Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Opprettholde laboratoriekulturer av Gryllus bimaculatus, en allsidig ortopedisk modell for insekt landbruk og virvelløse fysiologi

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63277
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 2Global Health Institute, University of Wisconsin-Madison

Summary

Dette dokumentet skisserer grunnleggende metoder for å standardisere viktige faktorer som tetthet, fôrtilgjengelighet, hydreringskilde og miljøkontroller for langsiktig oppdrett av laboratoriekulturer av spiselig cricket, Gryllus bimaculatus.

Abstract

Gryllus bimaculatus (De Geer) er en stor cricket fordelt over hele Afrika og Sør-Eurasia hvor den ofte er villhøstet som menneskelig mat. Utenfor sitt opprinnelige utvalg er culturing G. bimaculatus mulig på grunn av sin kostholdsplastisitet, raske reproduktive syklus, mangel på diapause-krav, toleranse for høy tetthet oppdrett og robusthet mot patogener. Dermed kan G. bimaculatus være en allsidig modell for studier av insektfysiologi, oppførsel, embryologi eller genetikk.

Kulturelle parametere, for eksempel strømpetetthet, refugia i bur, fotoperiod, temperatur, relativ fuktighet og kosthold, påvirker alle cricketvekst, oppførsel og genuttrykk og bør standardiseres. I den voksende litteraturen om oppdrettsinsekter til konsum, brukes disse crickets ofte til å evaluere kandidatfôrblandinger avledet fra avlinger, biprodukter for matbehandling og andre rimelige avfallsstrømmer.

For å støtte pågående eksperimenter som evaluerer G. bimaculatus vekstytelse og ernæringsmessig kvalitet som svar på variable fôrsubstrater, ble et omfattende sett med standardprotokoller for avl, vedlikehold, håndtering, måling og eutanasi i laboratoriet utviklet og presentert her. En industristandard cricketfôr har vist seg ernæringsmessig tilstrekkelig og funksjonelt egnet for langsiktig vedlikehold av cricketavlsbestander, samt for bruk som eksperimentell kontrollfôr. Oppdrett av disse crickets med en tetthet på 0,005 crickets /cm3 i skjerm-toppet 29.3 L polyetylen bur ved en gjennomsnittlig temperatur på 27 °C på en 12 lys (L)/12 mørk (D) photoperiod, med fuktet kokosnøtt coir som tjener både som hydreringskilde og oviposisjonsmedium har vellykket opprettholdt sunne crickets over en 2-års periode. Etter disse metodene ga crickets i et kontrollert eksperiment en gjennomsnittlig masse på 0,724 g 0,190 g ved høsting, med 89% overlevelse og 68,2% seksuell modning mellom strømpe (22 dager) og høsting (65 dager).

Introduction

Som preget av det ikoniske insektet, fruktfluen Drosophila melanogaster, gir bruken av insekter som laboratoriemodellorganismer klare fordeler for studier i genetikk, toksikologi og fysiologi1. Den lille størrelsen på insekter reduserer plassen som trengs for kulturer og mengden fôr og forbruksmaterialer som kreves. Mange insekter reproduserer raskt, noe som gjør dem unikt egnet til å skape spesialiserte genetiske linjer og studier som krever evaluering av flere etterfølgende generasjoner.

Mange studier fokuserer på holometabolous insekter som Drosophila, som viser fullstendig metamorfose og pupering. Imidlertid er andre modeller tilgjengelige, inkludert Gryllus bimaculatus (De Geer), den toflekkede feltcricketen. G. bimaculatus er et paurometaboløst insekt som gjennomgår mellom 7 og 11 nymphal instars før de når seksuell modenhet2. Denne cricket viser et bredt spekter av atferd relatert til seksuell seleksjon, inkludert stridulering, territoriale skjermer og kameratvakt3. Umodne crickets er ulik larver av holometabolous insektarter ved at de, ligner mange paurometabolous juveniler, er i stand til å regenerere tapte og skadede lemmer under ecdysis4. I tillegg ble det fullstendig sekvenserte genomet til G. bimaculatus publisert i 20215. Disse egenskapene gjør disse crickets tiltalende som et mål for grunnleggende forskning.

Toflekkede feltcricketer er mye oppdrettet for menneskelig mat og dyrefoder. Omfanget av disse operasjonene er ofte mye større enn for laboratorieforskning 6,7. Til tross for forskjellen i skala overlapper forskernes utfordringer sterkt med de som oppstår av kommersielle cricketbønder. Disse hensynene konvergerer i sammenheng med laboratoriebasert forskning med sikte på å forbedre spiselig insektproduksjon. Etter hvert som den spiselige insektindustrien fortsetter å utvikle seg og vokse, er optimalisering av fôrinnganger og utallige andre aspekter av produksjonen et primært mål8. Laboratoriestudier som viser målte forbedringer i oppdrettseffektivitet, overlevelse eller generasjonstid i disse crickets har potensial til å bidra til å øke lønnsomheten i cricketoppdrettsoperasjoner på lang sikt.

Standardiserte oppdrettsprotokoller muliggjør tettere sammenligning mellom studier som undersøker oppdrettsoptimalisering. Til dags dato er det publisert få dyptgående protokoller for oppdrett av G. bimaculatus i laboratoriet. En ideell protokoll vil gjenspeile forhold som oppstår i virkelige cricketoppdrettsoperasjoner, samtidig som de strengt kontrollerte forholdene som er nødvendige for å nøyaktig måle endringer i vekstytelsen som følge av eksperimentelle behandlinger og fremheve risikoreduserende strategier. Metodene beskrevet i denne artikkelen ble utviklet basert på publiserte protokoller, teknikker og apparater som brukes til å bake en rekke cricketarter på et bredt spekter av laboratorie- og kommersielle produksjonsskalaer 2,9,10,11,12. Disse metodene er også informert av flere ikke-fagfellevurderte kilder, inkludert upubliserte tekniske bulletiner og personlig kommunikasjon med kommersielle cricketbønder i Nord-Amerika. Denne protokollen ble utviklet med den hensikt å lette etableringen av laboratoriekulturer av G. bimaculatus spesielt for bruk i forsøk relatert til insekt landbruk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klargjøring av oviposisjonssubstratet

MERK: Kokos coir er et ideelt oviposisjonssubstrat for G. bimaculatus. For detaljerte metoder for hvordan du skiller coir fra komprimert coir murstein og et notat om åndedrettssikkerhet, se Tilleggsmaterialer trinn 1.1.

  1. Vask hendene med såpe og vann.
  2. Tjære en ren beholder på en balanse og vei en masse tørr kokosnøtt coir omtrent på størrelse med en menneskelig knyttneve.
  3. Plasser coir i en forseglet, ren beholder, som kan romme utvidelse opptil 6 ganger det opprinnelige volumet.
  4. Med rene hender bryter du forsiktig opp klumper av coir fra stykket som er fjernet fra den større blokken.
  5. Bruk en 50 ml gradert sylinder, mål riktig volum av deionisert (DI) vann for å oppnå et 5: 1-forhold med masse på fem deler vann til en del tørr coir.
  6. Tilsett det målte DI-vannet langsomt, jevnt fuktighetsgivende alle coir-partikler. Macerate klumper manuelt for å sikre jevn hydrering.
  7. Tjære beholderen der coir tidligere ble veid.
  8. Vei ut 75 g fuktet coir.
  9. Overfør 75 g av den fuktede coir til en 100 mm x 15 mm Petri-tallerken ved hjelp av en ren plastskje for å sikre at coir er jevnt spredt rundt bunnen av parabolen og at det ikke er klumper.
  10. Merk siden av Petri-parabolen med lab tape med en etikett som betegner natal koloni og dato for eggsamlingshendelsen.
  11. Mål ytterligere 45 ml DI-vann i en gradert sylinder.
  12. Tilsett vann jevnt over overflaten av den pakkede coiren i Petri-parabolen for å sikre jevn hydrering. Forsikre deg om at coir er mettet til det punktet at vann bassenger ca 1/4 veien opp sidene av beholderen.
  13. Når Petri-retten er pakket, forsegler du den gjenværende fuktede coir i et lufttett kar for lagring ved -20 °C.
    MERK: Etter metodene foreskrevet av denne artikkelen, vil G. bimaculatus individer nå seksuell modenhet etter et gjennomsnitt på 58 dager etter oviposisjon.
  14. Samle egg
    1. Plasser det hydrerte oviposisjonssubstratet i bur som inneholder de ønskede foreldrebestandene av crickets så langt fra fôret som mulig på grunn av potensialet for crickets å mekanisk overføre granulater av fôr til oviposisjonssubstratet.
    2. Dokumenter dato og klokkeslett.
      MERK: Standardisert arbeidstetthet for reproduktive cricketkolonier oppdrettet etter disse metodene er n = 150 voksne individer. Ved den tettheten vil et 24 h oviposisjonsvindu gi mellom 800 og 1500 egg avhengig av kolonialderen, tidligere oviposisjonsinnsats og foreldrebursexforhold.
    3. Plasser en liten autoklaverbar søppelbeholder på arbeidsflaten for å ta høyde for inneslutningsrisikoen ved håndtering og rengjøring av eggrike oviposisjonssubstrater.
    4. Plasser et rent, tomt 29,3 L plastbur på benken ved siden av søppelbeholderen for å fungere som mottakerbur for det eggrike oviposisjonsunderlaget.
    5. Plasser 29,3 L buret som inneholder foreldrekricketlagrene og oviposisjonssubstratet på motsatt side av søppelbeholderen fra det tomme buret.
    6. Etter 24 timer, fjern oviposisjonssubstratet fra foreldrekricketburet og finn det over autoklaverbart avfallsbeholder.
    7. Inspiser toppen av oviposisjonssubstratet for partikler av frass eller fôr at crickets kan ha sparket på overflaten av coir.
      MERK: Ethvert stoff, som ikke er eggmasse eller coir, kan føre til at mugg dannes på substratet under inkubasjon.
    8. Fjern coir forurensninger inn i avfallsbeholderen med en ren scoopula eller plastskje.
    9. Plasser plastskjeen i avfallsbeholderen.
    10. Plasser det rensede oviposisjonssubstratet i det rene 29,3 L buret.
    11. Plasser buret i en inkubator satt til 27 °C ved 60 % relativ fuktighet på en 12 t D/12 h L fotoperiod.
    12. Returner merden som inneholder avlsmassen til den opprinnelige plasseringen og fjern alle gjenstander fra arbeidsflaten.
    13. Plasser avfallsbeholderen i en fryser i anlegget dedikert til lagring av gjenstander som potensielt er forurenset med cricketegg.
    14. Desinfiser arbeidsflaten med 10% blekemiddelløsning og la den sitte i 60 s.
    15. Tørk av arbeidsflaten med et rent papirhåndkle. Åpne fryseren og kast papirhåndkleet i avfallsbeholderen.
  15. Misting og overvåking av eggsubstrater daglig
    MERK: For metoder som brukes til å kalibrere volumet av tåke levert av en sprøyteflaske, se Tilleggsmaterialer trinn 1.2.
    1. Plasser en sprøyteflaske over oviposisjonssubstratet slik at vannet som uttrykkes, fordeles jevnt over overflaten av substratet.
    2. Utfør antall pumpeaktiveringer beregnet i tilleggsmaterialene trinn 1.2 for hvert oviposisjonssubstrat daglig i 11 påfølgende dager.
    3. Kontroller hvert oviposisjonssubstrat daglig, overvåking for filamentøs muggvekst på overflaten av coir.
    4. Hvis soppvekst observeres, bruk en ren skje eller scoopula for å fjerne flekker av overflateform.
    5. Kast verktøyet og den fjernede coiren i den autoklaverbare avfallsbeholderen som er lagret i innretningsfryseren.
      MERK: Det er uklart om formen påvirker cricketutviklingen negativt.
    6. På dag 11 post oviposisjon, begynn å se nøye på substratet for juvenile crickets.
      MERK: Ved 27 °C krever eggene i G. bimaculatus 11-13 dager å klekkes.
  16. Sette opp natal bur
    1. Velg to ubrukte 30,8 cm x 30,8 cm kommersielle eggekartongflater. Med en verktøykniv eller sterke saks, kutt disse i seks separate 10,1 cm brede strimler av samme størrelse. Børst av de kuttede kantene med hendene for å fjerne dangling partikler av papp.
    2. Plasser de seks individuelle 10,1 cm x 30,8 cm (4 x 12 tommer) delene av kartongen vertikalt inn i bunnen av buret med den lengre aksen på kartongen som spenner over den smalere horisontale aksen til et 29,3 L bur. Plasser et syvende stykke kartong flatt over toppen av de seks oppreiste brikkene.
    3. Velg tre stykker grovt brunt papirhåndkle ca 25 cm x 25 cm. Brett hver i to. Plasser to slik at de dekker toppen av den proksimale siden av kartongstrukturen. Plasser en over kartongstabelen på den distale siden.
    4. På dag 11 post oviposisjon, flytt oviposisjonssubstratet inn i det proksimale høyre hjørne av buret.
  17. Omsorg for tidlige instars
    MERK: På dag 14 etter oviposisjon vil de fleste levedyktige egg ha klekket ut og tidlig stadium cricket nymfer vil kreve fôr og vann. Unge crickets er ikke i stand til å bryte overflatespenningen av vanndråper og kan drukne hvis vann er samlet i deres miljø. Imidlertid er de også følsomme for uttørking. Å gi en konsistent relativ fuktighet på rundt 60% i dette utviklingsstadiet er viktig for å sikre overlevelse.
    1. Når en luke er observert, tåke papirhåndklær plassert over toppen av kartongene i trinn 1.4.3 til de er fuktet, men ikke aktivt kaste vann.
    2. Tørk forsiktig av begge sider av et 100 mm Petri-parabolens lokk med 70% etanol og la det tørke. Bruk den som beholder der cricketfôr skal leveres.
      MERK: Første-instar crickets krever mindre fôrpartikler enn crickets i etterfølgende stadier av utviklingen. Denne finere fôret skal administreres til crickets de første 20 dagene etter fremveksten.
    3. Øs 50 g av fôret inn i en 60-watts enkeltserverende blender og fres ved 10.000 o/min i 1 min.
    4. Mål 1 g av fôret og rist det på Petri-parabolens lokk i buret. Bruk den rene enden av en skje eller scoopula, spre fôret så jevnt som mulig over bunnen av parabolen.
    5. Bytt ut fôret hver annen dag. Bruk enden av skjeen til å børste crickets fra fôrfatet før du fjerner det. Kast den gamle fôret i den autoklaverbare avfallsbeholderen.
    6. Overvåk for muggvekst på fôr. Hvis fôret begynner å virke hvitt eller grønt, kast Petri-parabolen og mate umiddelbart.
    7. På 14 dager etter oviposisjon, bruk en 2,54 cm (1 tomme) pensel for å fjerne crickets som klamrer seg til natal coir-substratet ved å pusse alle crickets fra coir-overflaten og sidene av Petri-parabolen inn i buret.
    8. Plasser det fjernede oviposisjonssubstratet i den autoklaverbare avfallsbeholderen og oppbevar det i fryseren til autoklavering.
    9. Bytt ut natalsubstratet med en frisk coir-tallerken for hydrering tilberedt i henhold til trinn 1.1.5-1.1.9.
    10. Bruk en DI vannvaskflaske for å tilsette vann til overflaten av coir glitrer, men ikke samler seg.
      MERK: Crickettetthet påvirker vekstytelsen sterkt i G. bimaculatus13. Opprettholde avlsmassen med overdreven tetthet risikerer å introdusere uønskede crowding-induserte epigenetiske effekter i eksperimenter der deres avkom brukes9. Crickets må "tynnes" fra de høye tetthetene som kommer ut av oviposisjonssubstratene og fordeles i tettheter som holder seg til standarden på 0,005 crickets / cm3 av rommet.

2. Omsorg for instars tre til voksen

  1. Sette opp bur
    MERK: Hvis du vil ha mer informasjon om teknikken for å konstruere det skjermede lokket, kan du se Tilleggsmaterialer trinn 1.3.1.
    1. Gjenta trinn 1.4.1.
    2. Installer fem kuttede eggekartongstykker i den distale enden av buret slik at eggformkonkavitene vender utover. Forsikre deg om at de korte endene handler om sidene av buret, langsiden sitter flatt mot bunnen, og det er ca. 3 cm plass mellom hvert stykke kartong.
    3. Plasser det siste kuttet kartongstykket på toppen av de oppreiste kartongstykkene, for eksempel taket på et hus som vist i Supplerende figur S1.
    4. Følg trinn 1.1.8-1.1.13 for å klargjøre hydreringssubstratene.
    5. Plasser hydreringssubstratet i det proksimale høyre hjørnet av cricketburet som vist i supplerende figur S2.
    6. Bruk en vaskeflaske til å tilsette 6-10 ml DI-vann til coiroverflaten ser våt og reflekterende ut, men coir er ikke helt nedsenket.
      MERK: Overflaten skal virke lett dimpled, med overflatespenning som får vannet til å følge konturene av coir.
    7. Snu lokket på en 100 mm Petri-tallerken og legg den på den proksimale venstre siden av buret. Tilsett 2-3 g standard cricketmating som vist i supplerende figur S2.
  2. Endre kolonitetthet
    MERK: Utfør dette trinnet på 20 dager etter klekking eller når crickets når en gjennomsnittlig masse på 0,01 g.
    1. På arbeidsflaten plasserer du en stor beholder som har plass til plantegningen på tre 29,3 L merder som står side om side.
      MERK: Dette er sekundær inneslutning og vil kontrollere crickets som unnslipper under overføringen fra en koloni til en annen.
    2. Fjern den opprinnelige kolonien fra oppdrettsstativet og legg den på arbeidsflaten.
    3. Til høyre side av den opprinnelige kolonien, plasser et tomt bur av samme størrelse.
    4. Til høyre side av det tomme buret, plasser et bur som er satt opp i henhold til trinn 2.1.1-2.1.7.
    5. Kontroller at crickets ikke klamrer seg til undersiden av det skjermede lokket på buret som inneholder crickets. Hvis det observeres, trykk på toppen av buret for å løsne dem.
    6. Åpne det skjermede lokket på buret som inneholder crickets.
    7. I en mild, jevn bevegelse, overfør "taket" -kartongen og alle crickets som holder seg til konturene inn i midtburet.
    8. Når kartongen er inne i midtburet, rør forsiktig papp mot sidene for å løsne alle crickets.
    9. Visuelt inspisere at alle crickets har blitt ristet fri før du returnerer kartongstykket til den proksimale siden av opprinnelsesburet for å tillate de resterende crickets å holde seg til kartongen.
    10. Gjenta trinn 2.2.8-2.2.9 med alle kartongstykkene i buret, og arbeid sekvensielt fra forsiden til baksiden av det opprinnelige buret til alle crickets er overført til midtburet.
    11. Vipp forsiktig det midterste buret som inneholder crickets slik at alle crickets inneholdt er rettet mot det nederste hjørnet.
    12. Løft buret som inneholder crickets over mottakerburet.
    13. Vipp donorburet langsomt slik at crickets begynner å få kjøp på sidene og kan bevege seg på en kontrollert måte ut av massen i det nederste hjørnet som vist i Supplerende figur S3.
    14. Hvis crickets avanserer for raskt, juster vinkelen der midtburet holdes, slik at crickets faller tilbake.
    15. Mens buret er vippet, bruk en 2,54 cm (1 tomme) pensel for å lede crickets inn i mottakerburet, og tell hver til det totale antallet er lik 150 personer. Bruk børsten til å avskrekke de som beveger seg for raskt for en nøyaktig telling.
    16. Merk det nyfylte cricketburet med dato, foreldrebeholdning og antall crickets inneholdt.
    17. Humant euthanize overflødige crickets fortsatt i bunnen av midten og originale beholdere ved å plassere hele beholderen i en fryser ved -20 °C i minst 30 minutter.
    18. Inspiser opprinnelsesburet for å sikre at alle crickets er overført.
    19. Plasser cricketburene på plantevoksende stativer 25 cm under lyshetter som inneholder fullspektret fluorescerende lys satt til en utendørs timer i boligklasse programmert til å opprettholde en 12 timers L / D fotoperiod. Se supplerende figur S4.
    20. Overfør alle frass, retter av brukt hydreringssubstrat og fôr, papirhåndkle, eksuviae og døde crickets som gjenstår i opprinnelsesburet til den autoklaverbare avfallsbeholderen.
    21. Med mindre avfallet skal autoklaveres umiddelbart, oppbevar det i en fryser i anlegget ved -20 °C.
    22. Inspiser gulvet, arbeiderklær, sekundært inneslutningsbur og arbeidsflate for rømte crickets.
    23. Desinfiser arbeidsflaten og sekundært inneslutningsbur med 10% blekemiddelløsning, og kast papirhåndklærne i den autoklaverbare avfallsbeholderen.
  3. Fôring og vanning
    1. Åpne den lufttette matebeholderen og fyll en tom 100 ml prøvekopp med cricketmating. Strekk deg inn i hver koloni og deponer en fjerdedel av fôret som holdes i koppen i Petri-parabolen som holder fôret.
    2. Til vann crickets, lag en Petri parabolen av coir ved å følge trinn 1.1.9-1.1.13.
    3. Øk feedfrekvensen i samsvar med forbruksfrekvensen for å sikre tilgjengeligheten av libitum-feeder for annonser .
      MERK: Cricket feed etterspørsel endringer gjennom utviklingen.
  4. Overføre crickets til rene bur
    1. Overfør crickets til rene bur hver annen uke. Repliker arrangementet av burene fra trinn 2.2.1-2.2.4
      MERK: Betydelige mengder frass vil ha akkumulert i konkavitene til eggekartongene.
    2. Overfør crickets til rene bur, ved å følge trinn 2.2.5-2.2.23.
    3. Manøvrer forsiktig kartongene slik at flertallet av frass faller inn i opprinnelsesburet mens crickets kan klamre seg til kartongen under repetisjon av trinn 2.2.7-2.2.10.
    4. Bruk en børste eller plastskje for å oppmuntre eventuelle crickets fanget i frass til å bevege seg fra midtburet til et rent bur.
    5. Inspiser opprinnelsesburet for å sikre at alle crickets er overført.
    6. Overfør alle frass, retter av brukt hydreringssubstrat og fôr, papirhåndkle, eksuviae og døde crickets som gjenstår i opprinnelsesburet til den autoklaverbare avfallsbeholderen.
    7. Med mindre avfallet skal autoklaveres umiddelbart, oppbevar det i en fryser i anlegget ved -20 °C.
    8. Inspiser gulvet, arbeiderklær, sekundært inneslutningsbur og arbeidsflate for rømte crickets.
    9. Desinfiser arbeidsflaten og sekundært inneslutningsbur med 10% blekemiddelløsning, og kast papirhåndklær i autoklaverbar avfallsbeholder.
  5. Sette opp eksperimentelle bur
    MERK: Eksperimentelle bur er plastbeholdere som huser færre crickets. Deres oppsett er identisk med de 29,3 L merdene som inneholder avlsmasser, men er avhengige av 7,1 L beholdere fylt med mindre retter av vann, fôr og inneholder et redusert eggekartongoverflateområde.
    1. Plasser seks 10,1 cm x 15,4 cm (4 x 6 tommer) kartongstykker i den distale enden av hvert eksperimentelle bur med de lange aksene på kartongene som spenner over bredden på burets smale dimensjon og de korte aksene på kartongene som er orientert mot lokket og gulvet.
    2. Pakk 10 g av den hydrerte coir-arbeidsblandingen i en Petri-tallerken.
    3. Bruk en vaskeflaske som inneholder DI-vann for å tilsette ca. 15 ml DI-vann, eller til det dannes en menisk på overflaten av coir.
    4. Snu lokket på en Petri-tallerken på 60 mm x 15 mm for å holde fôret.
      MERK: Fôringshastigheten kan variere gjennom hele prøveperioden. For den eksperimentelle cage cricket randomiserings- og strømpeprosedyren, se Tilleggsmaterialer trinn 1.4.
  6. Avslutte insekter
    1. Når crickets ikke lenger er nødvendig for avl eller eksperimentell bruk, følg trinn 2.2.17.
    2. Når crickets er døde, fjern buret fra fryseren. Fjern lokket og overfør alle de inkluderte materialene til en autoklaverbar avfallsbeholder. Overfør avfallet tilbake til fryseren til autoklavering.
    3. Senk det tomme buret i 10% blekemiddelløsning og la det sitte i minst 5 min.
    4. Trippelskyll det tomme buret med kaldt vann fra springen for å fjerne blekemiddelrester, med spesiell oppmerksomhet på kanaler på bunnen av beholderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Data som demonstrerer vellykket cricketoppdrett fra klekking til 65 dager gammel ble samlet inn under en fôrprøve i september 2021. Crickets ble dyrket fra egg etter trinn 1.1.1-2.6.1 av disse protokollene, og seks replikeringsbur ble fylt med 24 tilfeldige 22-dagers (tredje instar) crickets etter trinn 2.7 ovenfor. Crickets ble deretter oppdrettet i omgivelsesromsforhold; På grunn av en luftbehandlingsenhet som ikke fungerer, var imidlertid den gjennomsnittlige romtemperaturen 25 ± 1 °C ved 20 % relativ luftfuktighet i stedet for den foreslåtte 27 °C. Cricketmasse ble målt to ganger i uken mellom 22 og 65 dager etter klekking. Resultatene fra dette eksperimentet er skissert nedenfor og presenteres som pluss eller minus standardavvik.

Data vist i figur 1 og figur 2 representerer de seks replikeringsmerdene som administreres standardfeeden som er beskrevet i denne protokollen. Crickets ble lagerført fra en befolkning med gjennomsnittlig masse på 21 ± 9 mg. På slutten av eksperimentet var gjennomsnittsmassen til alle kombinerte juvenile og voksne crickets 0,724 g ± 0,190 g (figur 1). Siden G. bimaculatus er seksuelt dimorfisk, rapporterer vi også voksenmasse etter kjønn. Kjønnsforholdet ved høsting var 51% kvinne. Av 30 voksne menn til stede ved 65 dagers alder da eksperimentet ble avsluttet, var gjennomsnittsmassen 0,721 g ± 0,123 g. Av de 58 voksne hunnene som var tilstede ved 65 dagers alder, var gjennomsnittsmassen 0,841 g ± 0,112 g (figur 2). Overlevelse mellom strømpe og høsting var 89% og ble målt ukentlig av totalt antall av alle individuelle crickets i alle bur. På dag 65 hadde 68,2% av alle crickets nådd den voksne instar (figur 2).

Figure 1
Figur 1: Gjennomsnittlig masse av individuelle crickets 22-65 dager etter klekking. Barer representerer kvartiler av gjennomsnittlig cricketmasse med bur, n = 6 bur. Alle crickets ble talt og veid 2x per uke, unntatt i 1 uke av eksperimentet, der de bare ble veid en gang. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Gjennomsnittlig voksen cricketmasse etter kjønn på slutten av eksperimentet. Mannlige crickets n = 30, kvinnelige crickets n = 58. Barer representerer kvantiler av gjennomsnittlig masse; 'x' representerer gjennomsnittlig cricketmasse etter kjønn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsmaterialer: (1) Kokos coir og åndedrettssikkerhet, (2) Fjerning av kokosnøtt coir-materiale, (3) Kalibrering av tåkelevering, (4) Skjermet lokkkonstruksjon, (5) Eksperimentell burstrømpe, (6) Randomisere crickets til bur, (7) Metoder som brukes til fôranalyse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S1: Sidevisning av cricketbur som inneholder riktig arrangement av pappkartongrefugi, fôr og kokosnøttkoir. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: Topp utsikt over Petri retter som inneholder kokosnøtt coir og cricket feed plassert på bunnen av buret. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S3: Crickets overføres fra bunnen av et bur til et nytt bur ved å sakte vippe som beskrevet i trinn 2.2.11-2.2.13. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S4: Bur som inneholder crickets plassert på opplyste oppdrettsstativer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell S1: (1) Ernæringsanalyser av kommersiell fôr, (2) Produsentens liste over fôringredienser. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Enkelheten i denne tilnærmingen til cricketoppdrett kan være til nytte for en rekke forskningsområder og representerer en generisk mal for vellykket crickethold, lett tilpasningsdyktig til en rekke eksperimentelle behov. Sammenlignet med flere andre studier av G. bimaculatus, er den enkelte kropps voksen størrelse mindre og modningen er langsommere14, som vi tilskriver sub-optimal oppdrettstemperatur pålagt oss av omstendigheter. Metodene beskrevet ovenfor har blitt brukt og raffinert i løpet av 2 år. Robuste kulturer har blitt opprettholdt uten tegn på problemer som noen ganger observeres i kommersiell cricketoppdrett, inkludert utbredt dødelighet fra patogener med klassiske kliniske tegn (f.eks. intern liquification på grunn av densovirus i Acheta domesticus) eller overdreven kannibalisme15. Det er sannsynlig at mangelen på cricket introduksjoner etter koloni etablering sterkt redusert sannsynligheten for sykdom byrde.

Forebygging av trengsel er viktig for å sikre cricket helse. Wild G. bimaculatus er ensomme, og menn forsvarer sine territorier gjennom aggressive skjermer og kjemper16. Vellykket fangenskap krever å holde kolonitettheten innenfor et passende område for å redusere antagonistisk oppførsel og generelle stressresponser13. Dette oppnås ved å gi crickets rikelig innen bur tilflukt og ved å tynne avlsbestander av crickets til 150 personer per 29,3 L bur på 20 dager etter klekking når de når en gjennomsnittlig størrelse på 0,01 g, under den tredje eller fjerde ungdomsstjernen. Denne oppdrettstettheten er identisk med den som brukes i G. bimaculatus fôroptimaliseringsforsøk av Sorjonen et al.14. En vurdering av spesiell relevans under overføring av crickets fra en beholder til en annen er den høye graden av rømningsrisiko. Sekundær inneslutning, kontrollerte bevegelser, forberedelse til å pågripe rømninger, og årvåkenhet er avgjørende verktøy for å forhindre cricketflukt under denne prosessen. Slike tiltak gjenspeiler USAs landbruksdepartements betegnelse på Gryllus spp. crickets som potensielle avlinger, krever føderale og statlige tillatelser for oppdrett i USA17.

Miljøkontroller og fôrkvalitet under egg og tidlige nymphal stadier er viktige for helsen til alle fangede cricketkulturer, inkludert G. bimaculatus. For å legge levedyktige egg krever kvinnelig G. bimaculatus et fuktig substrat der du skal oviposit18. Kokos coir er mye brukt i den kommersielle cricketproduksjonsindustrien som et medium for oviposisjon. Disse metodene er avhengige av kokosnøtt coir fuktet med DI vann som et substrat for både oviposisjon og hydrering av crickets gjennom hele livssyklusen. På samme måte har bruken av fuktige papirhåndklær i ungdomsbur for å absorbere overflødige vanndråper og gi fuktighetsgradienter i natalmiljøet vist seg å være svært effektiv for å redusere antall <1 uker gamle crickets som bukker under for enten dehydrering eller drukning, som angitt av tilstedeværelsen eller fraværet av avdøde juvenile crickets i burbunner. Juvenil ernæring er kjent for å spille en outsized rolle i å forutsi vellykket vekstytelse i crickets. Å sikre at fersk full ernæringsfôr er av en partikkelstørrelse som passer for <0,01 g crickets, vil føre til høyere overlevelse, da yngre crickets vil være mer utsatt for virkningene av variasjon i fôrkvalitet19.

Den kommersielt tilgjengelige cricketfôret som ble brukt i denne studien ble valgt på grunn av sin utbredte bruk i den nordamerikanske cricketoppdrettsindustrien. For det første, fra personlig kommunikasjon med tre kommersielle cricketbønder, to i Øvre Midtvesten USA, og en i Det sørlige USA er det klart at denne fôret (Mazuri) er mye brukt i spiselige insekter industrien til dags dato. Cricket bønder finner det egnet for ønskelig vekst ytelse, fecundity, utvikling, og vektøkning beregninger. For det andre, for teknikere som har til oppgave å administrere fôr til et stort antall crickets i laboratoriemiljøer, er det praktisk å bruke en pulverisert ferdigblandet fôr gjennom insektenes levetid. For det tredje er proteinetterspørsel kjent for å være en viktig faktor i cricketutvikling, og selv om mange andre spesifikke ernæringsmessige behov for G. bimaculatus ikke er fullt ut forstått, inneholder denne preformulerte blandingen en råproteinprosent, som faller innenfor det rapporterte optimale området 22%-30%14,20.

Plass i inkubatorer er ofte begrenset. Cricket gårder starter vanligvis sine tidlige instar crickets i inkubatorer og overfører mer modent lager til friluftsmiljøer, hvor anleggsomfattende luftbehandlingssystemer regulerer temperatur og fuktighet. Av disse grunnene er disse metodene designet for å etterligne slike ordninger i mindre skala. Etter 20 dager inne i inkubatoren reduseres tettheten, og crickets overføres enten til eksperimentelle behandlinger eller til omgivelsesforhold for bruk som avlsmasse. Når luftbehandlingssystemer fungerer som de skal, bør temperaturen på oppdrettsanlegget være stabil 27 ± 1 °C med relativ fuktighet mellom 20 % og 25 %. Crickets er tillatt ad libitum tilgang til vann og mat. Fôret som refereres gjennom disse metodene er Mazuri Cricket Feed som brukes mye av cricketbønder i Nord-Amerika. For fullstendig ernæringsanalyse, se Supplerende tabellS1.

I henhold til metodene Donoughe og Extavour (2016) kan bomullsull brukes i stedet for kokosnøtt coir som et oviposisjonsmedium eller som et foringsrørmateriale på toppen av coir for å forhindre partikler av frass eller mate fra å forurense overflaten av oviposisjonsmediet18. De anbefaler at et tynt lag av bomullsull plasseres over substratet i oviposisjonsperioden og deretter fjernes når oviposisjonen er fullført, sammen med akkumulert frass og detritus. Selv om data som måler virkningen av substratforurensning på egg levedyktighet eller cricketutvikling ikke er tilgjengelige, gir protokollene som er skissert her tilfredsstillende resultater i både produksjon av juvenile crickets og vekst. Dette kan tilskrives de putative antimikrobielle egenskapene til kokosnøttkoir og er grunnlag for fremtidig forskning på arenaen for spiselig insektproduksjon21.

På grunn av en funksjonsfeil i enheten som regulerer temperaturen på cricketoppdrettsanlegget der disse metodene ble utviklet, ble studien som vi rapporterer data for utført ved 25 °C ved 20 % relativ fuktighet, som er 2 ° kjøligere enn disse protokollene tilsier. Videre resulterer disse smalt fôrbaserte forskningsmålene i begrenset tilgjengelighet av data om visse beregninger av interesse som fecundity, endokrine responser, patogenbelastning og genuttrykk. Når avl crickets konsekvent produserte rikelig levedyktig cricket egg og ungdomsdødelighet ble observert å være ubetydelig, ble innsatsen først og fremst fokusert på eksperimentering direkte relevant for forskningsspørsmål. Dermed tilbyr denne rapporten bare anekdotiske redegjørelser for de langsiktige vekstprestasjonskonsekvensene av disse metodene på tvers av >10 generasjoner. Til slutt fører bruk av planteavledede materialer som coir og papp i eksperimentelle bur sannsynligvis til tilfeldig inntak av crickets. Dette er akseptabelt innenfor utformingen av disse studiene, men kan kompromittere gyldigheten av studiedesign der funnene er avhengige av presise målinger av total inntatt biomasse.

Protokollen som er beskrevet her er ment å være både grunnleggende og grundig, med klare og enkle å følge trinn for å oppdrette crickets i et laboratorium som er matet med en kommersielt tilgjengelig standardfôr. Ved å bruke en slik standardisert prosedyre med optimal rengjøring, strømpetetthet og miljøkontroller muliggjør vedlikehold av ensartede og sunne cricketkolonier på lang sikt; Videre vil det bidra til den voksende forskningen på G. bimaculatus som et gårdsmessig spiselig insekt med implikasjoner for menneskers helse. Det kan også være nyttig for studier på insektfysiologi, vekstoptimalisering og genetikk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.

Acknowledgments

Støtten til dette prosjektet ble muliggjort gjennom interne tilskudd fra University of Wisconsin-Madison. Takk til Kevin Bachhuber fra Bachhuber Consulting Inc. for tilgang til hans upubliserte guide for kommersiell cricketoppdrett og til Michael Bartlett Smith for hans hjelp til å raffinere og feilsøke disse metodene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
31-qt (29.3 L) Snap-lid tote bin with lid HOMZ 3430CLBL Used to house breeding stock
3-tier/12-tray Grow Light Stand Fischer Scientific NC1938548
50-gal (189.27L) tote bin with lid Sterilite #14796603 Used as secondary containment when handling crickets
50 mL polypropylene graduated cylinder Fischer Scientific S95171
7.5-qt (7.1 L) snap-lid tote bin with lid HOMZ 3410CLBL Used to house exprimental stock
Accuris 500 g x 0.01 g Balance Manufactured by Accuris, a subsidieary of Benchmark Scientific W3300-500 Purchased from Dot Scientific through University of Wisconsin system purchasing service "ShopUW+"
Ace Premier 1 Inch Flat Chip Brush Ace Hardware  #1803261
Bel-Art SP Scienceware deionized water wash bottle Fischer Scientific 03-421-160 
Bright aluminum window screen  Phifer UNSPSC# 11162108 Mesh size 18 x 16"
Clear Disposable Plastic Portion Cups 5.5 oz w/ lids Wal-Mart N/A
Deionized water
Diablo 4-4/8" x 13 TPI Ultra Fine Finish Bi-Metal Jigsaw Blade Home Depot #313114935
Egg Filler Flats-Paper, 12 x 12" Uline S-5189
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 100 x 15mm Fischer Scientific FB0875714
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 60 x 15mm Fischer Scientific FB0875713A
Georgia-Pacific Envision Brown Paper Towels Home Depot #205675843
Infinity Tough Guy high performance hot-melt glue sticks Infinity Bond Infinity IM-Tough-Guy-12
Mazuri Cricket Diet Land O' Lakes International SKU#  3002219-105
Stanley TimeIt Twin 2-outlet Grounded Mechanical 24 Hour Timer Wal-Mart N/A
Vermont Organics Reclamation Soil 11 lb Coir Block Home Depot #300679904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  2. Merkel, G. The effects of temperature and food quality on the larval development of Gryllus bimaculatus (Orthoptera, Gryllidae). Oecologia. 30 (2), 129-140 (1977).
  3. Bateman, P. W. Mate preference for novel partners in the cricket Gryllus bimaculatus. Ecological Entomology. 23 (4), 473-475 (1998).
  4. Mito, T., Noji, S. The two-spotted cricket Gryllus bimaculatus: An emerging model for developmental and regeneration studies. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  5. Ylla, G., et al. Cricket genomes: the genomes of future food. BioRxiv. , (2020).
  6. Hanboonsong, Y., Jamjanya, T., Durst, P. B. Six-legged livestock: edible insect farming, collecting, and marketing in Thailand. , Available from: http://www.fao.org/docrep/017/i3246e00.htm (2013).
  7. Halloran, A., Roos, N., Hanboonsong, Y. Cricket farming as a livelihood strategy in Thailand. Geographical Journal. 183 (1), 112-124 (2017).
  8. Wade, M., Hoelle, J. A review of edible insect industrialization: scales of production and implications for sustainability. Environmental Research Letters. 15, 123013 (2020).
  9. EL-Damanhouri, H. I. H. Studies on the influence of different diets and rearing conditions on the development and growth of the two-spotted cricket Gryllus bimaculatus de Greer. , Available from: https://epub.uni-bayreuth.de/310/1/Diss.pdf (2011).
  10. Ngonga, C. A., Gor, C. O., Okuto, E. A., Ayieko, M. A. Growth performance of Acheta domesticus and Gryllus bimaculatus production reared under improvised cage system for increased returns and food security. Journal of Insects as Food and Feed. 7, 301-310 (2021).
  11. Behrens, W., Hoffmann, K. -H., Kempa, S., Gäßler, S., Merkel-Wallner, G. Effects of diurnal thermoperiods and quickly oscillating temperatures on the development and reproduction of crickets, Gryllus bimaculatus. Oecologia. 59 (2-3), 279-287 (1983).
  12. Collavo, A., et al. Housecricket smallscale farming. Ecological implications of minilivestock. Potential of insects, rodents, frogs and snails. Paoletti, M. G. , Science Publishers. Enfield, N.H., USA. Chapter 27 (2005).
  13. Simmons, L. W. Competition between larvae of the field cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera: Gryllidae) and its effects on some life-history components of fitness. Journal of Animal Ecology. 56, 1015-1027 (1987).
  14. Sorjonen, J. M., et al. The plant-based by-product diets for the mass-rearing of Acheta domesticus and Gryllus bimaculatus. PLOS ONE. 14 (6), 0218830 (2019).
  15. Maciel-Vergara, G., Jensen, A. B., Lecocq, A., Eilenberg, J. Diseases in edible insect rearing systems. Journal of Insects as Food and Feed. 7 (5), 1-18 (2021).
  16. Alexander, R. D. Aggressiveness, territoriality, and sexual behavior in field crickets (Orthoptera: Gryllidae). Behaviour. , 130-223 (1961).
  17. Pet food, fish bait, and animal feed. USDA APHIS. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/planhealth/import-information/permits/plant-pests/sa_animalfeed/ct_petfood_fishbait_animalfeed (2022).
  18. Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. 411 (1), 140-156 (2016).
  19. Dobermann, D., Michaelson, L., Field, L. M. The effect of an initial high-quality feeding regime on the survival of Gryllus bimaculatus (black cricket) on bio-waste. Journal of Insects as Food and Feed. 5 (2), 1-8 (2018).
  20. Lundy, M. E., Parrella, M. P. Crickets are not a free lunch: Protein capture from scalable organic side-streams via high-density populations of Acheta domesticus. PLOS ONE. 10, 0118785 (2015).
  21. Mazaya, G., Karseno, K., Yanto, T. Antimicrobial and phytochemical activity of coconut shell extracts. Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology. 8 (5), 1090-1097 (2020).

Tags

Biologi Utgave 184 Entomophagy Spiselig insekt Cricket Gryllus Modell Paurometabolous Metoder Oppdrett Standard Fôr Tetthet Orthoptera
Opprettholde laboratoriekulturer av <em>Gryllus bimaculatus</em>, en allsidig ortopedisk modell for insekt landbruk og virvelløse fysiologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ventura, M. K., Stull, V. J.,… More

Ventura, M. K., Stull, V. J., Paskewitz, S. M. Maintaining Laboratory Cultures of Gryllus bimaculatus, a Versatile Orthopteran Model for Insect Agriculture and Invertebrate Physiology. J. Vis. Exp. (184), e63277, doi:10.3791/63277 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter