Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido adiposo de rata para la diferenciación en células productoras de insulina

Las células madre mesenquimales (MSC), también conocidas como células del estroma mesenquimal, se encuentran entre los tipos de células más utilizados para la medicina regenerativa ^1,2. Se clasifican como células madre adultas y se caracterizan por un potencial de diferenciación multilinaje y capacidad de autorrenovación³. Las MSC se pueden aislar y obtener de diversas fuentes, incluyendo tejido adiposo, médula ósea, sangre periférica, tejido y sangre del cordón umbilical, folículos pilosos y dientes ^4,5.

El aislamiento de las células madre del tejido adiposo se considera atractivo y prometedor debido a su fácil acceso, rápida expansión in vitro y alto rendimiento⁶. Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (Ad-MSC) se pueden aislar de diferentes especies como humanos, bovinos, ratones, ratas y, más recientemente, cabras⁷. Se ha demostrado que las MSC Ad son ahora candidatos potenciales para la ingeniería de tejidos y la terapia génica / celular que incluso se pueden utilizar para desarrollar una alternativa autóloga para la reparación a largo plazo de lesiones o defectos de tejidos blandos ^7,8.

La Sociedad Internacional de Terapia Celular y Génica (ISCT) ha definido tres criterios mínimos que deben ser exhibidos por las MSC para la caracterización completa⁹. Primero, deben ser adherentes al plástico. En segundo lugar, las MSC deben expresar marcadores de superficie de células madre mesenquimales como CD73, CD90 y CD105 y carecer de expresión de los marcadores hematopoyéticos CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79α o CD19 y HLA-DR. Finalmente, las MSC deben exhibir la capacidad de diferenciarse en los tres linajes mesenquimales: adipocitos, osteocitos y condrocitos. Curiosamente, las MSC también pueden diferenciarse en otros linajes como células neuronales, cardiomiocitos, hepatocitos y células epiteliales^10,11.

De hecho, las MSC poseen propiedades únicas que les permiten ser aplicadas como agentes terapéuticos potenciales en la terapia regenerativa para diferentes enfermedades. Las MSC pueden secretar factores solubles para inducir un ambiente inmunomodulador que proporciona beneficios terapéuticos¹². Además, las MSC pueden migrar hacia sitios de lesión y microambientes tumorales para administrar terapia dirigida; sin embargo, los mecanismos no están completamente dilucidados¹³. Además, las MSC tienen la capacidad de secretar exosomas, vesículas extracelulares en la nanoescala que transportan una carga de ARN no codificantes, proteínas y factores solubles, que últimamente surgieron como un nuevo mecanismo del potencial terapéutico de las MSC en diversas enfermedades¹⁴.

Más importante aún, las MSC han generado una marcada atención por su potencial para diferenciarse en células productoras de insulina (IPC), ya sea por modificación genética^15,16 o mediante la utilización de varios factores inductores extrínsecos dentro de los medios de cultivo in vitro¹⁷. El período de inducción de IPC varía mucho, ya que depende del protocolo de inducción utilizado y de los factores extrínsecos utilizados. El proceso de diferenciación puede durar de días a meses, y requiere una combinación de factores exógenos inductores que deben agregarse y / o retirarse en diferentes etapas. Muchos de estos factores que se han utilizado para la diferenciación pancreática endocrina son compuestos biológicamente activos que han demostrado promover la proliferación o diferenciación/neogénesis de las células β secretoras de insulina y/o aumentar el contenido de insulina de los IPC 18,19,20,21. Cabe destacar aquí que también se ha informado que las MSC tienen efectos terapéuticos en la diabetes y sus complicaciones a través de varios mecanismos, incluido su secretoma, así como una amplia gama de acciones inmunomoduladoras 22,23,24.

En este protocolo, presentamos un protocolo paso a paso detallado para el aislamiento y caracterización de Ad-MSC a partir de grasa epidídima de rata, seguido de un protocolo simple y relativamente corto para la generación de IPC a partir de Ad-MSC.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Farmacia, la Universidad Británica de Egipto (BUE), El Cairo, Egipto. El protocolo de aislamiento Ad-MSC fue adoptado por López y Spencer, con modificaciones¹⁵.

1. Aislamiento de Ad-MSC de almohadillas de grasa epidídima de rata

1. Use ratas macho Sprague-Dawley que pesen 250-300 g que no tengan más de 1 mes de edad (dos por aislamiento). Anestesiar a los animales, luego sacrificarlos por dislocación cervical. Rocíe al animal sacrificado con etanol al 70%. Extirpe la piel y el músculo en la parte inferior del abdomen, y luego extraiga los dos testículos para exponer las almohadillas de grasa epidídimas.
2. Corte suavemente las almohadillas de grasa del epidídimo y tenga cuidado de no cortar los vasos sanguíneos.
3. Aísle el tejido graso que rodea el epidídimo, luego colóquelo en una placa de Petri que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS).
4. En el gabinete de bioseguridad, corte estas almohadillas de grasa en trozos pequeños con fórceps y bisturí. Transfiera estos trozos de tejido adiposo cortados a un tubo centrífugo de 50 ml que contenga 10 ml de PBS estéril.
5. Lave los tejidos grasos picados 5 veces con 10 ml de PBS cada vez para eliminar la sangre contaminante. Los siguientes procedimientos de lavado deben llevarse a cabo meticulosamente.
   1. Agregue 10 ml de PBS al tejido y mezcle bien durante 45 s. Luego, permita que el tejido se asiente a través de la gravedad manteniendo el tubo de pie durante 5 minutos para separarlo en dos capas.
   2. Aspire el PBS del infranadante con una jeringa de 10 ml y reemplácelo con 10 ml de PBS frescos para otro lavado.
   3. Repita este paso de lavado 4-5 veces hasta que el PBS esté libre de sangre. Esto indica que la mayoría, si no toda, de la sangre se extrae.
6. Después del lavado, vuelva a suspender el tejido adiposo en 10 ml de solución de colagenasa (0,1% de colagenasa tipo 1 en PBS). Selle el tubo herméticamente con parafilm, luego incube en un baño de agua agitadora (37 ° C, 80 rpm, durante 45 min) hasta que el tejido sea casi homogéneo.
   NOTA: Evite la digestión completa del tejido (cuando la solución se vuelve completamente homogénea con la desaparición completa de todos los residuos / piezas de tejido), ya que afecta negativamente el cultivo de células después. Por lo general, la digestión dura 30-45 minutos.
7. Una vez que se realiza la digestión de la colagenasa, vórtice el tubo durante 15 s, luego centrífuga durante 5 minutos a 300 x g. Vórtice el tubo nuevamente durante 10 s, seguido de otra centrifugación de 5 minutos. A continuación, se observarán tres capas. Deseche cuidadosamente la capa de aceite, seguida de la capa acuosa, sin perturbar el gránulo de fracción vascular estromal (SVF).
   NOTA: Retire el sobrenadante que contiene adipocitos y la solución de colagenasa. Primero, retire los adipocitos y la capa de aceite que lo acompaña con una pipeta de 10 ml para garantizar la eliminación completa de las gotas de aceite, luego retire la capa acuosa inferior.
8. Vuelva a suspender el gránulo SVF en la parte inferior del tubo en 10 ml de solución estéril de BSA (albúmina al 1%, solución de fracción V de suero bovino en PBS), luego centrífuga el tubo durante 5 min a 300 x g.
9. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y suspenda el pellet SVF en 8,5 ml de medios completos para Ad-MSC (compuesto por el medio modificado Eagle de Dulbecco / mezcla de nutrientes F-12 [DMEM / F12] medio suplementado con 10% fbS, 100 U / ml de penicilina, 100 μg / ml de estreptomicina, 0,25 μg / ml de anfotericina B y 2 mM de L-glutamina).
10. Cultive las células en un matraz^{de 25 cm 2} a 37 °C bajo un 5% de CO_2. Al día siguiente, verifique las celdas adjuntas, retire las celdas suspendidas y reemplace los medios. Después, cambia los medios de comunicación cada dos días.
11. Pasar las células cada 5-7 días cuando son 80% -90% confluentes usando Tripsina-EDTA. Utilice células entre los pasajes 3-5 para los experimentos posteriores descritos en este protocolo. En la Figura 1 se proporciona una presentación esquemática de todos los pasos de aislamiento.
    NOTA: Por lo general, la potencia de Trypisn-EDTA puede variar entre los diferentes proveedores, así que trate de minimizar el tiempo de tripsinización para evitar efectos tóxicos en las células.

2. Caracterización de las Ad-MSC mediante inmunofenotipado mediante análisis de citometría de flujo

1. En el pasaje 3, divida las células usando tripsina-EDTA. Lavar con PBS 2 veces y luego contar las células con un hemocitómetro.
2. Incubar 100.000 células a 4 °C en la oscuridad durante 20 min con anticuerpos monoclonales cd90 o CD105 (marcadores mesenquimales) o CD34 (marcador hematopoyético) de ratón marcados con fluoresceína-isotiocianato (FITC).
3. Lave las células y suspenda en 500 μL de tampón FACS. Análisis por citometría de flujo²⁵.

3. Evaluación del potencial de diferenciación de las MSC Ad aisladas en varios linajes mesenquimales

1. Diferenciación adipogénica
   1. Resuspender las células en medios completos (como se describe en el paso 1.9.), luego cultivar las células a una densidad de 3.7 x 10⁴ células / pozo en una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Incubar a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO₂. A continuación, cambie los medios cada 3 días hasta que las células alcancen casi el 100% de confluencia, lo que generalmente toma 3 días.
   2. Cuando las células alcancen la confluencia deseada, reemplace el medio de proliferación con el medio de diferenciación adipogénica (que consiste en medios LG-DMEM suplementados con 10% fbS, 100 U / ml de penicilina, 100 μg / ml de estreptomicina, 0.25 μg / ml de anfotericina B y 2 mM de L-glutamina con 1x suplemento adipogénico, suministrado con el Kit de identificación funcional de células madre mesenquimales) para inducir la adipogénesis. Luego, cambie el medio cada 3 días (0.5 mL/ pozo). Tenga cuidado de realizar el reemplazo de medios suavemente para no interrumpir las vacuolas lipídicas.
   3. Después de 21 días, evalúe la diferenciación adipogénica mediante un examen microscópico de la apariencia de las vacuolas lipídicas y mediante la tinción de Oil Red.
   4. Prepare una solución madre de Oil Red disolviendo 30 mg de tinción de Oil Red en 10 ml de isopropanol, y luego manténgala durante al menos 20 min a temperatura ambiente. Después, prepare una solución de trabajo mezclando 3 partes de la solución madre con 2 partes de agua de doble destilación (ddH₂O), mézclelas bien y manténgalas durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego filtre después con papel de filtro.
   5. Para documentar la diferenciación adipogénica, lave las células 2 veces con PBS, luego fíjelas usando formalina tamponada neutra al 10% (0.75 ml / pozo) durante 15 min. Después de eso, lave las células 2 veces con PBS usando 1 ml / pozo e incube las células durante 5 minutos cada vez. Es importante aspirar completamente el PBS antes de agregar la solución de trabajo Oil Red.
   6. Después del último lavado, agregue la solución de trabajo Oil Red a las células e incube durante 60 min a 37 ° C. Después, retire la solución de manchas y lave suavemente las células 2 veces con PBS. Observe las gotas lipídicas teñidas bajo el microscopio.
2. Diferenciación osteogénica
   1. Sembrar 7,4 x 10³ células/pocillo (0,5 mL medio/pozo) en una placa de 24 pocillos e incubarlas a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO₂ en medio completo (como se describe en el paso 1.9.) durante 3 días para alcanzar casi el 70% de confluencia.
   2. Inducir las células con el suplemento osteogénico (suministrado con el kit) en medios LG-DMEM suplementados con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B y 2 mM de L-glutamina.
   3. Continuar la inducción osteogénica durante 21 días, cambiando los medios de diferenciación cada 3 días.
   4. Prepare una solución de trabajo de la tinción de Alizarin Red S disolviendo 200 mg de tinción de Alizarin Red S en 9 ml de ddH₂O, y luego ajuste el pH a 4.1-4.3 usando hidróxido de amonio y HCl. A continuación, componga el volumen a 10 mL por ddH₂O. Después de esto, elimine los precipitados por filtración con papel de filtro.
   5. Lave las células 2 veces con PBS, luego fíjelas con formalina tamponada al 10% (0.75 ml / pozo) durante 15 min. Después, lave las células 2 veces usando PBS (1 ml/pocillo). Cada vez, incuba las células durante 5 min.
   6. Incubar las células fijas con la solución preparada de Alizarin-Red S al 2% durante 30 min en una incubadora de 37 °C.
   7. Después de eso, retire la solución de tinción, lave las células 2 veces con ddH₂O y una vez con PBS, y luego observe la matriz extracelular rica en calcio teñida para evaluar la diferenciación osteogénica bajo el microscopio.
3. Diferenciación condrogénica
   1. Sembrar 7,4 x 10³ células/pocillo (0,5 mL medio/pozo) en una placa de 24 pocillos e incubarlos a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO₂ en medio completo (como se describe en el paso 1.9.) durante 3 días para alcanzar casi el 70% de confluencia.
   2. Cuando se alcance la confluencia deseada, inducir la diferenciación condrogénica de las células con DMEM/F12 libre de suero que contenga insulina-transferrina selenio (ITS), suplemento condrogénico (suministrado con el kit), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B y 2 mM de L-glutamina²¹.
   3. Incubar las células con los medios condrogénicos durante 21 días, mientras se cambian los medios de diferenciación condrogénicos cada 3 días.
   4. Prepare una solución de trabajo de tinción Alcian Blue 8GX de la siguiente manera: Primero, prepare una solución de ácido acético glacial al 3% en ddH₂O agregando 3 ml de ácido acético glacial a 97 ml de ddH₂O. Luego, prepare una solución de trabajo de tinción Alcian Blue 8GX mezclando 0.1 g en 100 ml de solución de ácido glacial al 3%, y elimine cualquier precipitado por filtración con papel de filtro.
   5. Lave las células 2 veces con PBS, luego fíjelas con formalina tamponada al 10% (0.75 ml / pozo) durante 15 min. Después, lave las células 2 veces usando PBS (1 ml/pocillo). Cada vez, incuba las células durante 5 min.
   6. El siguiente paso es incubar las células en la tinción preparada de 0,1% al azul alciano 8GX en ácido acético glacial al 3% durante 60 min a 37 °C. Lave las células teñidas 2 veces con ddH₂O y una vez con PBS, y luego observe los proteoglicanos sulfatados teñidos bajo el microscopio.

4. Diferenciación de las MSC Ad en OPI

1. En el pasaje 3, divida los Ad-MSC usando Tripsina-EDTA. Primero, retire el medio, luego lave las células mientras aún están unidas en el matraz de cultivo con 5 ml de PBS. A continuación, agregue 5 ml de tripsina-EDTA al matraz de 75 cm² e incube a 37 ° C durante 3-10 min.
   NOTA: Trate de inducir las células en los pasajes tempranos, generalmente entre P3-P5, ya que los pasajes tardíos afectan negativamente las propiedades y capacidades de diferenciación de las células^17,24.
2. Después, inspeccione las células en busca de desprendimiento y por ser una suspensión de una sola célula. Añadir 5 ml de medios DMEM/F12 completos al matraz para inhibir la acción de la tripsina. Recoja la suspensión celular y transfiérala a un tubo de 15 ml, y luego agregue otros 5 ml de medios DMEM/F12 completos al tubo.
3. Centrifugar las células a 300 x g durante 2 min para granular las células.
4. Lave las células una vez con PBS, centrífuga nuevamente a 300 x g durante 2 min, y luego vuelva a suspender el pellet celular en 3-5 ml de medios DMEM / F12 completos.
5. Cuente las células usando tinte de exclusión azul tripano y un hemocitómetro.
6. Luego, sembra las células en placas de 6 pocillos (1 x 10⁶ células/ placa) y una placa de 12 pocillos (para el ensayo GSIS; 1 x 10⁶ células / placa) e incubar en una incubadora de 37 ° C, 5% de CO₂ en medios completos (como se describe en el paso 1.9.) durante 3 días para alcanzar casi el 90% de confluencia.
7. El día de la inducción, retire los medios, lave las células con PBS y luego preinduzca las células durante 2 días con medios previos a la inducción (DMEM / F12 suplementado con 10% fbS, 100 U / ml de penicilina, 100 μg / ml de estreptomicina, 0.25 μg / ml de anfotericina B, 2 mM de L-glutamina, 10 mM de nicotinamida [NA] y 1 mM de β-mercaptoetanol [β-ME]).
8. Inducir las células durante otro 1 día usando DMEM de glucosa alta (HG-DMEM, 4.5g / L de glucosa) suplementado con 2.5% FBS, 100 U / mL de penicilina, 100 μg / ml de estreptomicina, 0.25 μg / ml de anfotericina B, 2 mM de L-glutamina, 10 mM de NA y 1 mM de β-mercaptoetanol. Recolectar gránulos celulares al final de esta etapa (células D3 designadas en este protocolo).
9. Incubar las células durante 7 días adicionales en el medio de inducción de diferenciación final compuesto por HG-DMEM suplementado con 2,5% de FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B, 2 mM de L-glutamina, 10 mM de NA, 1mM de β-mercaptoetanol y 10 nM de exendina-4.
10. Al final del período especificado, recoja los gránulos celulares (llamados Final en este protocolo) y evalúe la diferenciación exitosa de las células mediante tinción DTZ y ensayo GSIS, como se indica a continuación en este protocolo.
11. Evalúe los IPC generados siguiendo los pasos 5 y 6 a continuación.

5. Tinción de ditizone

1. Prepare la solución madre de tinción de ditizona (DTZ) de la siguiente manera: Disuelva completamente 25 mg de DTZ en 2,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO), divida en alícuotas y guárdela a -20 ° C en la oscuridad hasta su uso.
2. Para la tinción, prepare una solución de trabajo 1:100 (volumen/volumen) diluyendo la solución madre en un medio de cultivo completo (HG-DMEM suplementado con 5% FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B y 2 mM de L-glutamina). Luego, filtre la solución de trabajo a través de un filtro de jeringa de 0.2 μm.
3. A continuación, para las células de cultivo de tinción DTZ especificadas en una placa de 6 pocillos y, después de aspirar el medio de cultivo, lave las células una vez con PBS y luego agregue 2 ml de solución de trabajo DTZ en cada pozo. Incubar durante al menos 2 h a 37 °C en la incubadora de CO₂ .
4. Lave cuidadosamente las células 2 veces con PBS. Después del último lavado, agregue 2 ml de PBS en cada pozo. Luego, observe los IPC teñidos de rojo carmesí bajo un microscopio invertido. Utilice Ad-MSC no inducidas cultivadas inicialmente en medio de crecimiento completo (10% FBS - DMEM/F12) como control.

6. Expresión génica de marcadores de células β mediante RT-qPCR

1. Extracción de ARN
   1. Después de la diferenciación, recoja los gránulos celulares y guárdelos a -80 °C hasta su uso. Suspenda cada gránulo celular (derivado de los seis pocillos de una placa de 6 pocillos agrupada) en 1 ml de reactivo de extracción de ARN de tiocianato de guanidio en un tubo libre de nucleasa de 1,5 ml, junto con el pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces. Incubar las muestras lisadas a temperatura ambiente durante 5 min para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteínas.
   2. Agregue 200 μL de cloroformo por 1 ml de reactivo de extracción de ARN y cubra de forma segura los tubos para agitarlos vigorosamente a mano durante 15 s. A continuación, incubar durante 3 min a temperatura ambiente.
   3. Centrifugar las muestras a 13.800 x g durante 15 min a 4 °C. Esto conducirá a la separación de la mezcla en una fase inferior de cloroformo, una interfase y una fase acuosa superior incolora, con el ARN permaneciendo en la fase acuosa.
   4. Coloque la fase acuosa superior en un tubo nuevo, evitando cuidadosamente tocar la interfase.
   5. Agregue 600 μL de isopropanol al 100% a la fase acuosa (volumen 1: 1), luego mezcle las muestras a fondo por inversión 25 veces e incube a temperatura ambiente durante 10 min.
   6. Centrifugar las muestras a 18.800 x g durante 30 min a 4 °C. El ARN precipitado forma una pequeña bolita similar a un gel en el lado del tubo.
   7. Retire el sobrenadante y lave los gránulos con 1 ml de etanol helado al 80%. Después de agregar el etanol, realice lentamente múltiples pipeteos del pellet de ARN durante 10 s.
   8. Centrifugar las muestras durante 5 min a 9.600 x g a 4 °C. Deseche el sobrenadante y deje que los gránulos de ARN se sequen al aire durante 5-10 minutos.
   9. Después del secado, disuelva los gránulos de ARN en 25-100 μL de agua libre de RNasa (de acuerdo con el tamaño inicial del pellet) mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces hasta la solubilización completa en tubos libres de nucleasa de 1,5 ml. Evite el secado excesivo del gránulo de ARN.
      NOTA: Por lo general, el pellet se vuelve transparente cuando se seca. Sin embargo, una vez que esté claro, resuspríalo rápidamente para evitar la sequedad excesiva del pellet.
   10. Cuantificar el ARN determinando las densidades ópticas (OD) a 260 nm y 280 nm, utilizando agua libre de nucleasas en blanco.
   11. Asegúrese de que las muestras tengan OD260/OD280 = 1.8-2.0.
2. Síntesis de ADNc
   1. Sintetizar aDNc a partir del ARN total aislado utilizando un kit de síntesis de ADNc.
   2. Llevar a cabo la reacción de síntesis de ADNc de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En un tubo de PCR de 200 μL, agregue un volumen de solución de ARN que contenga 0,5 μg de ARN total a la mezcla maestra de reacción que se muestra en la Tabla 1.
   3. Después de agregar el ARN a la mezcla maestra, ingrese la mezcla a través de un programa de ciclo de 50 ° C durante 30 minutos durante un ciclo, seguido de un ciclo de inactivación de 95 ° C durante 2 minutos, utilizando un termociclador.
   4. Diluir el ADNc utilizando agua libre de nucleasa hasta una concentración final de 2 ng/μL. Almacenar a -20 °C para rt-qPCR posterior.
3. RT-qPCR con SYBR Green Master Mix
   1. Llevar a cabo la reacción RT-qPCR para cada gen objetivo utilizando la plantilla de ADNc de acuerdo con la mezcla de reacción que se muestra en la Tabla 2. Haz todas las medidas por triplicado.
   2. Los conjuntos de cebadores utilizados se muestran en la Tabla 3. Realice todos los procedimientos rt-qPCR en hielo.
   3. Lleve a cabo la reacción RT-qPCR utilizando una máquina de PCR en tiempo real en la configuración predeterminada del programa. Las condiciones de ciclo térmico incluyeron una desnaturalización inicial de 95 °C durante 10 min, seguida de 45 ciclos de desnaturalización (95 °C, 15 s) y recocido/extensión combinados (60 °C, 1 min).
   4. Determinar los valores de C_t y detectar los niveles de expresión de acuerdo con ^2-ΔΔCt, con β-actina como control interno.

Tabla 1: Volúmenes de mezcla maestra de síntesis de ADNc.

Tabla 2: Mezcla de reacción RT-qPCR.

Tabla 3: Secuencias de cebado hacia adelante y hacia atrás.

7. Secreción de insulina estimulada por la glucosa

1. Preparación del tampón de bicarbonato Ringer (KRB) de Kreb
   1. Prepare la solución tampón de bicarbonato Ringer (KRB) de Kreb con concentraciones de glucosa de 2 mM (glucosa baja) y glucosa de 20 mM (glucosa alta) para el ensayo de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS). Los componentes utilizados para la preparación del tampón KRB se indican en la Tabla 4.
   2. Ajuste el pH del tampón usando 1 N HCl a aproximadamente 7.25-7.35 (es decir, 0.1-0.2 unidades por debajo del pH deseado 7.4, ya que puede aumentar durante la filtración).
   3. Añadir albúmina sérica bovina (BSA) recién hecha en una concentración del 0,1 % (peso/volumen).
   4. Agregue glucosa después (18 mg por 50 ml de KRB para preparar el tampón krB de glucosa baja de 2 mM, y 180 mg por 50 ml de KRB para preparar el tampón KRB de glucosa alta de 20 mM).
   5. Esterilice los tampones PREPARADOs DE LG y HG KRB por filtración a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm para estar listos para el ensayo GSIS.
2. Ensayo GSIS
   1. Inicialmente sembrar 1 x 10⁵ células/pozo en una placa de cultivo celular de 12 pocillos e inducir estas células utilizando exactamente el mismo protocolo de inducción de diferenciación.
   2. Al final del protocolo de inducción, lave suavemente los IPC generados (en placa) 2 veces con PBS y una vez con LG-KRB.
   3. Después, incube los IPC con 300 μL de LG-KRB/pozo durante 1 h, y luego descarte este tampón.
   4. A continuación, incube los IPC con 300 μL de búfer KRB de 2 mM (LG) o 20 mM (HG) durante 1 h adicional. Al final del período de incubación, recoja el sobrenadante y guárdelo a -80 °C para el posterior ensayo de insulina secretada utilizando un kit ELISA comercial y siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Trate de ser lo más suave posible al aspirar o agregar el búfer PBS y KRB al realizar el ensayo GSIS.

Tabla 4: Los componentes utilizados para la preparación del tampón KRB.

8. Análisis estadístico

1. Expresar todos los datos como media ± error estándar de la media (SEM). Todas las comparaciones se realizaron utilizando el análisis unidireccional de varianza (ANOVA) y la prueba post hoc de Tukey utilizando software estadístico. Los resultados con valores de p **p ≤ 0,01 y *p ≤ 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Aislamiento y caracterización de las MSC Ad
Como se muestra en la Figura 2, las células aisladas del tejido adiposo mostraron una población heterogénea de células redondeadas y similares a fibroblastos a partir del día siguiente de aislamiento (Figura 2A). 4 días después del aislamiento, las células de fibroblastos comenzaron a aumentar en número y tamaño y crecer como una población homogénea por el paso 1 (Figura 2B, C). Estas células continuaron creciendo como células adherentes al plástico, similares a los fibroblásticos, como se muestra hasta el paso 3, cumpliendo el primer criterio de características msc (Figura 2D). Estas Ad-MSC mostraron muy buenas características de cultivo, y se encontró que este protocolo era un protocolo relevante, fácil y relativamente rápido para aislar las Ad-MSC de las almohadillas de grasa epidídimas.

El siguiente paso fue caracterizar los Ad-MSC aislados. Según ISCT, las MSC deben seguir los tres criterios de adherencia plástica, expresión de CD mesenquimales con falta de marcadores hematopoyéticos y la capacidad de diferenciarse en adipocitos, osteocitos y condrocitos. Como se muestra en la Figura 3A, el análisis de citometría de flujo mostró que la mayoría de estas células expresaron CD90 y CD105 (76,4% y 73,6%, respectivamente). Por su parte, fueron casi negativos para CD34 (0,1%).

Además, tras la inducción de la diferenciación de estas células, mostraron la capacidad de diferenciarse en adipocitos, osteocitos y condrocitos. Como se muestra en la Figura 3B (panel superior), los adipocitos mostraron tinción de rojo aceite de las vacuolas lipídicas en comparación con las células no inducidas de control. Los osteocitos mostraron una tinción característica de Alizarin Red (Figura 3B, panel medio) en comparación con las células de control. Finalmente, las células inducidas por condrocitos mostraron tinción azul de la matriz extracelular en comparación con las células no inducidas de control (Figura 3B, panel inferior).

Estos datos indican claramente que las células aisladas del tejido adiposo no solo exhiben buenas características de cultivo, sino que también exhiben todos los criterios propuestos para las MSC.

Diferenciación de las Ad-MSC en células productoras de insulina (IPC)
Como se muestra en la Figura 4A, utilizamos un protocolo relativamente simple y corto para diferenciar las MSC Ad en IPC. Después de la inducción de la diferenciación, los IPC inducidos se evaluaron de varias maneras. Las células inducidas mostraron marcados cambios morfológicos. Como se muestra en la Figura 4B (panel superior), las células inducidas mostraron una morfología redondeada en forma de racimo en comparación con la morfología fibroblástica normal de las MSC Ad. Curiosamente, al teñirse con ditizona, estos grupos mostraron una mancha carmesí, que es una característica de los gránulos de zinc de la tinción de células β (Figura 4B, panel inferior).

Posteriormente, los IPC generados fueron evaluados genéticamente para la expresión de los marcadores específicos de células β en comparación con las células de control no inducidas. Como se muestra en la Figura 5A-E, las células inducidas fueron capaces de expresar varios marcadores específicos de células β, lo que indica su capacidad para generar IPC. En cuanto a FOXA2 -un marcador de endodermo definitivo (como se muestra en la Figura 5A)-, se expresó altamente en la diferenciación D3 en comparación con el control, alcanzando casi 30 veces y luego disminuyendo a solo 10 veces el control en las células diferenciadas finales (D3: 28,37 ± 0,88; Final: 12.10 ± 1.27; p < 0,05). En cuanto a Pdx-1 (que se considera un marcador temprano de células β), se elevó tanto en células diferenciadas D3 como finales, alcanzando casi 20 veces en comparación con las células no inducidas de control (D3: 22,39 ± 5,14; Final: 17.13 ± 0.342; p < 0,05; Figura 5B). En cuanto a los otros marcadores de células β, a saber, NKX6.1, MafA e insulina-1 (Ins1), todos mostraron elevación a partir de D3 hasta la diferenciación final, alcanzando casi 8 veces, 12 veces y 300 veces, respectivamente, en comparación con las células no inducidas de control (NKX6.1: D3: 1.94 ± 0.86, Final: 7.97 ± 1.34, p<0.05; MafA: D3: 6.59 ± 0.4, Final: 11.54 ± 2.40, p < 0.05; e Ins1: D3: 27.29 ± 20.27, Final: 318.20 ± 76.09, p < 0.05) (Figura 5C-E). Esto indica que estas Ad-MSC pueden diferenciarse en IPC que expresan marcadores de células β.

Finalmente, estas células fueron evaluadas para la secreción de insulina cuando se les desafió con el aumento de las concentraciones de glucosa. Como se muestra en la Figura 5F, la insulina secretada en el sobrenadante de los IPC inducidos cuando se desafió con glucosa de 20 mM fue significativamente mayor que la secretada cuando las células fueron desafiadas con glucosa de 2 mM (HG: 390 pg / ml ± 33 pg / ml; LG: 234 pg/mL ± 32 pg/mL, p < 0.05; Figura 5F)

Estos datos confirmaron que el protocolo utilizado logró diferenciar las Ad-MSC en IPC, lo que se confirmó genética y funcionalmente.

Figura 1: Presentación esquemática de los pasos del protocolo utilizado para el aislamiento y caracterización de las MSC Ad. Generado por Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Las fotomicrografías que muestran las MSC Ad aisladas. (A) Las células aisladas que exhiben una morfología similar a los fibroblastos adherentes al plástico comienzan a aparecer al día siguiente del aislamiento. (B) Con el tiempo, estas Ad-MSC adherentes (con morfología similar a la de los fibroblastos) proliferan y aumentan en número, alcanzando una población similar a los fibroblastos más homogénea en (C) P1 y (D) P3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Caracterización de Ad-MSCs. (A) El análisis citométrico de flujo de Ad-MSCs muestra que estas células son casi negativas para CD34 (panel superior), mientras que la mayoría de las células expresan CD90 y CD105 (panel inferior). Las MSC Ad pueden diferenciarse en los tres linajes mesenquimales, a saber, (B) adipocitos (donde las gotas de aceite están teñidas por rojo aceite), (C) osteocitos, teñidos por rojo alizarina, y (D) condrocitos, teñidos por alciano azul (en comparación con las células no inducidas de control). Control: células no inducidas, Diff: células diferenciadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Diferenciación de Ad-MSCs en IPCs. (A) Presentación esquemática del protocolo de diferenciación utilizado para generar IPCs a partir de Ad-MSCs, junto con fotomicrografías para las células en cada etapa durante la inducción de diferenciación hacia IPCs. Tras la diferenciación, las células pierden su morfología fibroblástica y tienden a agregarse formando grupos, que tienden a desprenderse y crecer en medios de suspensión. (B) Las fotomicrografías muestran las MSC Ad-MSC de control y las IPC generadas por el protocolo anterior que muestran cambios morfológicos de racimo redondo (panel derecho) en comparación con la morfología similar a los fibroblastos de las MSC Ad-MSC no inducidas (panel izquierdo), ya sea sin teñir (panel superior) o teñidas de DTZ (panel inferior).
Control: células no inducidas; IPC: células productoras de insulina; NA: nicotinamida; β-ME: beta mercaptoetanol; D3: Células inducidas en el día 3 durante la inducción de la diferenciación hacia los IPC; D10: IPC diferenciados finales al final del protocolo de inducción; Ex-4: exendin-4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Niveles de expresión relativos de marcadores de células β y GSIS para IPC. Niveles de expresión relativos por qRT-PCR para (A) FOXA2, (B) Pdx-1, (C) NKX6.1, (D) MafA y (E) Ins-1. (F) Niveles de insulina secretada en el sobrenadante al desafiar los IPC generados con glucosa 2mM (LG) o glucosa 20mM (HG). Control: Ad-MSC no inducidas, Día-3: células diferenciadas recogidas en D3; Final: IPC diferenciados finales; LG: glucosa baja; HG: glucosa alta. a: la media es diferente del control en p < 0,05; b: la media es diferente del día 3 en p < 0,05; *: la media de LG es diferente de HG en p < 0,05; la comparación se realizó mediante una prueba t de muestras independiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Todos los coautores declaran que no hay conflicto de intereses asociado con este trabajo.