die ungefähr so groß ist wie eine menschliche Faust.
- Legen Sie Kokos in einen verschließbaren, sauberen Behälter, der eine Ausdehnung bis zu 6x des ursprünglichen Volumens aufnehmen kann.
- Brechen Sie mit sauberen Händen vorsichtig Kokosklumpen aus dem Stück auf, das aus dem größeren Block entfernt wurde.
- Messen Sie mit einem 50-ml-Messzylinder das richtige Volumen von deionisiertem (DI) Wasser, um ein Verhältnis von 5:1 zu einem Massenverhältnis von fünf Teilen Wasser zu einem Teil Trockenkokos zu erreichen.
- Fügen Sie das gemessene DI-Wasser langsam hinzu und hydratisieren Sie gleichmäßig alle Kokospartikel. Mazerieren Sie Klumpen manuell, um eine gleichmäßige Flüssigkeitszufuhr zu gewährleisten.
- Wiederholen Sie den Behälter, in dem der Kokos zuvor gewogen wurde.
- 75 g benetztes Kokos abwägen.
- 75 g des benetzten Kokos mit einem sauberen Plastiklöffel in eine 100 mm x 15 mm große Petrischale geben, um sicherzustellen, dass der Kokos gleichmäßig um den Boden der Schale verteilt wird und keine Klumpen entstehen.
- Beschriften Sie die Seite der Petrischale mit Laborklebeband mit einem Etikett, das die Geburtskolonie und das Datum der Eizellentnahme angibt.
- Messen Sie zusätzlich 45 ml DI-Wasser in einem Messzylinder.
- Fügen Sie Wasser gleichmäßig über die Oberfläche des verpackten Kokos in der Petrischale hinzu, um eine gleichmäßige Hydratation zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass der Kokos so gesättigt ist, dass sich das Wasser etwa 1/4 der Seite des Behälters ansammelt.
- Sobald die Petrischale verpackt ist, verschließen Sie das verbleibende benetzte Kokos in einem luftdichten Gefäß zur Lagerung bei -20 ° C.
HINWEIS: Nach den in diesem Artikel vorgeschriebenen Methoden erreichen G. bimaculatus-Personen nach durchschnittlich 58 Tagen nach der Eiablage die Geschlechtsreife. - Eier sammeln
- Legen Sie das hydratisierte Eiablagesubstrat in Käfige, die die gewünschten Elternbestände von Grillen enthalten, so weit wie möglich vom Futter entfernt, da Grillen das Futtergranulat mechanisch auf das Eiablagesubstrat übertragen können.
- Dokumentieren Sie Datum und Uhrzeit.
HINWEIS: Die standardisierte Arbeitsdichte für reproduktive Grillenkolonien, die nach diesen Methoden aufgezogen werden, beträgt n = 150 erwachsene Individuen. Bei dieser Dichte ergibt ein 24-Stunden-Eiablagefenster zwischen 800 und 1.500 Eier, abhängig vom Alter der Kolonie, dem vorherigen Eiablageaufwand und dem Geschlechterverhältnis des Elternkäfigs. - Stellen Sie einen kleinen autoklavierbaren Müllbehälter auf die Arbeitsfläche, um das Eindämmungsrisiko zu berücksichtigen, das durch die Handhabung und Reinigung eireicher Eiablagesubstrate entsteht.
- Stellen Sie einen sauberen, leeren 29,3 l Kunststoffkäfig auf die Bank neben dem Müllbehälter, der als Empfängerkäfig für das eireiche Eiablagesubstrat dient.
- Stellen Sie den 29,3-Liter-Käfig mit den Elterngrillenbrühen und dem Eiablagesubstrat auf die gegenüberliegende Seite des Müllbehälters aus dem leeren Käfig.
- Entfernen Sie nach 24 Stunden das Eiablagesubstrat aus dem Elterngrillenkäfig und platzieren Sie es über einem autoklavierbaren Abfallbehälter.
- Untersuchen Sie die Oberseite des Eiablagesubstrats auf Partikel von Frass oder Futter, die die Grillen möglicherweise auf die Oberfläche des Kokos getreten haben.
HINWEIS: Jede Substanz, die keine Eimasse oder Kokos ist, kann dazu führen, dass sich während der Inkubation Schimmel auf dem Substrat bildet. - Entfernen Sie Kokosverunreinigungen mit einer sauberen Schaufel oder einem Plastiklöffel in das Abfallgefäß.
- Legen Sie den Plastiklöffel in den Abfallbehälter.
- Legen Sie das gereinigte Eiablagesubstrat in den sauberen 29,3-Liter-Käfig.
- Stellen Sie den Käfig in einen Inkubator, der auf 27 °C bei 60% relativer Luftfeuchtigkeit bei einer Photoperiode von 12 h D/12 h L eingestellt ist.
- Bringen Sie den Käfig mit dem Zuchtbestand an den ursprünglichen Standort zurück und entfernen Sie alle Gegenstände von der Arbeitsfläche.
- Stellen Sie den Abfallbehälter in einen Gefrierschrank in der Einrichtung, der für die Lagerung von Gegenständen bestimmt ist, die möglicherweise mit Grilleneiern kontaminiert sind.
- Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit 10% Bleichlösung und lassen Sie sie 60 s ruhen.
- Wischen Sie die Arbeitsfläche mit einem sauberen Papiertuch trocken. Öffnen Sie den Gefrierschrank und entsorgen Sie das Papiertuch im Abfallbehälter.
- Tägliches Vernebeln und Überwachen von Eisubstraten
HINWEIS: Informationen zu Methoden zur Kalibrierung des von einer Sprühflasche abgegebenen Nebelvolumens finden Sie unter Schritt 1.2 für Zusatzmaterialien .- Positionieren Sie eine Sprühflasche über dem Eiablagesubstrat, so dass das abgepumpte Wasser gleichmäßig über die Oberfläche des Substrats verteilt wird.
- Führen Sie die Anzahl der Pumpenbetätigungen durch, die im Schritt 1.2 " Zusätzliche Materialien " für jedes Eiablagesubstrat an 11 aufeinanderfolgenden Tagen berechnet wurden.
- Überprüfen Sie jedes Eiablagesubstrat täglich und überwachen Sie das Wachstum von filamentösen Schimmelpilzen auf der Oberfläche des Kokos.
- Wenn Pilzwachstum beobachtet wird, verwenden Sie einen sauberen Löffel oder eine Schaufel, um Flecken von Oberflächenschimmel zu entfernen.
- Entsorgen Sie das Werkzeug und das entfernte Kokos in dem im Gefrierschrank gelagerten autoklavierbaren Abfallbehälter.
HINWEIS: Es ist unklar, ob sich der Schimmel negativ auf die Cricket-Entwicklung auswirkt. - Beginnen Sie am Tag 11 nach der Eiablage, das Substrat für junge Grillen genau zu betrachten.
HINWEIS: Bei 27 °C benötigen die Eier von G. bimaculatus 11-13 Tage, um zu schlüpfen.
- Aufstellen von Geburtskäfigen
- Wählen Sie zwei ungenutzte 30,8 cm x 30,8 cm (12 Zoll x 12 Zoll) kommerzielle Eierkarton-Flats. Schneiden Sie diese mit einem Gebrauchsmesser oder einer starken Schere in sechs separate 10,1 cm (4")-breite Streifen gleicher Größe. Bürsten Sie die Schnittkanten mit den Händen ab, um baumelnde Papppartikel zu entfernen.
- Legen Sie die sechs einzelnen 10,1 cm x 30,8 cm (4 Zoll x 12 Zoll) großen Kartonstücke vertikal in den Boden des Käfigs, wobei die längere Achse des Kartons die schmalere horizontale Achse eines 29,3-Liter-Käfigs überspannt. Legen Sie ein siebtes Stück Karton flach über die Oberseite der sechs aufrechten Stücke.
- Wählen Sie drei Stücke grobes braunes Papiertuch ca. 25 cm x 25 cm. Falten Sie jedes in zwei Hälften. Platzieren Sie zwei so, dass sie die Oberseite der proximalen Seite der Kartonstruktur bedecken. Legen Sie eine über den Kartonstapel auf der distalen Seite.
- Bewegen Sie das Eiablagesubstrat am Tag 11 nach der Eiablage in die proximale rechte Ecke des Käfigs.
- Pflege für frühe Instars
HINWEIS: Am Tag 14 nach der Eiablage sind die meisten lebensfähigen Eier geschlüpft und Cricketnymphen im Frühstadium benötigen Futter und Wasser. Junge Grillen sind nicht in der Lage, die Oberflächenspannung von Wassertröpfchen zu brechen und können ertrinken, wenn Wasser in ihrer Umgebung gesammelt wird. Sie sind jedoch auch empfindlich gegenüber Austrocknung. Die Bereitstellung einer konstanten relativen Luftfeuchtigkeit von etwa 60% in diesem Entwicklungsstadium ist wichtig, um das Überleben zu sichern.- Wenn eine Luke beobachtet wird, besprühen Sie die Papierhandtücher, die in Schritt 1.4.3 über die Oberseite der Kartons gelegt wurden, bis sie benetzt, aber nicht aktiv Wasser vergießen.
- Wischen Sie beide Seiten eines 100 mm langen Petrischalendeckels gründlich mit 70% Ethanol ab und lassen Sie ihn trocknen. Verwenden Sie es als Behälter, in dem Cricket-Futter geliefert wird.
HINWEIS: Grillen im ersten Stadium benötigen in späteren Entwicklungsstadien kleinere Futterpartikel als Grillen. Dieses feinere Futter sollte Grillen in den ersten 20 Tagen nach dem Auftauchen verabreicht werden. - Schöpfen Sie 50 g der Zuführung in einen 60-Watt-Einzelportionsmixer und mahlen Sie ihn bei 10.000 U / min für 1 min.
- Messen Sie 1 g des Futters und schütteln Sie es auf den Petrischalendeckel im Käfig. Verteilen Sie das Futter mit dem sauberen Ende eines Löffels oder einer Schaufel so gleichmäßig wie möglich über den Boden des Gerichts.
- Ersetzen Sie den Feed alle 2 Tage. Verwenden Sie das Ende des Löffels, um Grillen aus der Futterschale zu bürsten, bevor Sie sie entfernen. Entsorgen Sie das alte Futter im autoklavierbaren Abfallbehälter.
- Überwachen Sie das Schimmelwachstum auf dem Futter. Wenn das Futter weiß oder grünlich erscheint, entsorgen Sie die Petrischale und füttern Sie sofort.
- Verwenden Sie 14 Tage nach der Eiablage einen 2,54 cm (1 Zoll) großen Pinsel, um Grillen zu entfernen, die am Geburtskokossubstrat haften, indem Sie alle Grillen von der Kokosoberfläche und den Seiten der Petrischale in den Käfig bürsten.
- Legen Sie das entfernte Eiablagesubstrat in den autoklavierbaren Abfallbehälter und lagern Sie es bis zum Autoklavieren im Gefrierschrank.
- Ersetzen Sie das Geburtssubstrat durch eine frische Kokosschale zur Hydratation, die gemäß den Schritten 1.1.5-1.1.9 zubereitet wird.
- Verwenden Sie eine DI-Wasserwaschflasche, um Wasser hinzuzufügen, bis die Oberfläche des Kokos glitzert, sich aber nicht sammelt.
HINWEIS: Die Cricket-Dichte beeinflusst stark die Wachstumsleistung von G. bimaculatus13. Wenn der Zuchtbestand bei übermäßiger Dichte gehalten wird, besteht die Gefahr, dass unerwünschte, durch Crowding induzierte epigenetische Effekte in Experimente gelangen, in denen ihre Nachkommen verwendet werden9. Grillen müssen aus den hohen Dichten, die aus den Eiablagesubstraten hervorgehen, "ausgedünnt" und in Dichten verteilt werden, die dem Standard von 0,005 Grillen / cm3 Raum entsprechen.
2. Pflege von Stadien drei bis Erwachsene
- Aufstellen von Käfigen
HINWEIS: Ausführliche Informationen zur Technik zur Konstruktion des abgesiebten Deckels finden Sie in Schritt 1.3.1 Ergänzende Materialien .- Wiederholen Sie Schritt 1.4.1.
- Installieren Sie fünf geschnittene Eierkartonstücke am distalen Ende des Käfigs, so dass die eiförmigen Konkavitäten nach außen zeigen. Stellen Sie sicher, dass sich die kurzen Enden an den Seiten des Käfigs befinden, die lange Seite flach gegen den Boden liegt und zwischen jedem Stück Karton etwa 3 cm Platz vorhanden sind.
- Legen Sie das letzte geschnittene Kartonstück auf die aufrechten Kartonstücke, z. B. das Dach eines Hauses, wie in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt.
- Befolgen Sie die Schritte 1.1.8-1.1.13, um die Hydratationssubstrate vorzubereiten.
- Legen Sie das Hydratationssubstrat in die proximale rechte Ecke des Grillenkäfigs, wie in Ergänzende Abbildung S2 gezeigt.
- Verwenden Sie eine Waschflasche, um 6-10 ml DI-Wasser hinzuzufügen, bis die Kokosoberfläche nass und reflektierend erscheint, aber der Kokos nicht vollständig untergetaucht ist.
HINWEIS: Die Oberfläche sollte leicht gegrübt erscheinen, wobei die Oberflächenspannung dazu führt, dass das Wasser den Konturen des Kokos folgt. - Drehen Sie den Deckel einer 100 mm Petrischale um und legen Sie ihn auf die proximale linke Seite des Käfigs. Fügen Sie 2-3 g Standard-Cricket-Futter hinzu, wie in Ergänzende Abbildung S2 gezeigt.
- Ändern der Koloniedichte
HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt 20 Tage nach dem Schlüpfen durch oder wenn die Grillen eine durchschnittliche Masse von 0,01 g erreichen.- Stellen Sie auf der Arbeitsfläche einen großen Behälter auf, der den Grundriss von drei nebeneinander stehenden 29,3-Liter-Käfigen aufnehmen kann.
HINWEIS: Dies ist eine sekundäre Eindämmung und kontrolliert Grillen, die während ihres Transfers von einer Kolonie in eine andere entkommen. - Entfernen Sie die ursprüngliche Kolonie aus dem Aufzuchtgestell und legen Sie sie auf die Arbeitsfläche.
- Stellen Sie auf der rechten Seite der ursprünglichen Kolonie einen leeren Käfig der gleichen Größe auf.
- Stellen Sie auf der rechten Seite des leeren Käfigs einen Käfig auf, der gemäß den Schritten 2.1.1-2.1.7 eingerichtet wurde.
- Stellen Sie sicher, dass Grillen nicht an der Unterseite des abgeschirmten Deckels des Käfigs mit den Grillen haften. Wenn Sie beobachtet werden, tippen Sie auf die Oberseite des Käfigs, um sie zu entfernen.
- Öffnen Sie den abgeschirmten Deckel des Käfigs, der die Grillen enthält.
- Übertragen Sie in einer sanften, sanften Bewegung den "Dach" -Karton und alle Grillen, die an seinen Konturen haften, in den mittleren Käfig.
- Sobald sich der Karton im mittleren Käfig befindet, rühren Sie den Karton vorsichtig gegen die Seiten, um alle Grillen zu entfernen.
- Überprüfen Sie visuell, ob alle Grillen frei geschüttelt wurden, bevor Sie das Kartonstück auf die proximale Seite des Ursprungskäfigs zurückbringen, damit die verbleibenden Grillen am Karton haften können.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.8-2.2.9 mit allen Kartonteilen im Käfig und arbeiten Sie nacheinander von der Vorderseite bis zur Rückseite des ursprünglichen Käfigs, bis alle Grillen in den mittleren Käfig übertragen wurden.
- Kippen Sie vorsichtig den mittleren Käfig mit den Grillen, so dass alle enthaltenen Grillen in die untere Ecke gerichtet sind.
- Heben Sie den Käfig mit den Grillen über den Empfängerkäfig.
- Kippen Sie den Spenderkäfig langsam, so dass die Grillen an den Seiten zu kaufen beginnen und sich kontrolliert aus der Masse in der unteren Ecke bewegen können, wie in Ergänzende Abbildung S3 gezeigt.
- Wenn Grillen zu schnell vorrücken, passen Sie den Winkel an, in dem der mittlere Käfig gehalten wird, wodurch die Grillen zurückfallen.
- Während der Käfig geneigt ist, verwenden Sie einen 2,54 cm (1 Zoll) Pinsel, um die Grillen in den Empfängerkäfig zu leiten, und zählen Sie jeden, bis die Gesamtzahl 150 Personen entspricht. Verwenden Sie den Pinsel, um diejenigen abzuschrecken, die für eine genaue Zählung zu schnell vorrücken.
- Beschriften Sie den neu bestückten Grillenkäfig mit Datum, elterlichem Bestand und der Anzahl der enthaltenen Grillen.
- Euthanasieren Sie überschüssige Grillen, die sich noch im Boden der Mitte und der Originalbehälter befinden, human, indem Sie den gesamten Behälter für mindestens 30 Minuten bei -20 ° C in einen Gefrierschrank legen.
- Überprüfen Sie den Ursprungskäfig, um sicherzustellen, dass alle Grillen übertragen wurden.
- Positionieren Sie die Grillenkäfige auf Pflanzengestellen, die 25 cm unter Lichthauben liegen, die Vollspektrum-Leuchtstofflampen enthalten, die auf einen Outdoor-Timer für Wohnzwecke eingestellt sind, der so programmiert ist, dass er eine 12-stündige L / D-Photoperiode aufrechterhält. Siehe ergänzende Abbildung S4.
- Bringen Sie alle Frassen, Schalen aus verbrauchtem Hydratationssubstrat und -futter, Papierhandtuch, Exuvien und toten Grillen, die im Ursprungskäfig verbleiben, in den autoklavierbaren Abfallbehälter.
- Sofern der Abfall nicht sofort autoklaviert werden soll, lagern Sie ihn in einem Gefrierschrank in der Anlage bei -20 °C.
- Untersuchen Sie den Boden, die Arbeiterkleidung, den sekundären Eindämmungskäfig und die Arbeitsfläche auf entflohene Grillen.
- Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche und den sekundären Einschließungskäfig mit 10% Bleichlösung und entsorgen Sie die Papiertücher in den autoklavierbaren Abfallbehälter.
- Stellen Sie auf der Arbeitsfläche einen großen Behälter auf, der den Grundriss von drei nebeneinander stehenden 29,3-Liter-Käfigen aufnehmen kann.
- Fütterung und Bewässerung
- Öffnen Sie den luftdichten Futtervorratsbehälter und füllen Sie einen leeren 100-ml-Probenbecher mit Cricket-Futter. Greifen Sie in jede Kolonie und legen Sie ein Viertel des im Becher gehaltenen Futters in den Petrischalendeckel, der das Futter hält.
- Um Grillen zu gießen, bereiten Sie eine Petrischale mit Kokos vor, indem Sie die Schritte 1.1.9-1.1.13 ausführen.
- Erhöhen Sie die Futterrate entsprechend der Verbrauchsrate, um die Verfügbarkeit von Ad-libitum-Feeds sicherzustellen.
HINWEIS: Die Nachfrage nach Cricket-Futter ändert sich im Laufe der Entwicklung.
- Transfer von Grillen in saubere Käfige
- Bringen Sie die Grillen alle 2 Wochen in saubere Käfige. Replizieren der Anordnung der Käfige aus den Schritten 2.2.1-2.2.4
HINWEIS: In den Konkavitäten der Eierkartons haben sich erhebliche Mengen an Frass angesammelt. - Übertragen Sie Grillen in saubere Käfige, indem Sie die Schritte 2.2.5-2.2.23 ausführen.
- Manövrieren Sie die Kartons vorsichtig, so dass der Großteil des Frass in den Ursprungskäfig fällt, während sich Grillen während der Wiederholung der Schritte 2.2.7-2.2.10 am Karton festhalten können.
- Verwenden Sie eine Bürste oder einen Plastiklöffel, um Grillen, die in der Frass gefangen sind, zu ermutigen, sich vom mittleren Käfig in einen sauberen Käfig zu bewegen.
- Überprüfen Sie den Ursprungskäfig, um sicherzustellen, dass alle Grillen übertragen wurden.
- Bringen Sie alle Frassen, Schalen aus verbrauchtem Hydratationssubstrat und -futter, Papierhandtuch, Exuvien und toten Grillen, die im Ursprungskäfig verbleiben, in den autoklavierbaren Abfallbehälter.
- Sofern der Abfall nicht sofort autoklaviert werden soll, lagern Sie ihn in einem Gefrierschrank in der Anlage bei -20 °C.
- Untersuchen Sie den Boden, die Arbeiterkleidung, den sekundären Eindämmungskäfig und die Arbeitsfläche auf entflohene Grillen.
- Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche und den sekundären Einschließungskäfig mit 10% Bleichlösung und entsorgen Sie Papierhandtücher in autoklavierbaren Abfallbehältern.
- Bringen Sie die Grillen alle 2 Wochen in saubere Käfige. Replizieren der Anordnung der Käfige aus den Schritten 2.2.1-2.2.4
- Aufbau von Versuchskäfigen
HINWEIS: Versuchskäfige sind Kunststoffbehälter, die weniger Grillen beherbergen. Ihr Aufbau ist identisch mit den 29,3-Liter-Käfigen, die Zuchtbestände enthalten, aber auf 7,1-Liter-Behälter angewiesen sind, die mit kleineren Schalen aus Wasser und Futter bestückt sind und eine reduzierte Eierkartonoberfläche enthalten.- Legen Sie sechs 10,1 cm x 15,4 cm (4 Zoll x 6 Zoll) große Kartonstücke in das distale Ende jedes Versuchskäfigs, wobei die langen Achsen der Kartons die Breite der schmalen Abmessungen des Käfigs und die kurzen Achsen der Kartons überspannen, die auf den Deckel und den Boden ausgerichtet sind.
- Packen Sie 10 g der hydratisierten Kokos-Arbeitsmischung in eine Petrischale.
- Verwenden Sie eine Waschflasche mit DI-Wasser, um etwa 15 ml DI-Wasser hinzuzufügen, oder bis sich an der Oberfläche des Kokos ein Meniskus bildet.
- Drehen Sie den Deckel einer 60 mm x 15 mm großen Petrischale um, um das Futter zu halten.
HINWEIS: Die Fütterungsrate kann während der gesamten Dauer des Versuchs variieren. Informationen zum experimentellen Randomisierungs- und Besatzverfahren für Käfiggrillen finden Sie in Schritt 1.4 für ergänzende Materialien .
- Insekten beenden
- Wenn die Grillen nicht mehr für die Zucht oder den experimentellen Gebrauch benötigt werden, führen Sie Schritt 2.2.17 aus.
- Wenn die Grillen tot sind, entfernen Sie den Käfig aus dem Gefrierschrank. Entfernen Sie den Deckel und geben Sie alle enthaltenen Materialien in einen autoklavierbaren Abfallbehälter. Den Abfall bis zur Autoklavierung wieder in den Gefrierschrank geben.
- Tauchen Sie den leeren Käfig in 10% ige Bleichlösung und lassen Sie ihn mindestens 5 Minuten ruhen.
- Spülen Sie den leeren Käfig dreimal mit kaltem Leitungswasser ab, um die Bleichmittelrückstände zu entfernen, wobei Sie besonders auf die Kanäle am Boden des Behälters achten.
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Representative Results
Daten, die eine erfolgreiche Cricket-Aufzucht vom Schlüpfen bis zum Alter von 65 Tagen belegen, wurden während eines Futterversuchs im September 2021 gesammelt. Grillen wurden aus Eiern gezüchtet, die den Schritten 1.1.1-2.6.1 dieser Protokolle folgten, und sechs Replikkäfige wurden mit 24 zufälligen 22 Tage alten (dritten) Grillen gemäß Schritt 2.7 oben bestückt. Grillen wurden dann unter Umgebungsbedingungen aufgezogen; Aufgrund einer Fehlfunktion der Lüftungsanlage lag die durchschnittliche Raumtemperatur jedoch bei 25 ± 1 °C bei 20% relativer Luftfeuchtigkeit und nicht bei den vorgeschlagenen 27 °C. Die Cricket-Masse wurde zweimal wöchentlich zwischen 22 und 65 Tagen nach dem Schlüpfen gemessen. Die Ergebnisse dieses Experiments sind im Folgenden beschrieben und werden als Mittelwerte plus oder minus Standardabweichung dargestellt.
Die in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigten Daten stellen die sechs Replikatkäfige dar, denen die in diesem Protokoll beschriebene Standardzufuhr verabreicht wird. Grillen wurden aus einer Population mit einer mittleren Masse von 21 ± 9 mg bestückt. Am Ende des Experiments betrug die mittlere Masse aller kombinierten jugendlichen und erwachsenen Grillen 0,724 g ± 0,190 g (Abbildung 1). Da G. bimaculatus sexuell dimorph ist, berichten wir auch über die erwachsene Masse nach Geschlecht. Das Geschlechterverhältnis bei der Ernte betrug 51% weiblich. Von 30 erwachsenen Männern, die am Ende des Experiments im Alter von 65 Tagen anwesend waren, betrug die mittlere Masse 0,721 g ± 0,123 g. Von den 58 erwachsenen Frauen, die im Alter von 65 Tagen anwesend waren, betrug die mittlere Masse 0,841 g ± 0,112 g (Abbildung 2). Die Überlebensrate zwischen Besatz und Ernte betrug 89% und wurde wöchentlich durch die Gesamtzahl aller einzelnen Grillen in allen Käfigen gemessen. Am 65. Tag hatten 68,2% aller Grillen das Erwachsenenstadium erreicht (Abbildung 2).
Abbildung 1: Mittlere Masse der einzelnen Grillen 22-65 Tage nach dem Schlüpfen. Balken stellen Quartile der mittleren Cricket-Masse durch Käfig dar, n = 6 Käfige. Alle Grillen wurden gezählt und 2x pro Woche gewogen, außer in 1 Woche des Experiments, in der sie nur einmal gewogen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mittlere erwachsene Cricket-Masse nach Geschlecht am Ende des Experiments. Männliche Grillen n = 30, weibliche Grillen n = 58. Balken stellen Quantile der mittleren Masse dar; "x" steht für die durchschnittliche Cricket-Masse nach Geschlecht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Materialien: (1) Kokosnusskokos- und Atemwegssicherheit, (2) Entfernen von Kokosnuss-Kokosmaterial, (3) Kalibrierung der Nebelabgabe, (4) Abgeschirmte Deckelkonstruktion, (5) Experimenteller Käfigbesatz, (6) Randomisieren von Grillen in Käfige, (7) Methoden zur Futteranalyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S1: Seitenansicht des Grillenkäfigs mit korrekter Anordnung von Kartonrefugien, Futter und Kokosnusskokos. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Draufsicht auf Petrischalen mit Kokosnusskokos und Grillenfutter am unteren Ende des Käfigs. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S3: Grillen, die vom Boden eines Käfigs durch langsames Kippen in einen neuen Käfig übertragen werden, wie in den Schritten 2.2.11-2.2.13 beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatzfigur S4: Käfige mit Grillen, die auf beleuchteten Aufzuchtgestellen positioniert sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle S1: (1) Nährwertanalysen von gewerblichen Futtermitteln, (2) Liste der Futtermittelzutaten des Herstellers. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Die Einfachheit dieses Ansatzes für die Cricket-Aufzucht kann einer Reihe von Forschungsbereichen zugute kommen und stellt eine generische Vorlage für eine erfolgreiche Cricket-Haltung dar, die leicht an eine Vielzahl von experimentellen Bedürfnissen angepasst werden kann. Im Vergleich zu mehreren anderen Studien an G. bimaculatus ist die individuelle Körpergröße der Erwachsenen kleiner und die Reifung ist langsamer14, was wir auf eine suboptimale Aufzuchttemperatur zurückführen, die uns durch die Umstände auferlegt wird. Die oben beschriebenen Methoden wurden im Laufe von 2 Jahren angewendet und verfeinert. Robuste Kulturen wurden ohne Hinweise auf Probleme aufrechterhalten, die manchmal in der kommerziellen Cricket-Landwirtschaft beobachtet wurden, einschließlich der weit verbreiteten Mortalität durch Krankheitserreger mit klassischen klinischen Symptomen (z. B. interne Verflüssigung aufgrund von Densoviren in Acheta domesticus) oder übermäßigem Kannibalismus15. Es ist wahrscheinlich, dass der Mangel an Cricket-Einführungen nach der Gründung der Kolonie die Wahrscheinlichkeit einer Krankheitslast stark verringert hat.
Die Vermeidung von Gedränge ist wichtig, um die Gesundheit des Cricket zu gewährleisten. Wild G. bimaculatus sind Einzelgänger, und Männchen verteidigen ihre Territorien durch aggressive Darstellungen und Kämpfe16. Eine erfolgreiche Pflege in Gefangenschaft erfordert, dass die Koloniedichte in einem angemessenen Bereich gehalten wird, um das antagonistische Verhalten und die allgemeinen Stressreaktionen zu reduzieren13. Dies wird erreicht, indem Grillen mit reichlich Zuflucht im Käfig versorgt werden und die Zuchtbestände von Grillen 20 Tage nach dem Schlüpfen auf 150 Individuen pro 29,3 l Käfig ausgedünnt werden, wenn sie während des dritten oder vierten Jungtierstadiums eine durchschnittliche Größe von 0,01 g erreichen. Diese Aufzuchtdichte ist identisch mit der, die in den G. bimaculatus Futteroptimierungsversuchen von Sorjonen et al.14 verwendet wurde. Eine Überlegung von besonderer Relevanz beim Transfer von Grillen von einem Behälter in einen anderen ist das hohe Fluchtrisiko. Sekundäre Eindämmung, kontrollierte Bewegungen, Vorbereitung zur Festnahme von Ausbrechern und Wachsamkeit sind entscheidende Werkzeuge, um die Flucht der Grille während dieses Prozesses zu verhindern. Solche Maßnahmen spiegeln die Bezeichnung Gryllus spp . durch das Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten wider. Grillen als potenzielle Pflanzenschädlinge, die Bundes- und Landesgenehmigungen für die Aufzucht in den Vereinigten Staaten erfordern17.
Umweltkontrollen und Futterqualität während der Ei- und frühen Nymphenstadien sind wichtig für die Gesundheit aller in Gefangenschaft lebenden Grillenkulturen, einschließlich G. bimaculatus. Um lebensfähige Eier zu legen, benötigt das Weibchen G. bimaculatus ein feuchtes Substrat, in dem18 ovipositiert werden können. Kokosnusskokos wird in der kommerziellen Cricket-Produktionsindustrie häufig als Medium für die Eiablage verwendet. Diese Methoden basieren auf Kokosnusskokos, der mit DI-Wasser angefeuchtet ist, als Substrat für die Eiablage und Hydratation von Grillen während ihres gesamten Lebenszyklus. In ähnlicher Weise hat sich die Verwendung von feuchten Papierhandtüchern in Jugendkäfigen zur Aufnahme überschüssiger Wassertröpfchen und zur Bereitstellung von Feuchtigkeitsgradienten in der Geburtsumgebung als sehr effektiv erwiesen, um die Anzahl der <1 Woche alten Grillen zu reduzieren, die entweder Dehydrierung oder Ertrinken erliegen, wie das Vorhandensein oder Fehlen verstorbener jugendlicher Grillen in Käfigböden zeigt. Es ist bekannt, dass die juvenile Ernährung eine übergroße Rolle bei der Vorhersage einer erfolgreichen Wachstumsleistung bei Grillen spielt. Die Sicherstellung, dass frisches Vollfutter eine Partikelgröße hat, die für Grillen mit <0,01 g geeignet ist, führt zu einer höheren Überlebensrate, da jüngere Grillen anfälliger für die Auswirkungen der Variabilität der Futterqualität sind19.
Das in dieser Studie verwendete kommerziell erhältliche Cricket-Futter wurde aufgrund seiner weit verbreiteten Verwendung in der nordamerikanischen Cricket-Landwirtschaft ausgewählt. Erstens geht aus der persönlichen Kommunikation mit drei kommerziellen Cricketbauern, zwei im oberen Mittleren Westen der USA und einem im Süden der USA, hervor, dass dieses Futter (Mazuri) in der heutigen Industrie für essbare Insekten weit verbreitet ist. Cricket-Landwirte finden es für wünschenswerte Wachstumsleistung, Fruchtbarkeit, Entwicklung und Gewichtszunahme-Metriken zugänglich. Zweitens ist es für Techniker, die mit der Verabreichung von Futter an eine große Anzahl von Grillen in Laborumgebungen beauftragt sind, bequem, während der gesamten Lebensdauer der Insekten ein pulverisiertes vorgemischtes Futter zu verwenden. Drittens ist bekannt, dass die Proteinnachfrage ein wichtiger Faktor bei der Entwicklung von Grillen ist, und obwohl viele andere spezifische Ernährungsbedürfnisse für G. bimaculatus nicht vollständig verstanden werden, enthält diese vorformulierte Mischung einen Rohproteinanteil, der in den berichteten optimalen Bereich von 22% -30% 14,20 fällt.
Der Platz in Inkubatoren ist oft begrenzt. Cricket-Farmen beginnen in der Regel mit ihren frühen Grillen in Brutkästen und verlagern reifere Bestände in Open-Air-Umgebungen, in denen anlagenweite Lüftungssysteme Temperatur und Luftfeuchtigkeit regulieren. Aus diesen Gründen sind diese Methoden so konzipiert, dass sie solche Anordnungen in einem kleineren Maßstab nachahmen. Nach 20 Tagen im Inkubator wird die Dichte reduziert und Grillen werden entweder in experimentelle Behandlungen oder unter Umgebungsbedingungen zur Verwendung als Zuchttier überführt. Wenn die Lüftungsanlagen ordnungsgemäß funktionieren, sollte die Temperatur der Aufzuchtanlage stabile 27 ± 1 °C bei einer relativen Luftfeuchtigkeit zwischen 20% und 25% betragen. Grillen haben ad libitum Zugang zu Wasser und Futter. Der Feed, auf den in diesen Methoden verwiesen wird, ist Mazuri Cricket Feed, der von Cricket-Landwirten in Nordamerika weit verbreitet ist. Eine vollständige Nährwertanalyse finden Sie in der ErgänzungstabelleS1.
Nach den Methoden von Donoughe und Extavour (2016) kann Watte anstelle von Kokosnusskokos als Eiablagemedium oder als Gehäusematerial auf dem Kokos verwendet werden, um zu verhindern, dass Frass- oder Futterpartikel die Oberfläche des Eiablagemediums18 kontaminieren. Sie empfehlen, während der Eiablageperiode eine dünne Schicht Watte über das Substrat zu legen und anschließend nach Abschluss der Eiablage zusammen mit dem angesammelten Frass und Detritus zu entfernen. Obwohl keine Daten zur Messung der Auswirkungen der Substratkontamination auf die Lebensfähigkeit von Eiern oder die Entwicklung von Grillen verfügbar sind, liefern die hier beschriebenen Protokolle zufriedenstellende Ergebnisse sowohl bei der Produktion von jungen Grillen als auch beim Wachstum. Dies kann auf die mutmaßlichen antimikrobiellen Eigenschaften von Kokosnusskokos zurückzuführen sein und ist ein Grund für zukünftige Forschungen im Bereich der Produktion essbarer Insekten21.
Aufgrund einer Fehlfunktion der Einheit, die die Temperatur der Cricket-Aufzuchtanlage reguliert, in der diese Methoden entwickelt wurden, wurde der Versuch, für den wir Daten melden, bei 25 ° C bei 20% relativer Luftfeuchtigkeit durchgeführt, was 2 ° kühler ist, als diese Protokolle vorschreiben. Darüber hinaus führen diese eng futterbasierten Forschungsziele zu einer begrenzten Verfügbarkeit von Daten zu bestimmten Metriken von Interesse wie Fruchtbarkeit, endokrine Reaktionen, Erregerbelastung und Genexpression. Sobald Zuchtgrillen durchweg reichlich lebensfähige Grilleneier produzierten und die jugendliche Mortalität als vernachlässigbar beobachtet wurde, konzentrierten sich die Bemühungen in erster Linie auf Experimente, die für Forschungsfragen direkt relevant sind. Daher bietet dieser Bericht nur anekdotische Berichte über die langfristigen Auswirkungen dieser Methoden auf die Wachstumsleistung über >10 Generationen hinweg. Schließlich führt die Verwendung von pflanzlichen Materialien wie Kokos und Pappe in Versuchskäfigen wahrscheinlich zu einer zufälligen Aufnahme durch Grillen. Dies ist innerhalb des Designs dieser Studien akzeptabel, kann jedoch die Gültigkeit von Studiendesigns beeinträchtigen, bei denen die Ergebnisse auf präzisen Messungen der gesamten aufgenommenen Biomasse beruhen.
Das hier beschriebene Protokoll soll sowohl grundlegend als auch gründlich sein, mit klaren und leicht zu befolgenden Schritten für die durchführbare Aufzucht von Grillen in einer Laborumgebung, die mit einem kommerziell erhältlichen Standardfutter gefüttert wird. Die Verwendung eines solchen standardisierten Verfahrens mit optimaler Reinigung, Besatzdichte und Umweltkontrollen ermöglicht die langfristige Erhaltung einheitlicher und gesunder Grillenkolonien. Darüber hinaus wird es zur wachsenden Erforschung von G. bimaculatus als farmfähiges essbares Insekt mit Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit beitragen. Es kann auch für Studien zur Insektenphysiologie, Wachstumsoptimierung und Genetik nützlich sein.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Die Finanzierung dieses Projekts wurde durch interne Zuschüsse der University of Wisconsin-Madison ermöglicht. Herzlichen Dank an Kevin Bachhuber von Bachhuber Consulting Inc. für den Zugang zu seinem unveröffentlichten Leitfaden für die kommerzielle Cricket-Aufzucht und an Michael Bartlett Smith für seine Unterstützung bei der Verfeinerung und Fehlerbehebung dieser Methoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 31-qt (29.3 L) Snap-lid tote bin with lid | HOMZ | 3430CLBL | Used to house breeding stock |
| 3-tier/12-tray Grow Light Stand | Fischer Scientific | NC1938548 | |
| 50-gal (189.27L) tote bin with lid | Sterilite | #14796603 | Used as secondary containment when handling crickets |
| 50 mL polypropylene graduated cylinder | Fischer Scientific | S95171 | |
| 7.5-qt (7.1 L) snap-lid tote bin with lid | HOMZ | 3410CLBL | Used to house exprimental stock |
| Accuris 500 g x 0.01 g Balance | Manufactured by Accuris, a subsidieary of Benchmark Scientific | W3300-500 | Purchased from Dot Scientific through University of Wisconsin system purchasing service "ShopUW+" |
| Ace Premier 1 Inch Flat Chip Brush | Ace Hardware | #1803261 | |
| Bel-Art SP Scienceware deionized water wash bottle | Fischer Scientific | 03-421-160 | |
| Bright aluminum window screen | Phifer | UNSPSC# 11162108 | Mesh size 18 x 16" |
| Clear Disposable Plastic Portion Cups 5.5 oz w/ lids | Wal-Mart | N/A | |
| Deionized water | |||
| Diablo 4-4/8" x 13 TPI Ultra Fine Finish Bi-Metal Jigsaw Blade | Home Depot | #313114935 | |
| Egg Filler Flats-Paper, 12 x 12" | Uline | S-5189 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 100 x 15mm | Fischer Scientific | FB0875714 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 60 x 15mm | Fischer Scientific | FB0875713A | |
| Georgia-Pacific Envision Brown Paper Towels | Home Depot | #205675843 | |
| Infinity Tough Guy high performance hot-melt glue sticks | Infinity Bond | Infinity IM-Tough-Guy-12 | |
| Mazuri Cricket Diet | Land O' Lakes International | SKU# 3002219-105 | |
| Stanley TimeIt Twin 2-outlet Grounded Mechanical 24 Hour Timer | Wal-Mart | N/A | |
| Vermont Organics Reclamation Soil 11 lb Coir Block | Home Depot | #300679904 |
References
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