Summary
Det nuværende arbejde beskriver trinene til fremstilling af klar til brug qPCR til T. cruzi DNA-detektion, der kan forudindlæses på reaktionsbeholderen og opbevares i køleskabet i flere måneder.
Abstract
Real-time PCR (qPCR) er en bemærkelsesværdig følsom og præcis teknik, der giver mulighed for at forstærke små mængder nukleinsyremål fra en lang række prøver. Det er blevet anvendt i vid udstrækning inden for mange forskningsområder og opnået industriel anvendelse inden for områder som human diagnostik og egenskabsudvælgelse i afgrøder af genetisk modificerede organismer (GMO) afgrøder. qPCR er dog ikke en fejlsikker teknik. Blanding af alle reagenser i en enkelt masterblanding, der efterfølgende fordeles på 96 brønde i en almindelig qPCR-plade, kan føre til operatørfejl såsom forkert blanding af reagenser eller unøjagtig dispensering i brøndene. Her præsenteres en teknik kaldet gelificering, hvorved det meste af det vand, der er til stede i masterblandingen, erstattes af reagenser, der danner en sol-gel-blanding, når det underkastes et vakuum. Som et resultat bevares qPCR-reagenser effektivt i et par uger ved stuetemperatur eller et par måneder ved 2-8 oC. Detaljer om fremstilling af hver opløsning vises her sammen med det forventede aspekt af en gelificeret reaktion designet til at detektere T. cruzi-satellit-DNA (satDNA). En lignende procedure kan anvendes til påvisning af andre organismer. Start af en gelificeret qPCR-kørsel er så simpelt som at fjerne pladen fra køleskabet, tilføje prøverne til deres respektive brønde og starte kørslen og dermed reducere opsætningstiden for en fuldpladereaktion på den tid, det tager at indlæse prøverne. Derudover kan gelificerede PCR-reaktioner produceres og kontrolleres for kvalitet i batches, hvilket sparer tid og undgår almindelige operatørfejl, mens du kører rutinemæssige PCR-reaktioner.
Introduction
Chagas sygdom blev opdaget i begyndelsen af det 20. århundrede i landdistrikterne i Brasilien, hvor fattigdom var udbredt 1,2. Selv i dag er sygdommen fortsat forbundet med sociale og økonomiske sundhedsdeterminanter i Amerika. Chagas sygdom er bifasisk, der omfatter en akut og en kronisk fase. Det er forårsaget af infektion med Trypanosoma cruzi-parasitten, der overføres af insektvektorer, blodtransfusioner via medfødt vej eller oral indtagelse af forurenet mad 3,4.
Diagnosticering af Chagas sygdom kan foretages ved observation af kliniske symptomer (især Romaña-tegnet), blodudtværingsmikroskopi, serologi og molekylære tests såsom realtids-PCR (qPCR) eller isotermisk forstærkning 4,5,6,7,8,9. Kliniske symptomer og blodudtværingsmikroskopi anvendes i mistænkte tilfælde af akutte infektioner, mens søgningen efter antistoffer bruges som screeningsværktøj hos asymptomatiske patienter. På grund af dets følsomhed og specificitet er qPCR blevet foreslået at blive brugt som et overvågningsværktøj til kroniske patienter, til akutte patienter, der gennemgår behandling, der måler parasitbelastningen i blodet, og som en surrogatmarkør for terapeutisk svigt 6,8,10,11,12 . Selvom det er mere følsomt og specifikt end de aktuelt tilgængelige tests, forhindres qPCR effektivt i at blive kendt som diagnostiske værktøjer i underprivilegerede regioner over hele verden på grund af kravet om frysende temperaturer til transport og opbevaring13,14,15.
For at omgå denne hindring er bevaringsteknikker som lyofilisering og gelificering blevet udforsket16,17. Mens lyofilisering giver bevarelse i årevis, kræver det specielt fremstillede reagenser uden tilstedeværelse af glycerol, som almindeligvis anvendes til enzymstabilisering / konservering18. Mens gelificering har vist sig at give bevarelse i flere måneder, tillader det brugen af almindelige reagenser19. Gelificeringsopløsningen består af fire komponenter, hver med specifikke roller i processen: sukkerarterne trehalose og melezitose beskytter biomolekylerne under udtørringsprocessen ved at reducere frie vandmolekyler i opløsningen, glykogen producerer en bredere beskyttende matrix, og aminosyren lysin anvendes som en friradikal scavenger til at hæmme de oxiderende reaktioner mellem biomolekylets carboxyl, amino- og fosfatgrupper. Disse komponenter definerer en sol-gel-blanding, der forhindrer tab af den tertiære eller kvaternære struktur under udtørringsprocessen og dermed hjælper med at opretholde biomolekylernes aktivitet ved rehydrering19. Når reaktionerne er stabiliseret inde i reaktionsrørene, kan de opbevares i et par måneder ved 2-8 °C eller et par uger ved 21-23 °C i stedet for de almindelige -20 °C. Denne tilgang er allerede blevet indarbejdet i tests designet til at hjælpe med at diagnosticere sygdomme som Chagas sygdom, malaria, leishmaniasis, tuberkulose og cyclosporiasis13,14,15,20.
Det nuværende arbejde beskriver alle trin til at forberede de nødvendige løsninger til gelificeringsproceduren, faldgruberne i processen og det forventede endelige aspekt af en klar til brug gelificeret qPCR inde i otte-rørstrimler. Den samme protokol kan tilpasses til enkeltrør eller 96-brøndplader. Endelig vil påvisning af T. cruzi DNA blive vist som en kontrolkørsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af stamopløsninger og gelificeringsblanding
BEMÆRK: Fire stamopløsninger fremstilles (400 mg/ml melezitose, 400 mg/ml trehalose, 0,75 mg/ml lysin og 200 mg/ml glykogen) og blandes i overensstemmelse med den andel, der er vist i tabel 1 , til fremstilling af gelifikationsblandingen. Selvom protokollen beskriver 10 ml produktion af lageropløsninger, kan den tilpasses til lavere eller højere mængder.
- Melezitose opløsning
- Vej 4 g melezitose i et 15 ml plastrør, tilsæt 6 ml nukleasefrit vand og hvirvel ved instrumentets maksimale hastighed, indtil pulveret er opløseligt.
BEMÆRK: Mere vand kan tilsættes for at lette opløselighed, idet man sørger for ikke at overskride det endelige volumen (se nedenfor). - Der fyldes op til 10 ml med nukleasefrit vand. Mærk og opbevar ved 2-8 °C i op til 6 måneder.
- Vej 4 g melezitose i et 15 ml plastrør, tilsæt 6 ml nukleasefrit vand og hvirvel ved instrumentets maksimale hastighed, indtil pulveret er opløseligt.
- Trehalose opløsning
- Vej 4 g trehalose i et 15 ml plastrør, tilsæt 6 ml nukleasefrit vand og hvirvel ved instrumentets maksimale hastighed, indtil pulveret er opløseligt.
BEMÆRK: Mere vand kan tilsættes for at lette opløselighed, idet man sørger for ikke at overskride det endelige volumen (se nedenfor). - Der fyldes op til 10 ml med nukleasefrit vand, og opløsningen filtreres gennem et filter på 0,2 μm. Mærk og opbevar ved 2-8 °C i op til 6 måneder.
- Vej 4 g trehalose i et 15 ml plastrør, tilsæt 6 ml nukleasefrit vand og hvirvel ved instrumentets maksimale hastighed, indtil pulveret er opløseligt.
- Glykogen opløsning
- Vej 2 g glykogen i et 15 ml plastrør, tilsæt 6 ml nukleasefrit vand og hvirvel med instrumentets maksimale hastighed, indtil pulveret er opløseligt.
BEMÆRK: Mere vand kan tilsættes for at lette opløselighed, idet man sørger for ikke at overskride det endelige volumen (se nedenfor). - Opløsningen holdes i ro ved 2-8 °C i 8-12 timer, fordi opløselsen af glykogen producerer masser af bobler (figur 1). Fyld volumen op til 10 ml med nukleasefrit vand. Mærk og opbevar ved 2-8 °C i op til 6 måneder.
- Vej 2 g glykogen i et 15 ml plastrør, tilsæt 6 ml nukleasefrit vand og hvirvel med instrumentets maksimale hastighed, indtil pulveret er opløseligt.
- Lysin opløsning
- Vej 7,5 mg lysin i et 15 ml plastrør, tilsæt 6 ml nukleasefrit vand. Vortex ved instrumentets maksimale hastighed, indtil pulveret er opløseligt.
BEMÆRK: Mere vand kan tilsættes for at lette opløselighed, idet man sørger for ikke at overskride det endelige volumen (se nedenfor). - Der fyldes op til 10 ml med nukleasefrit vand, og opløsningen filtreres gennem et filter på 0,2 μm. Overfør opløsningen til en ravkolbe eller beskyt den mod lys. Mærk og opbevar ved 2-8 °C grader i op til 6 måneder.
- Vej 7,5 mg lysin i et 15 ml plastrør, tilsæt 6 ml nukleasefrit vand. Vortex ved instrumentets maksimale hastighed, indtil pulveret er opløseligt.
- Gelificeringsblanding (GM)
- I et 50 ml plastrør blandes mængderne af stamopløsninger i henhold til tabel 1.
- Bland reagenserne med ti ende-til-ende inversioner af røret.
BEMÆRK: Der er ikke behov for et filtreringstrin, hvis dette trin udføres i en laminær flowsikkerhedshætte. Hvis dette trin ikke udføres i et rent miljø, filtreres opløsningen gennem et 0,2 μm filter, inden det overføres til en ravkolbe. - Overfør opløsningen til en ravkolbe eller beskyt den mod lys. Mærk og opbevar ved 2-8 °C i op til 3 måneder.
BEMÆRK: Som et kvalitetskontroltrin til fremstilling af gelificeringsblandingen skal du sikre dig, at de målte pH-, ledningsevne- og densitetsværdier ligger inden for følgende intervaller: pH 5,55-6,66; ledningsevne 0,630-0,757 mS/cm; og massefylde 1,08-1,11 g/cm3. Alle målinger skal foretages ved 25 °C.
2. Fremstilling af qPCR master mix til gelering
BEMÆRK: I dette trin fremstilles qPCR-masterblandingen til gelering. Derfor tilsættes vand ikke til blandingen, men i stedet tilsættes gelificeringsblandingen (tabel 2).
- Optø reagenserne i en kølebeholder. Reagenserne blandes i et 1,5 ml rør i henhold til tabel 2. Et eksempel på en reaktion med et endeligt volumen på 25 μL indeholdende 5 μL DNA-prøve er vist her.
BEMÆRK: DNA-prøven tilsættes ikke til blandingen i dette trin; den bruges her udelukkende til at beregne de endelige mængder af hvert reagens af qPCR-masterblandingen. DNA-prøver skal tilføjes lige før kørslen startes (se trin 4 nedenfor).
3. Gelificering af reagenserne på reaktionsbeholderne
- Volumenerne i tabel 2 multipliceres på passende vis til fremstilling af en strimmel med otte rør eller en plade med 96 brønde.
- Pipet 18,5 μL af gelificeringsmasterblandingen vist i tabel 2 på hver reaktionsbrønd.
BEMÆRK: Dette volumen repræsenterer volumenerne af oligonukleotidblanding, PCR-buffer og gelifikationsblanding, der anvendes til en reaktion (ifølge tabel 2) og vil variere afhængigt af koncentrationen af reagenserne og det volumen, der er nødvendigt for en reaktion. Det endelige volumen i gelificeringsmasterblandingen er forskellig fra volumenet i en almindelig masterblanding, fordi der ikke tilsættes vand. - Anbring rørene/pladen i den varmeledende understøtning (f.eks. aluminium) inde i vakuumovnen.
BEMÆRK: Den varmeledende understøtning er valgfri. Operatøren skal sikre, at bunden af rørene er i kontakt med vakuumovnhylden for at muliggøre hurtig termisk ligevægt. - Placer en bentonit lerpose for hver to 96-brøndsplader.
BEMÆRK: Bentonit lerposer bruges til at absorbere det fjernede vand fra gelifikationsmasterblandingen ved det differenstryk, der udøves af vakuumet. Bentonit lerposer viste sig at være unødvendige for mindre end to 96-brøndsplader. - Rørene/pladen indeholdende gelifikationsmasterblandingen udsættes for tre vakuumcyklusser (30 ± 5 mBar) på hver 30 minutter, skiftevis med vakuumfrigivelse, indtil det atmosfæriske tryk er opnået (900-930 mBar), under kontrolleret temperatur (30 °C ± 1 °C) (figur 2).
BEMÆRK: Instrumentet bruger software til at styre parametrene, og et eksempel på cyklussen er vist i figur 2. Brugeren skal oprette profilen for kørslen med angivelse af de valgte parametre. - Når cyklussen er afsluttet, kontrolleres rørene/pladerne for korrekt gelificering af reagenserne ved at sikre, at volumenet reduceres synligt (figur 3), og at væskerne ikke bevæger sig, når rørene/pladerne tappes med fingrene.
BEMÆRK: Hvis gelificering ikke fandt sted, ville opløsningen sprøjte på rørvæggene, når rør tappes (figur 3). - Rørene/pladerne forsegles og opbevares ved 2-8 °C i 8-12 timer før brug.
4. Brug af en gelificeret qPCR
- Fjern rørstrimlen eller pladen fra køleskabet, og åbn den i en arbejdsstation til prøvemanipulation. Der tilsættes 15 μL nukleasefrit vand til hver reaktionsbeholder.
BEMÆRK: Mængden af gelerede reagenser anses for at være ca. 5 μL. Så sammen med DNA-prøvevolumenet (se nedenfor) er det endelige reaktionsvolumen 25 μL. - Tilsæt 5 μL DNA-prøve.
BEMÆRK: Enhver DNA-skabelon i qPCR-kvalitet kan bruges. I det foreliggende arbejde blev DNA ekstraheret fra 108T. cruzi epimastigotes (stamme Dm28c) og blev serielt fortyndet i forholdet 1:10 ved hjælp af TE-buffer. - Forsegl rørene / pladerne og fortsæt til det valgte udstyr. Kør eksperimentet, og fortsæt til regelmæssig dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre af reagenserne, der danner gelifikationsblandingen, opløses let ved kraftig hvirveldannelse. Glykogen kræver dog omhyggelig hvirveldannelse for at sikre, at pulveret er fuldstændigt opløseligt. Desværre producerer kraftig hvirveldannelse masser af bobler, hvilket gør det vanskeligt at bestemme det faktiske volumen af opløsningen (figur 1A-B). Derfor er det vigtigt at lade glykogenopløsningen hvile i køleskabet, indtil det meste af opløsningen fanget i boblerne er flyttet ned til hovedopløsningslegemet. I betragtning af produktionsprotokollerne og laboratorierutinen opbevares gelificerede plader i køleskabet natten over (eller omkring 8-12 timer), hvilket resulterer i bundfældning af de fleste bobler, hvilket gør det lettere at bestemme det korrekte volumen og justere til det ønskede endelige volumen (figur 1C). Bemærk forskellen i mængden af bobler mellem glykogenrørene i figur 1B-C, henholdsvis lige efter opløselsen og efter afregning natten over.
Når gelificeringsblandingen er tilsat til qPCR-masterblandingen i erstatning for vand (tabel 2), er rørstrimlerne eller pladerne klar til at gå til vakuumovnen. Hylderne i vakuumovnen indeholder et Peltier-varmeelement, der sikrer, at alle rør, der er i kontakt med den, forbliver ved samme temperatur. I den nuværende protokol holdes temperaturen inde i kammeret konstant ved 30 °C, mens trykket varierer mellem 910-930 mBar (atmosfærisk tryk) og 30 mBar (nærvakuum). Figur 2 viser disse to variabler afbildet over tid, der viser den konstante temperatur (grøn linje, øverste panel) og variationen af tryk (rød linje, nederste panel). Når cyklusserne er færdige, falder masterblandingen inde i brønden i volumen og bliver gelificeret i bunden, dvs. uden at bevæge sig eller sprøjte, når rørene tappes med fingrene (figur 3). Rørene kan nu lukkes og opbevares ved 2-8 °C. Reaktionerne vil ikke gelificere, hvis gelificeringsblandingen (tabel 1) er forkert fremstillet; det foreslåede kvalitetskontroltrin skal se fejlen, før gelificeringsblandingen blandes med qPCR-reagenser.
For at blive brugt skal de gelificerede reagenser inde i rørene / pladerne resuspenderes i nukleasefrit vand, og DNA-prøven fortyndes normalt i vand eller TE-buffer. Resuspensionen af reagenserne i sol-gel-blandingen opnås under det første trin i denatureringen af qPCR-termisk protokol (normalt 5-10 minutter ved 95 °C), så der kræves ikke noget ekstra trin. Figur 4A viser repræsentative spor af qPCR-detektion af T. cruzi DNA ved hjælp af offentliggjorte oligonukleotidsekvenser15. Suboptimale resultater omfatter tab af følsomhed, som kan testes med en fortyndingskurve af en opløsning med en kendt koncentration af genomiske mål og tab af specificitet, som kan testes med et panel af beslægtede trypanosomatidorganismer. Figur 4B viser det tab af følsomhed, der kan opstå, når gelificeringsprocessen ikke udføres korrekt, eller når reaktionen mister sin stabilitet efter at have været opbevaret ved 2-8 °C i mere end 6 måneder.
Figur 1: Opløselighed af glykogen producerer masser af bobler. Fordi glykogen producerer for mange bobler under opløselighed, skal glykogenopløsningen holdes i ro, inden den justeres til det endelige volumen. (A) Bobler dannet under hvirveldannelse. (B) Alt pulveret blev opløseligt, men det er ikke muligt at bestemme det endelige volumen på grund af de overskydende bobler. (C) Efter 12 timer i køleskabet (rør i midten) reduceres mængden af bobler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vakuumcykling (nederste panel) og temperaturkontrol (øverste panel). Repræsentative spor af temperatur (øvre panel) og tryk (nederste panel) variation vises. Sorte linjer repræsenterer de programmerede variationer, mens de grønne og røde linjer repræsenterer faktiske aflæsninger af instrumentet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Aspekter af gelificeret masterblanding inde i en otte-rørs strimmel . (A) qPCR-masterblandinger før vakuumeksponeringen. (B) Flydende sprøjt på rørvæggene på grund af ufuldstændig gelificering (kun en vakuumcyklus). (C) Gelificerede qPCR-reagenser med en tydelig synlig reduktion i volumen. Væsken sprøjter ikke på væggene, når rørene tappes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative spor af gelificerede masterblandinger, der detekterer DNA fra T. cruzi epimastigotes. DNA ekstraheret fra T. cruzi epimastigotes (108 celler) blev serielt fortyndet i forholdet 1:10, og DNA-koncentrationerne på mellem 104 og 100 celler blev udsat for detektion ved hjælp af en gelificeret qPCR. (A) Det forventede resultat af korrekt gelificeret qPCR (B) Detektion af de samme prøver ved hjælp af en plade, hvor gelificeringen ikke blev udført korrekt, hvilket resulterede i tab af følsomhed. Bemærk, at de lavere koncentrationer påvises sjældnere i panel B. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Opløsning | Koncentration af lagre | Lydstyrke |
| Melezitose | 400 mg/ml | 3 ml |
| Treahlose | 400 mg/ml | 6 ml |
| Lysin | 0,75 mg/ml | 3 ml |
| Glykogen | 200 mg/ml | 3 ml |
| Nukleasefrit vand | NA | q.s.p. 20 ml |
Tabel 1: Stamkoncentrationer og -volumener af opløsninger, der anvendes til fremstilling af 20 ml gelifikationsblanding. Volumenet af hver stamopløsning skal justeres proportionalt for at producere lavere eller højere endelige volumener af gelifikationsblandingen.
| Reaktionsblandingsreagens | Almindelig mastermix | Gelificering mastermix |
| Oligomix (25X) | 1 μL | 1 μL |
| PCR-buffer (2X) | 12,5 μL | 12,5 μL |
| Gelificering blanding* | - | 5 μL |
| Nukleasefrit vand | 6,5 μL | - |
| DNA-prøve* | 5 μL | 5 μL |
| *højst 20 % af det endelige reaktionsvolumen | ||
Tabel 2: Mængder af reagenser til fremstilling af qPCR-masterblandinger til regelmæssige eller gelificerede reaktioner. Forskellen mellem de to masterblandinger er, at der tilsættes vand til den almindelige masterblanding, mens gelificeringsblandingen tilsættes (dvs. i stedet for vand) til gelifikationsmasterblandingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De seneste år har understreget behovet for at finde mere følsomme og specifikke teknologier, der kan hjælpe med at diagnosticere tropiske og oversete sygdomme. Selvom det er vigtigt for epidemiologisk kontrol, har parasitologiske (optisk mikroskopi) og serologiske tests begrænsninger, især med hensyn til følsomhed og anvendelighed på plejestedet. DNA-amplifikationsteknikker såsom PCR, isotermisk amplifikation og respektive variationer har længe været brugt i laboratorieindstillinger, men teknologiske forhindringer forhindrer det i at blive brugt i feltindstillinger. En af de største hindringer er behovet for temperaturer på -20 °C til transport og opbevaring af reagenserne. For at afhjælpe denne situation er teknikker som lyofilisering og gelificering blevet brugt til at gemme PCR-reaktioner ud af fryseren16,18,19.
Det nuværende arbejde viser alle de trin, der er nødvendige for at gelificere en qPCR-reaktion for at detektere T. cruzi DNA inde i reaktionsbeholderen, det være sig rør, rørstrimler, mikrofluidiske chips eller plader. Foreløbige undersøgelser ved hjælp af en RT-LAMP-reaktion tyder på, at gelificeringsteknikken også kan anvendes til at bevare og beskytte andre nukleinsyreamplifikations- og modifikationsenzymer, som beskrevet af Rosado et al. 19. Selv om det er relativt ligetil, er de to trin, der forårsager de fleste operatørfejl i qPCR-rutiner, a) fremstilling af glykogen- og melezitoseopløsninger og b) beregning af volumenet af reaktionsblandingen, der skal tilsættes til hvert reaktionsrør før vakuumtrinnet. Først skal glykogenopløsningen afkøles natten over inden den endelige volumenjustering, og melezitoseopløsningen skal være kraftigt hvirvlet (muligvis med mild opvarmning ved 50 ° C) for fuldstændig opløselse. For det andet skal forskeren, der planlægger eksperimentet, være opmærksom på, at reagensernes volumener beregnet før vakuum kan være ujævne, da der ikke tilsættes vand for at runde op til reaktionsvolumenet. Det faktiske reaktionsvolumen opnås, når den gelificerede reaktion opløses igen ved tilsætning af prøve og vand, inden PCR køres.
Den største begrænsning af metoden er reaktionernes stabilitet, som er omkring 6-8 måneder ved 2-8 °C14,15; Det er betydeligt kortere end lyofiliserede reaktioner, som kan forblive stabile i år18. Afhængigt af specificiteten af oligonukleotidsekvenserne kan der forekomme uspecifik binding og forstærkning, som bør undersøges nøje af forskerne. For eksempel rapporterer Costa og samarbejdspartnere, at udglødningstemperaturen for den gelificerede qPCR til påvisning af C. cayetanensis skulle justeres i +1 ° C for at undgå uspecifikke forstærkninger15,21. På samme måde bør forskere undgå at bruge enzymer, der kan reguleres af eller bruge gelificeringskomponenterne som substrater.
Gelifikationsteknikken er særlig nyttig på grund af dens brugervenlighed i laboratorierutinen samt en introduktion til en produktionslinje16,19,22, der muliggør jævn kvalitetskontrol; Sidstnævnte muliggør igen robuste og sammenlignelige data på tværs af flere operatører og eliminerer effektivt almindelige operatørfejl på afgørende trin med en bonus ved at eliminere krav om frysetemperatur under transport og opbevaring. Foreløbige undersøgelser tyder på, at eliminering af kølekæden ville resultere i en samlet reduktion af omkostningerne med op til 20% for en qPCR-test14. Eliminering af kølekæden gør det også muligt at implementere qPCR som en bekræftende test for forsømte sygdomme som Chagas sygdom i underudviklede regioner og dermed favorisere deres epidemiologiske kontrol23.
Endelig strømliner gelificeringsprotokollen brugen af qPCR-test, da det kun kræver, at brugeren tilføjer vand og det ekstraherede T. cruzi-DNA , undgår fejl under reagenshåndtering og reducerer opsætningstiden samt muligheden for reagensens forurening. Sådanne egenskaber giver effektivitet til et rutinemæssigt diagnostisk laboratorium, fremskynder leveringen af resultater til patienter og øger diagnosens pålidelighed. Endelig, fordi det dispenserer behovet for en -20 ° C kølekæde, er den velegnet til diagnostisk brug i miljøer med lav ressource.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne udtrykke deres taknemmelighed over for Aline Burda Farias for den tekniske bistand med vakuumovnen samt administrationen ved Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brasilien) for at give adgang til det nævnte udstyr. Dette arbejde blev delvist finansieret af tilskud CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas' disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al.
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A.
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G.
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
