Summary
Vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (Ad-MSC's) kunnen een potentiële bron zijn van MSC's die differentiëren in insulineproducerende cellen (IPC's). In dit protocol bieden we gedetailleerde stappen voor de isolatie en karakterisering van epididymale Ad-MSC's bij ratten, gevolgd door een eenvoudig, kort protocol voor het genereren van IPC's van dezelfde rat Ad-MSC's.
Abstract
Mesenchymale stamcellen (MSC's) - vooral die geïsoleerd uit vetweefsel (Ad-MSC's) - hebben speciale aandacht gekregen als een hernieuwbare, overvloedige bron van stamcellen die geen ethische problemen oplevert. De huidige methoden om Ad-MSC's te isoleren zijn echter niet gestandaardiseerd en maken gebruik van gecompliceerde protocollen waarvoor speciale apparatuur nodig is. We isoleerden Ad-MSC's uit het epididymale vet van Sprague-Dawley-ratten met behulp van een eenvoudige, reproduceerbare methode. De geïsoleerde Ad-MSC's verschijnen meestal binnen 3 dagen na isolatie, omdat adherente cellen fibroblastische morfologie vertonen. Die cellen bereiken 80% samenvloeiing binnen 1 week na isolatie. Daarna, bij passage 3-5 (P3-5), werd een volledige karakterisering uitgevoerd voor de geïsoleerde Ad-MSC's door immunofenotypering voor karakteristieke MSC cluster van differentiatie (CD) oppervlaktemarkers zoals CD90, CD73 en CD105, evenals het induceren van differentiatie van deze cellen in de osteogene, adipogene en chondrogene afstammingslijnen. Dit impliceert op zijn beurt de multipotentie van de geïsoleerde cellen. Bovendien hebben we de differentiatie van de geïsoleerde Ad-MSC's naar de insulineproducerende cellen (IPC's) -afstamming geïnduceerd via een eenvoudig, relatief kort protocol door het gemodificeerde Eagle-medium (HG-DMEM) van hoge glucose Dulbecco op te nemen, β-mercaptoethanol, nicotinamide en exendin-4. IPC-differentiatie werd genetisch beoordeeld, ten eerste, door het meten van de expressieniveaus van specifieke β-cel markers zoals MafA, NKX6.1, Pdx-1 en Ins1, evenals dithizonkleuring voor de gegenereerde IPC's. Ten tweede werd de beoordeling ook functioneel uitgevoerd door een glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) assay. Kortom, Ad-MSC's kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd, met alle MSC-karakteriseringscriteria, en ze kunnen inderdaad een overvloedige, hernieuwbare bron van IPC's in het laboratorium bieden voor diabetesonderzoek.
Introduction
Mesenchymale stamcellen (MSC's), ook bekend als mesenchymale stromale cellen, behoren tot de meest gebruikte celtypen voor regeneratieve geneeskunde 1,2. Ze worden geclassificeerd als volwassen stamcellen en gekenmerkt door multilineaire differentiatiepotentieel en zelfvernieuwingscapaciteit3. MSC's kunnen worden geïsoleerd en verkregen uit verschillende bronnen, waaronder vetweefsel, beenmerg, perifeer bloed, navelstrengweefsel en bloed, haarzakjes en tanden 4,5.
De isolatie van stamcellen uit vetweefsel wordt gezien als zowel aantrekkelijk als veelbelovend vanwege hun gemakkelijke toegang, snelle expansie in vitro en hoge opbrengst6. Vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (Ad-MSC's) kunnen worden geïsoleerd van verschillende soorten zoals mensen, runderen, muizen, ratten en, meer recent, geiten7. Het is bewezen dat Ad-MSC's nu potentiële kandidaten zijn voor tissue engineering en gen/celtherapie die zelfs kunnen worden gebruikt om een autoloog alternatief te ontwikkelen voor het langdurig herstel van wekedelenletsel of defecten 7,8.
De International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) heeft drie minimumcriteria gedefinieerd die door MSC's moeten worden tentoongesteld voor volledige karakterisering9. Ten eerste moeten ze plastic hechten. Ten tweede moeten MSC's mesenchymale stamceloppervlakmarkers zoals CD73, CD90 en CD105 tot expressie brengen en de expressie van de hematopoëtische markers CD45, CD34, CD14 of CD11b, CD79α of CD19 en HLA-DR missen. Ten slotte moeten MSC's het vermogen vertonen om te differentiëren in de drie mesenchymale afstammingslijnen: adipocyten, osteocyten en chondrocyten. Interessant is dat MSC's ook kunnen differentiëren in andere afstammingslijnen zoals neuronale cellen, cardiomyocyten, hepatocyten en epitheelcellen10,11.
In feite bezitten MSC's unieke eigenschappen die het mogelijk maken om ze toe te passen als potentiële therapeutische middelen in regeneratieve therapie voor verschillende ziekten. MSC's kunnen oplosbare factoren afscheiden om een immunomodulerende omgeving te induceren die therapeutische voordelen biedt12. Bovendien kunnen MSC's migreren naar plaatsen van letsel en tumormicro-omgevingen om gerichte therapie te leveren; de mechanismen zijn echter niet volledig opgehelderd13. Bovendien hebben MSC's de mogelijkheid om exosomen, extracellulaire blaasjes op nanoschaal die een lading niet-coderende RNA's, eiwitten en oplosbare factoren dragen, uit te scheiden, die onlangs naar voren kwamen als een nieuw mechanisme van het therapeutische potentieel van de MSC's bij verschillende ziekten14.
Wat nog belangrijker is, msc's hebben duidelijke aandacht gegenereerd voor hun potentieel om te differentiëren in insulineproducerende cellen (IPC's), hetzij door genetische modificatie15,16 of door gebruik te maken van verschillende extrinsieke inducerende factoren binnen de kweekmedia in vitro17. De IPC-inductieperiode varieert sterk, omdat deze afhankelijk is van het gebruikte inductieprotocol en de gebruikte extrinsieke factoren. Het proces van differentiatie kan dagen tot maanden duren en vereist een combinatie van exogene inducerende factoren die in verschillende stadia moeten worden toegevoegd en / of ingetrokken. Veel van deze factoren die zijn gebruikt voor endocriene pancreasdifferentiatie zijn biologisch actieve verbindingen waarvan is aangetoond dat ze de proliferatie of differentiatie / neogenese van insuline-afscheidende β-cellen bevorderen en / of het insulinegehalte van IPC's verhogen 18,19,20,21. Het is hier opmerkelijk dat MSC's ook zijn gemeld met therapeutische effecten bij diabetes en de complicaties ervan via verschillende mechanismen, waaronder hun secretoom, evenals een breed scala aan immunomodulerende acties 22,23,24.
In dit protocol presenteren we een gedetailleerd stapsgewijs protocol voor de isolatie en karakterisering van Ad-MSC's van rattenepitheel vet, gevolgd door een eenvoudig, relatief kort protocol voor het genereren van IPC's van Ad-MSC's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde richtlijnen en alle procedures werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Faculteit Farmacie, De Britse Universiteit in Egypte (BUE), Caïro, Egypte. Het Ad-MSC isolatieprotocol is overgenomen van Lopez en Spencer, met wijzigingen15.
1. Isolatie van Ad-MSC's van ratten epididymale vetkussens
- Gebruik mannelijke Sprague-Dawley-ratten met een gewicht van 250-300 g die niet ouder zijn dan 1 maand (twee per isolatie). Verdoof de dieren en euthanaseer ze vervolgens door cervicale dislocatie. Spuit het geëuthanaseerde dier in met 70% ethanol. Snijd de huid en de spier in het onderste deel van de buik weg en trek vervolgens de twee teelballen eruit om de epididymale vetkussens bloot te leggen.
- Snijd voorzichtig de epididymale vetkussens en pas op dat u de bloedvaten niet doorsnijdt.
- Isoleer het vetweefsel rond de bijbal en plaats het vervolgens in een petrischaal met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Snijd deze vetkussens in de bioveiligheidskast in kleine stukjes met behulp van een tang en scalpel. Breng deze gesneden vetweefselstukken over in een centrifugebuis van 50 ml met 10 ml steriel PBS.
- Was de gehakte vetweefsels 5 keer met telkens 10 ml PBS om het verontreinigende bloed te verwijderen. De volgende wasprocedures moeten zorgvuldig worden uitgevoerd.
- Voeg 10 ml PBS toe aan het weefsel en meng grondig gedurende 45 s. Laat het weefsel vervolgens bezinken via de zwaartekracht door de buis 5 minuten te laten staan om in twee lagen te scheiden.
- Haal de PBS uit de infranatant met een spuit van 10 ml en vervang deze door verse 10 ml PBS voor een nieuwe wasbeurt.
- Herhaal deze wasstap 4-5 keer totdat de PBS vrij is van bloed. Dit geeft aan dat het grootste deel, zo niet alle, bloed wordt verwijderd.
- Resuspenseer na het wassen het vetweefsel in 10 ml collagenase-oplossing (0,1% collagenase type 1 bij PBS). Sluit de buis goed af met parafilm en incubeer deze vervolgens in een schuddend waterbad (37 °C, 80 tpm, gedurende 45 minuten) totdat het weefsel bijna homogeen is.
OPMERKING: Vermijd de volledige vertering van het weefsel (wanneer de oplossing volledig homogeen wordt met volledige verdwijning van alle weefselresten / stukjes), omdat het de kweek van cellen daarna nadelig beïnvloedt. Meestal duurt de spijsvertering 30-45 min. - Zodra de collagenasevertering is voltooid, vortex de buis gedurende 15 s en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 300 x g. Vortex de buis opnieuw voor 10 s, gevolgd door nog eens 5 minuten centrifugatie. Er worden dan drie lagen waargenomen. Gooi de olielaag, gevolgd door de waterige laag, voorzichtig weg zonder de stromale vasculaire fractie (SVF) pellet te verstoren.
OPMERKING: Verwijder het supernatant dat adipocyten bevat en de collagenase-oplossing. Verwijder eerst de adipocyten en de bijbehorende olielaag met een pipet van 10 ml om ervoor te zorgen dat de oliedruppels volledig worden verwijderd en verwijder vervolgens de onderliggende waterige laag. - Resuspendeer de SVF-pellet op de bodem van de buis in 10 ml steriele BSA-oplossing (1% albumine, runderserumfractie V-oplossing in PBS) en centrifugeer de buis vervolgens gedurende 5 minuten bij 300 x g.
- Gooi na centrifugatie het supernatant weg en suspensie de SVF-pellet in 8,5 ml volledige media voor Ad-MSC's (samengesteld uit Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 [DMEM / F12] media aangevuld met 10% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine, 0,25 μg / ml amfotericine B en 2 mM L-glutamine).
- Kweek de cellen in een kolfvan 25 cm 2 bij 37 °C onder 5% CO2. Controleer de volgende dag de aangesloten cellen, verwijder de zwevende cellen en vervang de media. Wissel daarna om de dag van media.
- Passeer de cellen elke 5-7 dagen wanneer ze 80% -90% confluent zijn met behulp van Trypsin-EDTA. Gebruik cellen tussen passages 3-5 voor de volgende experimenten die in dit protocol worden beschreven. Een schematische presentatie van alle isolatiestappen is opgenomen in figuur 1.
OPMERKING: Meestal kan de potentie van Trypisn-EDTA variëren tussen verschillende leveranciers, dus probeer de tijd van trypsinisatie te minimaliseren om toxische effecten op de cellen te voorkomen.
2. Karakterisering van Ad-MSC's door immunofenotypering met behulp van flowcytometrieanalyses
- Splits de cellen bij passage 3 met trypsine-EDTA. Was 2 keer met PBS en tel vervolgens de cellen met een hemocytometer.
- Incubeer 100.000 cellen bij 4 °C in het donker gedurende 20 minuten met muis anti-rat CD90 of CD105 (mesenchymale markers) of CD34 (hematopoietische marker) monoklonaal antilichaam gelabeld met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC).
- Was de cellen en suspensie ze in 500 μL FACS-buffer. Analyse door flowcytometrie25.
3. Beoordeling van het differentiatiepotentieel van geïsoleerde ad-MSC's in verschillende mesenchymale afstammingslijnen
- Adipogene differentiatie
- Resuspensieer de cellen in volledige media (zoals beschreven in stap 1.9.) en kweek de cellen vervolgens met een dichtheid van 3,7 x 104 cellen / put in een 24-well weefselkweekplaat. Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. Verander vervolgens de media om de 3 dagen totdat de cellen bijna 100% samenvloeiing bereiken, wat meestal 3 dagen duurt.
- Wanneer de cellen de gewenste confluentie bereiken, vervangt u de proliferatiemedia door de adipogene differentiatiemedia (bestaande uit LG-DMEM-media aangevuld met 10% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine, 0,25 μg / ml amfotericine B en 2 mM L-glutamine met 1x adipogeen supplement, geleverd met de Mesenchymal Stem Cells Functional Identification Kit) om adipogenese te induceren. Vervang vervolgens de media om de 3 dagen (0,5 ml / put). Zorg ervoor dat u de mediavervanging voorzichtig uitvoert om de lipide vacuolen niet te verstoren.
- Beoordeel na 21 dagen de adipogene differentiatie door microscopisch onderzoek van het uiterlijk van de lipide vacuolen en door olierode kleuring.
- Bereid een voorraadoplossing van Oil Red door 30 mg Olierode vlek op te lossen in 10 ml isopropanol en bewaar deze vervolgens gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur. Bereid daarna een werkoplossing door 3 delen voorraadoplossing te mengen met 2 delen dubbel gedestilleerd water (ddH2O), meng ze goed en bewaar het gedurende 10 minuten op kamertemperatuur en filter daarna met filterpapier.
- Om de adipogene differentiatie te documenteren, wast u de cellen 2 keer met PBS en fixeert u ze vervolgens met neutraal gebufferd formaline 10% (0,75 ml / put) gedurende 15 minuten. Was daarna de cellen 2 keer met PBS met behulp van 1 ml / put en incubeer de cellen gedurende 5 minuten elke keer. Het is belangrijk om de PBS volledig te aspirateren voordat u de Oil Red-werkoplossing toevoegt.
- Voeg na de laatste wasbeurt de Oil Red-werkoplossing toe aan de cellen en incubeer ze gedurende 60 minuten bij 37 °C. Verwijder daarna de vlekoplossing en was de cellen 2 keer voorzichtig met PBS. Observeer de gekleurde lipidedruppels onder de microscoop.
- Osteogene differentiatie
- Zaai 7,4 x 103 cellen/put (0,5 ml medium/put) in een plaat met 24 putten en incubeer ze bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 in volledige media (zoals beschreven in stap 1.9.) gedurende 3 dagen om bijna 70% samenvloeiing te bereiken.
- Induceer de cellen met het osteogene supplement (meegeleverd met de kit) in LG-DMEM-media aangevuld met 10% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine, 0,25 μg / ml amfotericine B en 2 mM L-glutamine.
- Ga door met de osteogene inductie gedurende 21 dagen en verander de differentiatiemedia om de 3 dagen.
- Bereid een werkoplossing van Alizarin Red S-kleuring door 200 mg Alizarin Red S-kleuring op te lossen in 9 ml ddH2O en pas vervolgens de pH aan op 4,1-4,3 met behulp van ammoniumhydroxide en HCl. Vul vervolgens het volume aan op 10 ml bij ddH2O. Verwijder hierna alle neerslagen door filtratie met filterpapier.
- Was de cellen 2 keer met PBS en fixeer ze vervolgens met 10% gebufferd formaline (0,75 ml / put) gedurende 15 minuten. Was daarna de cellen 2 keer met PBS (1 ml/put). Incubeer de cellen elke keer gedurende 5 minuten.
- Incubeer de vaste cellen met de bereide 2% Alizarine-Rode S-oplossing gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C.
- Verwijder daarna de vlekoplossing, was de cellen 2 keer met ddH2O en eenmaal met PBS en observeer vervolgens de gekleurde calciumrijke extracellulaire matrix om osteogene differentiatie onder de microscoop te beoordelen.
- Chondrogene differentiatie
- Zaai 7,4 x 103 cellen/put (0,5 ml medium/put) in een plaat met 24 putten en incubeer deze bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 in volledige media (zoals beschreven in stap 1.9.) gedurende 3 dagen om bijna 70% samenvloeiing te bereiken.
- Wanneer de gewenste confluentie is bereikt, induceer dan de chondrogene differentiatie van de cellen met serumvrije DMEM / F12 die insuline-transferrine selenium (ITS), chondrogene supplement (meegeleverd met de kit), 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine, 0,25 μg / ml amfotericine B en 2 mM L-glutamine21.
- Incubeer de cellen met de chondrogene media gedurende 21 dagen, terwijl de chondrogene differentiatiemedia om de 3 dagen worden vervangen.
- Bereid een werkoplossing van Alcian Blue 8GX-kleuring als volgt: Bereid eerst een 3% ijsazijnzuuroplossing in ddH2O door 3 ml ijsazijn toe te voegen aan 97 ml ddH2O. Bereid vervolgens een werkoplossing van Alcian Blue 8GX-vlek door 0,1 g in 100 ml 3% glaciale zuuroplossing te mengen en verwijder eventuele neerslag door filtratie met filterpapier.
- Was de cellen 2 keer met PBS en fixeer ze vervolgens met 10% gebufferd formaline (0,75 ml / put) gedurende 15 minuten. Was daarna de cellen 2 keer met PBS (1 ml/put). Incubeer de cellen elke keer gedurende 5 minuten.
- De volgende stap is het incuberen van de cellen in de bereide 0,1% Alcian Blue 8GX kleuring in 3% ijsazijn gedurende 60 min bij 37 °C. Was de gekleurde cellen 2 keer met ddH2O en eenmaal met PBS en observeer vervolgens de gekleurde gesulfateerde proteoglycanen onder de microscoop.
4. Differentiatie van Ad-MSC's in IPC's
- Splits in passage 3 de Ad-MSC's met behulp van Trypsin- EDTA. Verwijder eerst de media en was vervolgens de cellen terwijl ze nog in de kweekkolf zijn bevestigd met 5 ml PBS. Voeg vervolgens 5 ml Trypsin-EDTA toe aan de kolf van 75 cm2 en incubeer bij 37 °C gedurende 3-10 minuten.
OPMERKING: Probeer de cellen te induceren bij vroege passages, meestal tussen P3-P5, omdat late passages de eigenschappen en differentiatiemogelijkheden van de cellen nadelig beïnvloeden17,24. - Inspecteer daarna de cellen op onthechting en op een eencellige suspensie. Voeg 5 ml volledige DMEM/F12-media toe aan de kolf om de trypsinewerking te remmen. Verzamel de celsuspensie en breng deze over naar een buis van 15 ml en voeg vervolgens nog eens 5 ml volledige DMEM / F12-media toe aan de buis.
- Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 2 minuten om de cellen te pelleteren.
- Was de cellen eenmaal met PBS, centrifugeer opnieuw op 300 x g gedurende 2 minuten en resuspendeerde de celpellet vervolgens in 3-5 ml volledige DMEM / F12-media.
- Tel de cellen met behulp van trypan blue exclusion dye en een hemocytometer.
- Zaai vervolgens de cellen in 6-well platen (1 x 106 cellen / plaat) en een 12-well plaat (voor GSIS-assay; 1 x 106 cellen / plaat) en incubeer in een 37 ° C, 5% CO2-incubator in volledige media (zoals beschreven in stap 1.9.) gedurende 3 dagen om bijna 90% samenvloeiing te bereiken.
- Verwijder op de dag van inductie de media, was de cellen met PBS en induceer de cellen vervolgens gedurende 2 dagen door pre-inductiemedia (DMEM / F12 aangevuld met 10% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine, 0,25 μg / ml amfotericine B, 2 mM L-glutamine, 10 mM nicotinamide [NA] en 1mM β-mercaptoethanol [β-ME]).
- Induceer de cellen nog eens 1 dag met behulp van hoge glucose DMEM (HG-DMEM, 4,5 g / L glucose) aangevuld met 2,5% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine, 0,25 μg / ml amfotericine B, 2 mM L-glutamine, 10 mM NA en 1mM β-mercaptoethanol. Verzamel celpellets aan het einde van deze fase (aangeduid als D3-cellen in dit protocol).
- Incubeer de cellen nog eens 7 dagen in de uiteindelijke differentiatie-inductiemedia bestaande uit HG-DMEM aangevuld met 2,5% FBS, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 0,25 μg/ml amfotericine B, 2 mM L-glutamine, 10 mM NA, 1mM β-mercaptoethanol en 10 nM exendin-4.
- Verzamel aan het einde van de opgegeven periode celpellets (in dit protocol Final genoemd) en beoordeel de succesvolle differentiatie van de cellen door DTZ-kleuring en GSIS-assay, zoals volgt in dit protocol.
- Beoordeel de gegenereerde IPC's door de onderstaande stappen 5 en 6 te volgen.
5. Dithizone kleuring
- Bereid dithizon (DTZ) kleurstofoplossing als volgt: Los 25 mg DTZ volledig op in 2,5 ml dimethylsulfoxide (DMSO), verdeel in aliquots en bewaar bij −20 °C in het donker tot gebruik.
- Bereid voor kleuring een werkoplossing 1:100 (volume/volume) door de stamoplossing te verdunnen in een volledig kweekmedium (HG-DMEM aangevuld met 5% FBS, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 0,25 μg/ml amfotericine B en 2 mM L-glutamine). Filtreer vervolgens de werkoplossing door een spuitfilter van 0,2 μm.
- Vervolgens, voor de gespecificeerde DTZ-kleuringscultuurcellen in een 6-wellsplaat en, na het aanzuigen van de kweekmedia, was de cellen eenmaal met PBS en voeg vervolgens 2 ml DTZ-werkoplossing toe aan elke put. Incubeer gedurende ten minste 2 uur bij 37 °C in de CO2-incubator .
- Was de cellen 2 keer zorgvuldig met PBS. Voeg na de laatste wasbeurt 2 ml PBS toe aan elk putje. Observeer vervolgens de karmozijnrode roodgekleurde IPC's onder een omgekeerde microscoop. Gebruik niet-geïnduceerde Ad-MSC's die aanvankelijk zijn gekweekt in volledig groeimedium (10% FBS - DMEM/F12) als controle.
6. Genexpressie van β-cel markers door RT-qPCR
- RNA-extractie
- Verzamel na differentiatie de celpellets en bewaar ze bij −80 °C tot gebruik. Suspensie elke celpellet (afgeleid van de zes putten van één 6-wells plaat gepoold) in 1 ml guanidiumthiocyanaat RNA-extractiereagens in een 1,5 ml nucleasevrije buis, samen met pipetteren meerdere keren op en neer. Incubeer de gelyseerde monsters bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten om volledige dissociatie van de nucleoproteïnecomplexen mogelijk te maken.
- Voeg 200 μL chloroform per 1 ml RNA-extractiereagens toe en sluit de buizen stevig af om krachtig met de hand te worden geschud gedurende 15 s. Incubeer vervolgens gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer de monsters bij 13.800 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Dit zal leiden tot mengselscheiding in een lagere chloroformfase, een interfase en een kleurloze bovenste waterige fase, waarbij het RNA in de waterige fase achterblijft.
- Plaats de bovenste waterige fase in een nieuwe buis, terwijl u voorzichtig vermijdt de interfase aan te raken.
- Voeg 600 μL 100% isopropanol toe aan de waterige fase (1:1 volume), meng de monsters vervolgens grondig door inversie 25 keer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer de monsters bij 18.800 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Het neergeslagen RNA vormt een kleine gelachtige pellet aan de buiszijde.
- Verwijder het supernatant en was de pellets met 1 ml 80% ijskoude ethanol. Nadat u de ethanol hebt toegevoegd, voert u langzaam meerdere pipetteringen van de RNA-pellet uit gedurende 10 s.
- Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 9.600 x g bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en laat de RNA-pellets 5-10 minuten aan de lucht drogen.
- Los na het drogen de RNA-pellets op in 25-100 μL RNase-vrij water (afhankelijk van de initiële pelletgrootte) door meerdere keren op en neer te pipetteren tot volledige oplosbaarheid in 1,5 ml nucleasevrije buizen. Vermijd overmatig drogen van de RNA-pellet.
OPMERKING: Meestal wordt de pellet transparant wanneer deze droogt. Zodra het echter duidelijk is, moet u het onmiddellijk resuspenteren om overmatige droogheid van de pellet te voorkomen. - Kwantificeer RNA door de optische dichtheden (OD) bij 260 nm en 280 nm te bepalen, met behulp van nucleasevrij water als blanco.
- Zorg ervoor dat de monsters OD260/OD280 = 1.8-2.0 hebben.
- cDNA synthese
- Synthetiseer cDNA uit het geïsoleerde totale RNA met behulp van een cDNA-synthesekit.
- Voer de cDNA-synthesereactie uit volgens de instructies van de fabrikant. Voeg in een PCR-buis van 200 μL een volume RNA-oplossing met 0,5 μg totaal RNA toe aan de reactiemastermix in tabel 1.
- Nadat u het RNA aan de mastermix hebt toegevoegd, voert u het mengsel in via een cyclusprogramma van 50 °C gedurende 30 minuten gedurende één cyclus, gevolgd door een inactiveringscyclus van 95 °C gedurende 2 minuten, met behulp van een thermische cycler.
- Verdun het cDNA met nucleasevrij water tot een eindconcentratie van 2 ng/μL. Bewaren bij −20 °C voor de daaropvolgende RT-qPCR.
- RT-qPCR met SYBR Green Master Mix
- Voer de RT-qPCR-reactie voor elk doelgen uit met behulp van een cDNA-sjabloon volgens de reactiemix in tabel 2. Doe alle maatregelen in drievoud.
- De gebruikte sets primers zijn weergegeven in tabel 3. Voer alle RT-qPCR-procedures uit op ijs.
- Voer de RT-qPCR-reactie uit met behulp van een real-time PCR-machine op standaardprogramma-instellingen. De thermische cyclusomstandigheden omvatten initiële denaturatie van 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 45 cycli van denaturatie (95 °C, 15 s) en gecombineerd gloeien/verlengen (60 °C, 1 min).
- Bepaal de Ct-waarden en detecteer de expressieniveaus in overeenstemming met 2-ΔΔCt, met β-actine als interne controle.
| cDNA synthese master mix | Volume (μl) |
| 5x cDNA synthese buffer | 4 |
| DNTP | 2 |
| RNA-primer | 1 |
| Verso Enzym Mix | 1 |
| RT versterker | 1 |
| Nucleasevrij water | Veranderlijk |
| Totaal RNA | Veranderlijk |
| Totaal reactievolume | 20 |
Tabel 1: cDNA synthese master mix volumes.
| RT-qPCR reactie mix | Volume (μl) | Eindconcentratie in 10 μL |
| cDNA | 2 | 2 ng/put |
| RT-qPCR Forward primer (3 μM) | 1 | 300 nM |
| RT-qPCR Omgekeerde primer (3 μM) | 1 | 300 nM |
| Nucleasevrij water | 1 | ------- |
| 2x SYBR Groene master mix | 5 | 1x |
| Totaal reactievolume | 10 |
Tabel 2: RT-qPCR-reactiemengsel.
| Gen | Voorwaartse primer | Omgekeerde primer |
| Foxa2 | GAGCCGTGAAGATGGAAGG | ATGTTGCCGGAACCACTG |
| Pdx-1 | ATCCACCTCCCGGACCTTTC | CCTCCGGTTCTGCTGCGTAT |
| NKX6,1 | ACACCAGACCCACATTCTCCG | ATCTCGGCTGCGTGCTTCTT |
| Mafa | TTCAGCAAGGAGGAGGTCAT | CCGCCAACTTCTCGTATTTC |
| Ins-1 | CACCTTTGTGGTCCTCACCT | CTCCAGTGCCAAGGTCTGA |
| β-actine | TGGAGAAGATTTGGCACCAC | AACACAGCCTGGATGGCTAC |
Tabel 3: Voorwaartse en omgekeerde primersequenties.
7. Glucose-gestimuleerde insulinesecretie
- Bereiding van Kreb's Ringer bicarbonaat (KRB) buffer
- Bereid Kreb's Ringer bicarbonaat (KRB) bufferoplossing met zowel 2 mM glucose (lage glucose) als 20 mM glucose (hoge glucose) concentraties voor de glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) assay. De componenten die voor de KRB-buffervoorbereiding worden gebruikt, zijn vermeld in tabel 4.
- Pas de pH van de buffer met 1 N HCl aan tot ongeveer 7,25-7,35 (d.w.z. 0,1-0,2 eenheden onder de gewenste pH 7,4, omdat deze tijdens de filtratie kan stijgen).
- Voeg runderserumalbumine (BSA) vers toe in een concentratie van 0,1 % (gewicht/volume).
- Voeg daarna glucose toe (18 mg voor 50 ml KRB om de KRB-buffer met een lage glucosegehalte van 2 mM te bereiden en 180 mg voor 50 ml KRB om de KRB-buffer van 20 mM met hoge glucose te bereiden).
- Steriliseer de bereide LG- en HG KRB-buffers door filtratie door een spuitfilter van 0,2 μm om klaar te zijn voor de GSIS-test.
- GSIS-test
- In eerste instantie zaaien 1 x 105 cellen/put in een 12-well celkweekplaat en induceren deze cellen door exact hetzelfde differentiatie-inductieprotocol te gebruiken.
- Was aan het einde van het inductieprotocol de gegenereerde IPC's (in plaat) voorzichtig 2 keer met PBS en eenmaal met LG-KRB.
- Incubeer daarna de IPC's met 300 μL LG-KRB/put gedurende 1 uur en gooi deze buffer vervolgens weg.
- Incubeer vervolgens de IPC's met 300 μL KRB-buffer van 2 mM (LG) of 20 mM (HG) KRB-buffer gedurende nog eens 1 uur. Verzamel het supernatant aan het einde van de incubatietijd en bewaar het bij −80 °C voor de daaropvolgende uitgescheiden insulinetest met behulp van een commerciële ELISA-kit en volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Probeer zo voorzichtig mogelijk te zijn tijdens het aspirateren of toevoegen van de PBS- en KRB-buffer bij het uitvoeren van de GSIS-test.
| Bestanddeel | Concentratie |
| Magnesiumchloride (Watervrij) | 0,0468 g/l |
| Kaliumchloride | 0,34 g/l |
| Tafelzout | 7,00 g/l |
| Natriumfosfaat dibasisch (watervrij) | 0,1 g/l |
| Natriumfosfaat monobasisch (watervrij) | 0,18 g/l |
| Natriumbicarbonaat | 1,26 g/l |
| Calciumchloride | 0,2997 g/l |
Tabel 4: De componenten die worden gebruikt voor de KRB-buffervoorbereiding.
8. Statistische analyse
- Druk alle gegevens uit als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Alle vergelijkingen werden gedaan met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) en Tukey's post-hoctest met behulp van statistische software. Resultaten met p-waarden **p ≤ 0,01 en *p ≤ 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolatie en karakterisering van Ad-MSC's
Zoals te zien is in figuur 2, vertoonden de geïsoleerde cellen uit vetweefsel een heterogene populatie van afgeronde en fibroblastachtige cellen vanaf de volgende dag van isolatie (figuur 2A). 4 dagen na isolatie begonnen de fibroblastcellen in aantal en grootte toe te nemen en groeiden ze als een homogene populatie door passage 1 (figuur 2B,C). Deze cellen bleven groeien als plastic-adherente, fibroblastisch-achtige cellen zoals getoond tot passage 3, en voldeden aan het eerste criterium van MSC-kenmerken (figuur 2D). Deze Ad-MSC's vertoonden zeer goede kweekkenmerken en dit protocol bleek een relevant, eenvoudig en relatief snel protocol te zijn om Ad-MSC's te isoleren van epididymale vetkussens.
De volgende stap was het karakteriseren van de geïsoleerde Ad-MSC's. Volgens ISCT moeten MSC's de drie criteria volgen van plastic hechting, expressie van mesenchymale cd's met een gebrek aan hematopoëtische markers en het vermogen om te differentiëren in adipocyten, osteocyten en chondrocyten. Zoals te zien is in figuur 3A, toonde de flowcytometrieanalyse aan dat de meeste van deze cellen CD90 en CD105 tot expressie brachten (respectievelijk 76,4% en 73,6%). Ondertussen waren ze bijna negatief voor CD34 (0,1%).
Bovendien toonden ze bij inductie van differentiatie van deze cellen het vermogen om te differentiëren in adipocyten, osteocyten en chondrocyten. Zoals te zien is in figuur 3B (bovenste paneel), vertoonden de adipocyten olierode kleuring van lipide vacuolen in vergelijking met controle niet-geïnduceerde cellen. De osteocyten vertoonden karakteristieke Alizarine Rode kleuring (Figuur 3B, middenpaneel) in vergelijking met controlecellen. Ten slotte vertoonden chondrocyten geïnduceerde cellen blauwe kleuring van de extracellulaire matrix in vergelijking met controle-niet-geïnduceerde cellen (figuur 3B, onderste paneel).
Deze gegevens geven duidelijk aan dat geïsoleerde cellen uit vetweefsel niet alleen goede kweekkenmerken vertonen, maar ook alle criteria vertonen die voor MSC's worden voorgesteld.
Differentiatie van Ad-MSC's in insulineproducerende cellen (IPC's)
Zoals te zien is in figuur 4A, hebben we een relatief eenvoudig, kort protocol gebruikt om Ad-MSC's te onderscheiden in IPC's. Na de introductie van differentiatie werden de geïnduceerde IPC's op verschillende manieren beoordeeld. De geïnduceerde cellen vertoonden duidelijke morfologische veranderingen. Zoals te zien is in figuur 4B (bovenste paneel), vertoonden de geïnduceerde cellen afgeronde, clusterachtige morfologie in vergelijking met de normale fibroblastische morfologie van Ad-MSC's. Interessant is dat deze clusters bij het kleuren met dithizon een karmozijnrode vlek vertoonden, wat een kenmerk is van zinkkorrels van β-celkleuring (figuur 4B, onderste paneel).
Daarna werden de gegenereerde IPC's genetisch beoordeeld op de expressie van de specifieke β-cel markers in vergelijking met de niet-geïnduceerde controlecellen. Zoals te zien is in figuur 5A-E, waren de geïnduceerde cellen in staat om verschillende specifieke β-cel markers tot expressie te brengen, wat aangeeft dat ze in staat zijn om IPC's te genereren. Wat BETREFT FOXA2 - een definitieve endodermmarker (zoals weergegeven in figuur 5A) - deze was sterk uitgedrukt bij D3-differentiatie in vergelijking met controle, bereikte bijna 30 keer en daalde vervolgens tot slechts 10 keer van de controle in de uiteindelijke gedifferentieerde cellen (D3: 28,37 ± 0,88; Finale: 12.10 ± 1.27; p < 0,05). Wat betreft Pdx-1 (dat wordt beschouwd als een vroege marker van β-cellen), het was verhoogd in zowel D3- als uiteindelijke gedifferentieerde cellen en bereikte bijna 20 keer in vergelijking met controle-niet-geïnduceerde cellen (D3: 22,39 ± 5,14; Finale: 17.13 ± 0.342; p < 0,05; Figuur 5B). Met betrekking tot de andere β-celmarkers, namelijk NKX6.1, MafA en insuline-1 (Ins1), vertoonden ze allemaal een hoogte vanaf D3 tot de uiteindelijke differentiatie, waarbij ze respectievelijk bijna 8-, 12- en 300-voudige bereikten in vergelijking met controle-niet-geïnduceerde cellen (NKX6.1: D3: 1,94 ± 0,86, Definitief: 7,97 ± 1,34, p<0,05; MafA: D3: 6.59 ± 0.4, Finale: 11.54 ± 2.40, p < 0.05; en Ins1: D3: 27,29 ± 20,27, Finale: 318,20 ± 76,09, p < 0,05) (Figuur 5C-E). Dit geeft aan dat deze Ad-MSC's kunnen differentiëren in IPC's die β-cel markers uitdrukken.
Ten slotte werden deze cellen beoordeeld op de afscheiding van insuline wanneer ze werden uitgedaagd met toenemende concentraties glucose. Zoals te zien is in figuur 5F, was de insuline die werd uitgescheiden in het supernatant van de geïnduceerde IPC's bij uitgedaagd met 20 mM glucose significant hoger dan die uitgescheiden wanneer de cellen werden uitgedaagd met 2 mM glucose (HG: 390 pg / ml ± 33 pg / ml; LG: 234 pg/ml ± 32 pg/ml, p < 0,05; Figuur 5F)
Deze gegevens bevestigden dat het gebruikte protocol erin slaagde om de Ad-MSC's te differentiëren in IPC's, wat genetisch en functioneel werd bevestigd.
Figuur 1: Een schematische presentatie van de stappen van het protocol dat wordt gebruikt voor de isolatie en karakterisering van Ad-MSC's. Gegenereerd door Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fotomicrografieën met de geïsoleerde Ad-MSC's. (A) Geïsoleerde cellen met plastic-adherente, fibroblastachtige morfologie beginnen de dag na isolatie te verschijnen. (B) Na verloop van tijd prolifereren deze aanhangende Ad-MSC's (met fibroblastachtige morfologie) zich en nemen ze toe in aantal, waardoor een meer homogene fibroblastachtige populatie wordt bereikt in (C) P1 en (D) P3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van Ad-MSC's. (A) Flowcytometrische analyse van Ad-MSC's laat zien dat deze cellen bijna negatief zijn voor CD34 (bovenste paneel), terwijl de meerderheid van de cellen CD90 en CD105 (onderste paneel) tot expressie brengt. Ad-MSC's kunnen differentiëren in de drie mesenchymale afstammingslijnen, namelijk (B) adipocyten (waarbij oliedruppels worden gekleurd door olierood), (C) osteocyten, gekleurd door alizarinerood, en (D) chondrocyten, gekleurd door Alcian Blue (in vergelijking met controle-niet-geïnduceerde cellen). Controle: niet-geïnduceerde cellen, Diff: gedifferentieerde cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Differentiatie van Ad-MSC's in IPC's. (A) Schematische presentatie van het differentiatieprotocol dat wordt gebruikt om IPC's te genereren uit Ad-MSC's, samen met fotomicrografieën voor de cellen in elke fase tijdens de inductie van differentiatie naar IPC's. Bij differentiatie verliezen cellen hun fibroblastische morfologie en hebben ze de neiging om clusters te aggregeren, die de neiging hebben om los te komen en te groeien in suspensiemedia. (B) Fotomicrografieën tonen controle Ad-MSC's en IPC's gegenereerd door het bovenstaande protocol met ronde clustermorfologische veranderingen (rechterpaneel) in vergelijking met de fibroblastachtige morfologie van de niet-geïnduceerde Ad-MSC's (linkerpaneel), hetzij onbevlekt (bovenste paneel) of DTZ gekleurd (onderste paneel).
Controle: niet-geïnduceerde cellen; IPC's: insulineproducerende cellen; NA: nicotinamide; β-ME: bèta-mercaptoethanol; D3: Geïnduceerde cellen op dag 3 tijdens de inductie van differentiatie naar IPC's; D10: definitieve gedifferentieerde IPC's aan het einde van het inductieprotocol; Ex-4: exendin-4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Relatieve expressieniveaus van β-celmarkers en GSIS voor IPC's. Relatieve expressieniveaus door qRT-PCR voor (A) FOXA2, (B) Pdx-1, (C) NKX6.1, (D) MafA en (E) Ins-1. (F) Niveaus van uitgescheiden insuline in het supernatant bij het uitdagen van de gegenereerde IPC's met 2mM glucose (LG) of 20mM glucose (HG). Controle: niet-geïnduceerde Ad-MSC's, Dag-3: gedifferentieerde cellen verzameld bij D3; Ten slotte: definitieve gedifferentieerde IPC's; LG: lage glucose; HG: hoge glucose. a: het gemiddelde verschilt van de controle op p < 0,05; b: het gemiddelde verschilt van dag-3 bij p < 0,05; *: het gemiddelde van LG verschilt van HG bij p < 0,05; de vergelijking werd gedaan met behulp van een onafhankelijke monsters t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol zijn we erin geslaagd om een gedetailleerd protocol te presenteren voor de isolatie van Ad-MSC's van rattenepidemaal vet en de differentiatie van deze Ad-MSC's in IPC's. In feite is epidydimaal vet van ratten een gemakkelijk bereikbare bron van vetweefsel voor het verkrijgen van Ad-MSC's en is er geen speciale apparatuur nodig, noch voor verzameling noch voor het verwerken van 15,26,27. De geïsoleerde Ad-MSC's vertoonden een uitstekende cultuuruitbreiding en vertoonden alle criteria die als MSC's moesten worden gedefinieerd. Het gebruikte protocol werd eerder beschreven met kleine wijzigingen15. Dit protocol is bewezen effectief en reproduceerbaar te zijn. De cellen vertoonden fibroblastisch-achtige morfologie vanaf dag 1 na isolatie en bleven zich uitbreiden totdat ze een homogene populatie bereikten. Interessant is dat we hetzelfde protocol gebruikten om menselijke Ad-MSC's te isoleren van lipo-aspiraat met vergelijkbaar succes als rattenweefsel (gegevens niet getoond). De enige beperking van dit proces is de chemische vertering met behulp van collagenase wanneer deze naast mechanische vertering in andere protocollen wordt geplaatst28. Deze stap is ook een kritische maatregel, omdat de chemische vertering van de cellen hun levensvatbaarheid nadelig kan beïnvloeden29,30. Anders biedt dit protocol een goed begin voor elke onderzoeker die zou overwegen een Ad-MSC-onderzoekslijn in hun laboratorium te lanceren.
Het gebruik van MSC's bij de behandeling van diabetes heeft nieuwe wegen geopend en nieuwe hoop gegeven voor de behandeling van diabetes. Het genereren van volledig volwassen IPC's uit MSC's is echter nog steeds een kwestie van debat en uitdaging31. Momenteel zijn er verschillende protocollen voor het induceren van de differentiatie van MSC's naar IPC's in de literatuur. Deze protocollen maken gebruik van een overvloed aan chemische verbindingen en groeifactoren voor verschillende perioden 20,32,33. Deze factoren zijn voornamelijk afhankelijk van het MSC-type en de bron om te beginnen met34,35. Niettemin is het verkrijgen van volwassen functionele IPC's van MSC's nog steeds een kwestie van debat en onderzoek op het gebied20.
In het gepresenteerde protocol bieden we een korte, relatief eenvoudige, efficiënte manier om functionele IPC's van Ad-MSC's te verkrijgen. De resulterende cellen vertoonden duidelijke morfologische veranderingen met positieve DTZ-kleuring, drukten de meeste β-celmarkers tot expressie en vertoonden verhoogde insulinesecretie als reactie op verhoogde glucoseconcentratie-uitdaging. Al dit bewijs bevestigt de efficiëntie van dit protocol als een β-cel inductieprotocol van Ad-MSC's. We gebruikten dit protocol in een ander type MSC's, namelijk menselijke Wharton's jelly MSCs (WJ-MSC's), afgeleid van de navelstreng, en het vertoonde eigenlijk vergelijkbare resultaten21,36. Deze resultaten rechtvaardigen het uitproberen van ons protocol op andere typen en bronnen van MSC's, waardoor de procedure een universeel protocol wordt voor het genereren van IPC's uit MSC's. Het is opmerkelijk om het belang te benadrukken van het induceren van de cellen bij vroege passages, meestal tussen P3-P5, omdat late passages de eigenschappen en differentiatiemogelijkheden van de cellen nadelig beïnvloeden17,24.
Zoals eerder vermeld, is het bereiken van volledig volwassen β-cellen van MSC's een kwestie van debat en verre van volledige opheldering. Dergelijke protocollen zoals die hier worden beschreven, bieden echter een eenvoudig, snel middel om de onderliggende mechanismen van de differentiatie van Ad-MSC's, of zelfs andere soorten MSC's, in IPC's beter te begrijpen. Het vermogen van de toegevoegde verbindingen voor de inductie van de Ad-MSC's om specifieke β-celmarkers tot expressie te brengen, biedt een nuttig hulpmiddel om de genetische en epigenetische factoren te bestuderen die de differentiatie van MSC's in IPC's bepalen. Bovendien stelt het snelle, eenvoudige protocol onderzoekers in staat om andere intrinsieke factoren te bestuderen die de uitkomst van een dergelijke differentiatie kunnen verbeteren. Deze factoren kunnen een adjuvante therapie met stamcellen vertegenwoordigen of zelfs een therapeutische modaliteit voor diabetes bieden. In ons laboratorium gebruikten we een vergelijkbare aanpak om te bewijzen dat obestatine, een darmhormoon, een nieuwe potentiële factor kan zijn voor het genereren van IPC's uit WJ-MSCs37.
Het is ook vermeldenswaard dat het huidige protocol twee belangrijke beperkingen heeft. Ten eerste, zoals eerder vermeld, gebruikten we chemische vertering door collagenase, wat de levensvatbaarheid van de cellen nadelig kan beïnvloeden29,30. Ten tweede hebben we het differentiatieproces in vitro gebruikt en de verwachte verdere rijping en differentiatieverbetering van de gegenereerde IPC's in vivo niet onderzocht. Het is belangrijk erop te wijzen dat de transplantatie van in vitro-gedifferentieerde MSC's in IPC's een diepgaande inductie van de expressie van verschillende β-celmarkers liet zien. Deze toename bereikte ongeveer 100 keer 12-18 maanden na transplantatie in vivo38. Toekomstige studies om de in vivo rijping van gegenereerde IPC's door dit eenvoudige protocol verder te onderzoeken, zullen dus van goede waarde zijn.
Tot slot hebben we een gedetailleerd protocol verstrekt voor de isolatie en karakterisering van Ad-MSC's, gevolgd door een relatief eenvoudig, snel en efficiënt protocol voor het genereren van IPC's van Ad-MSC's. Deze protocollen bieden niet alleen een efficiënt hulpmiddel om een stamceltherapielijn van onderzoek te initiëren, maar kunnen ook helpen bij het ontwikkelen van het steeds groeiende veld van MSC-celtherapie voor diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle co-auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben die verband houdt met dit werk.
Acknowledgments
We erkennen Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Dierenarts Specialist, Faculteit Farmacie, De Britse Universiteit van Egypte (BUE) voor het helpen met de dissectie van de ratten.
We willen ook de inspanningen van de Faculteit massacommunicatie, de Britse Universiteit in Egypte (BUE) voor de productie en bewerking van de video van dit manuscript erkennen en waarderen.
We willen graag Miss Fatma Masoud, MSc, Assistant Lecturer of English, The British University in Egypt (BUE) bedanken voor de revisie en het proeflezen in de Engelse taal van het manuscript.
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door het Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculteit Farmacie, De Britse Universiteit in Egypte (BUE), Caïro, Egypte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM - High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM - Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
References
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. Haider, K. H. , Springer. Singapore. 1-28 (2022).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
- Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
- Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
- Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
- Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
- Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
- Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
- Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
- Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
- Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
- Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
- Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
- Krishnamurthy, H., Cram, L. S.
- Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
- Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
- Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
- Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
- Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
- Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
- El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
- El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
- Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).
