Summary
Fedtvævsafledte mesenkymale stamceller (Ad-MSC'er) kan være en potentiel kilde til MSC'er, der differentierer sig til insulinproducerende celler (IPC'er). I denne protokol giver vi detaljerede trin til isolering og karakterisering af rotte epididymal Ad-MSC'er efterfulgt af en enkel, kort protokol til generering af IPC'er fra de samme rotte-AD-MSC'er.
Abstract
Mesenkymale stamceller (MSC'er) - især dem, der er isoleret fra fedtvæv (Ad-MSC'er) - har fået særlig opmærksomhed som en vedvarende, rigelig kilde til stamceller, der ikke giver anledning til etiske bekymringer. Imidlertid er de nuværende metoder til at isolere Ad-MSC'er ikke standardiserede og anvender komplicerede protokoller, der kræver specielt udstyr. Vi isolerede Ad-MSC'er fra det epididymale fedt fra Sprague-Dawley-rotter ved hjælp af en enkel, reproducerbar metode. De isolerede Ad-MSC'er vises normalt inden for 3 dage efter isolering, da vedhængende celler viser fibroblastisk morfologi. Disse celler når 80% sammenløb inden for 1 uge efter isolation. Derefter blev der ved passage 3-5 (P3-5) udført en fuld karakterisering for de isolerede Ad-MSC'er ved immunophenotypning for karakteristisk MSC-klynge af differentieringsoverflademarkører (CD90, CD73 og CD105) samt inducering af differentiering af disse celler ned ad de osteogene, adipogene og kondrogogene afstamninger. Dette indebærer igen multipotensen af de isolerede celler. Desuden inducerede vi differentieringen af de isolerede Ad-MSC'er mod de insulinproducerende celler (IPC'er) afstamning via en simpel, relativt kort protokol ved at inkorporere Højglukose Dulbeccos modificerede Eagle-medium (HG-DMEM), β-mercaptoethanol, nicotinamid og exendin-4. IPC'ers differentiering blev genetisk vurderet, for det første ved at måle ekspressionsniveauer for specifikke β-cellemarkører såsom MafA, NKX6.1, Pdx-1 og Ins1 samt dithizonefarvning for de genererede IPC'er. For det andet blev vurderingen også udført funktionelt ved et glukosestimuleret insulinsekretionsassay (GSIS). Afslutningsvis kan Ad-MSC'er let isoleres og udviser alle MSC-karakteriseringskriterier, og de kan faktisk give en rigelig, vedvarende kilde til IPC'er i laboratoriet til diabetesforskning.
Introduction
Mesenkymale stamceller (MSC'er), også kendt som mesenkymale stromale celler, er blandt de mest anvendte celletyper til regenerativ medicin 1,2. De er klassificeret som voksne stamceller og karakteriseret ved multilineage differentieringspotentiale og selvfornyelseskapacitet3. MSC'er kan isoleres og fås fra forskellige kilder, herunder fedtvæv, knoglemarv, perifert blod, navlesnorsvæv og blod, hårsække og tænder 4,5.
Isoleringen af stamceller fra fedtvæv ses som både tiltalende og lovende på grund af deres lette adgang, hurtige ekspansion in vitro og høje udbytte6. Fedtvævsafledte mesenkymale stamceller (Ad-MSC'er) kan isoleres fra forskellige arter såsom mennesker, kvæg, mus, rotter og for nylig geder7. Det er bevist, at ad-MSC'er nu er potentielle kandidater til vævsteknik og gen-/celleterapi, som endda kan bruges til at udvikle et autologt alternativ til langsigtet reparation af bløddelsskader eller -defekter 7,8.
International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) har defineret tre minimumskriterier, der skal udvises af MSC'er for fuld karakterisering9. For det første skal de være plastiske tilhængere. For det andet bør MSC'er udtrykke mesenkymale stamcelleoverflademarkører såsom CD73, CD90 og CD105 og manglende ekspression af de hæmatopoietiske markører CD45, CD34, CD14 eller CD11b, CD79α eller CD19 og HLA-DR. Endelig bør MSC'er udvise evnen til at differentiere sig i de tre mesenkymale afstamninger: adipocytter, osteocytter og kondrocytter. Interessant nok kan MSC'er også differentiere sig til andre slægter såsom neuronale celler, kardiomyocytter, hepatocytter og epitelceller10,11.
Faktisk har MSC'er unikke egenskaber, der gør det muligt at anvende dem som potentielle terapeutiske midler i regenerativ terapi til forskellige sygdomme. MSC'er kan udskille opløselige faktorer for at inducere et immunmodulerende miljø, der giver terapeutiske fordele12. Derudover kan MSC'er migrere mod skadesteder og tumormikromiljøer for at levere målrettet terapi; Mekanismerne er dog ikke fuldt belyst13. Derudover har MSC'er evnen til at udskille exosomer, ekstracellulære vesikler i nanoskalaen, der bærer en last af ikke-kodende RNA'er, protein og opløselige faktorer, som for nylig opstod som en ny mekanisme for MSC'ernes terapeutiske potentiale i forskellige sygdomme14.
Endnu vigtigere har MSC'er skabt markant opmærksomhed for deres potentiale til at differentiere sig til insulinproducerende celler (IPC'er), enten ved genetisk modifikation15,16 eller ved at udnytte forskellige ekstrinsisk inducerende faktorer inden for kulturmediet in vitro17. IPC-induktionsperioden varierer meget, da det afhænger af den anvendte induktionsprotokol og de anvendte ydre faktorer. Differentieringsprocessen kan vare fra dage til måneder, og det kræver en kombination af eksogene inducerende faktorer, der skal tilføjes og / eller trækkes tilbage i forskellige faser. Mange af disse faktorer, der er blevet anvendt til endokrin bugspytkirteldifferentiering, er biologisk aktive forbindelser, der har vist sig at fremme proliferation eller differentiering / neogenese af insulinudskillende β-celler og / eller øge insulinindholdet i IPC'er 18,19,20,21. Det er her bemærkelsesværdigt, at MSC'er også er blevet rapporteret at have terapeutiske virkninger i diabetes og dets komplikationer via flere mekanismer, herunder deres sekretom, samt en bred vifte af immunmodulerende handlinger 22,23,24.
I denne protokol præsenterer vi en detaljeret trinvis protokol til isolering og karakterisering af Ad-MSC'er fra rotte epididymalt fedt efterfulgt af en simpel, relativt kort protokol til generering af IPC'er fra Ad-MSC'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført i henhold til de godkendte retningslinjer, og alle procedurer blev godkendt af det etiske udvalg for det farmaceutiske fakultet, Det Britiske Universitet i Egypten (BUE), Kairo, Egypten. Ad-MSC-isolationsprotokollen blev vedtaget af Lopez og Spencer med modifikationer15.
1. Isolering af Ad-MSC'er fra rotte epididymale fedtpuder
- Brug han Sprague-Dawley rotter, der vejer 250-300 g, der ikke er mere end 1 måned (to pr. Isolation). Bedøv dyrene, og afliv dem derefter ved cervikal dislokation. Sprøjt det aflivede dyr med 70% ethanol. Skær huden og musklen i den nederste del af maven, og træk derefter de to testikler ud for at udsætte de epididymale fedtpuder.
- Skær forsigtigt de epididymale fedtpuder og pas på ikke at skære blodkarrene.
- Isoler fedtvævet omkring epididymis, og læg det derefter i en petriskål indeholdende fosfatbufferet saltvand (PBS).
- Skær disse fedtpuder i små stykker ved hjælp af pincet og skalpel i biosikkerhedsskabet. Disse stykker afskåret fedtvæv overføres til et 50 ml centrifugerør indeholdende 10 ml steril PBS.
- Det hakkede fedtvæv vaskes 5 gange med 10 ml PBS hver gang for at fjerne det forurenende blod. Følgende vaskeprocedurer skal udføres omhyggeligt.
- Der tilsættes 10 ml PBS til vævet og blandes grundigt i 45 s. Lad derefter vævet sætte sig via tyngdekraften ved at holde røret stående i 5 minutter for at adskille i to lag.
- Opsuge PBS fra infranatanten med en 10 ml sprøjte, og den udskiftes med frisk 10 ml PBS til endnu en vask.
- Gentag dette vasketrin 4-5 gange, indtil PBS er fri for blod. Dette indikerer, at det meste, hvis ikke alt, af blodet fjernes.
- Efter vask resuspenderes fedtvævet i 10 ml collagenaseopløsning (0,1% collagenase type 1 i PBS). Forsegl røret tæt med parafilm, og inkuber det derefter i et rystende vandbad (37 °C, 80 o / min, i 45 minutter), indtil vævet er næsten homogent.
BEMÆRK: Undgå fuldstændig fordøjelse af vævet (når opløsningen bliver fuldstændig homogen med fuldstændig forsvinden af alle vævsrester / stykker), fordi det påvirker dyrkningen af celler negativt bagefter. Normalt tager fordøjelsen 30-45 min. - Når collagenasefordøjelsen er færdig, hvirvel røret i 15 s, og centrifuger derefter i 5 minutter ved 300 x g. Vortex røret igen i 10 s, efterfulgt af yderligere 5 minutters centrifugering. Tre lag vil derefter blive observeret. Kassér forsigtigt olielaget efterfulgt af det vandige lag uden at forstyrre den stromale vaskulære fraktion (SVF) pellet.
BEMÆRK: Fjern supernatanten indeholdende adipocytter og collagenaseopløsningen. Fjern først adipocytterne og det ledsagende olielag med en 10 ml pipette for at sikre fuldstændig fjernelse af oliedråberne, og fjern derefter det nedenunder vandige lag. - SVF-pelleten i bunden af røret resuspenderes i 10 ml steril BSA-opløsning (1 % albumin, fraktion V-opløsning af kvæg i PBS), og centrifuger derefter røret i 5 minutter ved 300 x g.
- Efter centrifugering kasseres supernatanten, og SVF-pelleten suspenderes i 8,5 ml komplette medier til Ad-MSC'er (sammensat af Dulbeccos modificerede Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 [DMEM/F12]-medier suppleret med 10 % FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0,25 μg/ml amphotericin B og 2 mM L-glutamin).
- Cellerne dyrkes i en 25 cm2 kolbe ved 37 °C under 5 % CO2. Den følgende dag skal du kontrollere de vedhæftede celler, fjerne de suspenderede celler og udskifte mediet. Bagefter skal du skifte medie hver anden dag.
- Passage cellerne hver 5-7 dage, når de er 80% -90% sammenløbende ved hjælp af Trypsin-EDTA. Brug celler mellem passager 3-5 til de efterfølgende eksperimenter, der er beskrevet i denne protokol. En skematisk præsentation af alle isolationstrinnene findes i figur 1.
BEMÆRK: Normalt kan Trypisn-EDTA-styrken variere mellem forskellige leverandører, så prøv at minimere tidspunktet for trypsinisering for at undgå toksiske virkninger på cellerne.
2. Karakterisering af ad-MSC'er ved immunophenotyping ved hjælp af flowcytometrianalyser
- Ved passage 3 opdeles cellerne ved hjælp af Trypsin-EDTA. Vask med PBS 2 gange, og tæl derefter cellerne med et hæmocytometer.
- Inkuber 100.000 celler ved 4 °C i mørke i 20 minutter med enten muse-anti-rotte CD90 eller CD105 (mesenkymale markører) eller CD34 (hæmatopoietisk markør) monoklonalt antistof mærket med fluorescein-isothiocyanat (FITC).
- Vask cellerne og suspender dem i 500 μL FACS-buffer. Analyser ved flowcytometri25.
3. Vurdering af differentieringspotentialet for isolerede ad-MSC'er i forskellige mesenkymale slægter
- Adipogen differentiering
- Resuspender cellerne i komplette medier (som beskrevet i trin 1.9.), og derefter dyrkes cellerne med en tæthed på 3,7 x 104 celler / brønd i en 24-brønd vævskulturplade. Der inkuberes ved 37 °C i en befugtet atmosfære på 5 % CO2. Skift derefter mediet hver 3. dag, indtil cellerne når næsten 100% sammenløb, hvilket normalt tager 3 dage.
- Når cellerne når den ønskede sammenløb, skal du erstatte proliferationsmediet med det adipogene differentieringsmedie (bestående af LG-DMEM-medier suppleret med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amfotericin B og 2 mM L-glutamin med 1x adipogent supplement, leveret med Mesenchymal Stem Cells Functional Identification Kit) for at inducere adipogenese. Skift derefter medie hver 3. dag (0,5 ml / brønd). Pas på at udføre medieudskiftningen forsigtigt for ikke at forstyrre lipidvakuolerne.
- Efter 21 dage vurderes den adipogene differentiering ved mikroskopisk undersøgelse af lipidvakuolernes udseende og ved olierød farvning.
- Forbered en stamopløsning af Oil Red ved at opløse 30 mg olierød plet i 10 ml isopropanol, og opbevar den derefter i mindst 20 minutter ved stuetemperatur. Forbered derefter en arbejdsløsning ved at blande 3 dele stamopløsning med 2 dele dobbeltdestilleret vand (ddH2O), bland dem godt og opbevar det i 10 minutter ved stuetemperatur, og filtrer derefter med filterpapir.
- For at dokumentere den adipogene differentiering skal cellerne vaskes 2 gange med PBS og derefter fastgøres med neutralt bufferet formalin 10% (0,75 ml/brønd) i 15 min. Derefter vaskes cellerne 2 gange med PBS med 1 ml/brønd og inkuberes cellerne i 5 min hver gang. Det er vigtigt at opsuge PBS fuldstændigt, før du tilføjer Oil Red-arbejdsløsningen.
- Efter den sidste vask tilsættes oil red-arbejdsløsningen til cellerne og inkuberes i 60 minutter ved 37 °C. Fjern derefter pletopløsningen og vask forsigtigt cellerne 2 gange med PBS. Overhold de farvede lipiddråber under mikroskopet.
- Osteogen differentiering
- Frø 7,4 x 103 celler/brønd (0,5 ml medium/brønd) i en 24-brøndplade og inkuber dem ved 37 °C i en befugtet atmosfære på 5% CO2 i komplette medier (som beskrevet i trin 1.9.) i 3 dage for at nå næsten 70% sammenløb.
- Inducer cellerne med det osteoogene supplement (forsynet med sættet) i LG-DMEM-medier suppleret med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amphotericin B og 2 mM L-glutamin.
- Fortsæt den osteoogene induktion i 21 dage, skift differentieringsmediet hver 3. dag.
- Forbered en arbejdsløsning af Alizarin Red S-plet ved at opløse 200 mg Alizarin Red S-plet i 9 ml ddH2O, og juster derefter pH til 4,1-4,3 ved anvendelse af ammoniumhydroxid og HCI. Derefter fyldes lydstyrken til 10 ml med ddH2O. Herefter fjernes eventuelle bundfald ved filtrering ved hjælp af filterpapir.
- Cellerne vaskes 2 gange med PBS, og fix dem derefter med 10% bufferet formalin (0,75 ml/brønd) i 15 min. Vask derefter cellerne 2 gange med PBS (1 ml/brønd). Hver gang inkuberes cellerne i 5 min.
- De faste celler inkuberes med den fremstillede 2% Alizarin-Red S-opløsning i 30 minutter i en 37 °C inkubator.
- Derefter fjernes pletopløsningen, cellerne vaskes 2 gange med ddH2O og en gang med PBS, og observer derefter den farvede calciumrige ekstracellulære matrix for at vurdere osteogen differentiering under mikroskopet.
- Kondrogen differentiering
- Frø 7,4 x 103 celler /brønd (0,5 ml medium / brønd) i en 24-brøndplade og inkuber disse ved 37 ° C i en befugtet atmosfære på 5% CO2 i komplette medier (som beskrevet i trin 1.9.) i 3 dage for at nå næsten 70% sammenløb.
- Når den ønskede sammenløb er nået, induceres den kondrogeniske differentiering af cellerne med serumfri DMEM / F12 indeholdende insulin-transferrin selen (ITS), kondrogen supplement (forsynet med sættet), 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amfotericin B og 2 mM L-glutamin21.
- Inkuber cellerne med det kondrogeniske medium i 21 dage, mens du ændrer det kondrogeniske differentieringsmedie hver 3. dag.
- Forbered en arbejdsløsning af Alcian Blue 8GX-plet som følger: Forbered først en 3% iseddikeopløsning i ddH2O ved at tilsætte 3 ml iseddike til 97 ml ddH2O. Forbered derefter en arbejdsløsning af Alcian Blue 8GX-plet ved at blande 0,1 g i 100 ml 3% issyreopløsning, og fjern eventuelle bundfald ved filtrering ved hjælp af filterpapir.
- Cellerne vaskes 2 gange med PBS, og fix dem derefter med 10% bufferet formalin (0,75 ml/brønd) i 15 min. Vask derefter cellerne 2 gange med PBS (1 ml/brønd). Hver gang inkuberes cellerne i 5 min.
- Det næste trin er at inkubere cellerne i den fremstillede 0,1% Alcian Blue 8GX plet i 3% iseddike i 60 minutter ved 37 °C. De farvede celler vaskes 2 gange med ddH2O og en gang med PBS, og de farvede sulfaterede proteoglycaner under mikroskopet observeres.
4. Differentiering af ad-MSC'er i IPC'er
- Ved passage 3 skal du opdele ad-MSC'erne ved hjælp af Trypsin- EDTA. Fjern først mediet, og vask derefter cellerne, mens de stadig er fastgjort i kulturkolben med 5 ml PBS. Derefter tilsættes 5 ml Trypsin-EDTA til 75 cm2 kolben og inkuberes ved 37 °C i 3-10 min.
BEMÆRK: Prøv at inducere cellerne ved tidlige passager, normalt mellem P3-P5, da sene passager påvirker cellernes egenskaber og differentieringsevner negativt17,24. - Derefter inspiceres cellerne for løsrivelse og for at være en enkeltcelle suspension. Der tilsættes 5 ml komplet DMEM/F12-medie til kolben for at hæmme trypsinvirkningen. Saml celleophænget og overfør det til et 15 ml rør, og tilsæt derefter yderligere 5 ml komplet DMEM / F12-medie til røret.
- Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 2 minutter for at pelletere cellerne.
- Cellerne vaskes én gang med PBS, centrifugeres igen ved 300 x g i 2 min, og cellepillen gentilføjes i 3-5 ml komplette DMEM/F12-medier.
- Tæl cellerne ved hjælp af trypan blå udelukkelse farvestof og et hæmocytometer.
- Derefter frø cellerne i 6-brønds plader (1 x 106 celler / plade) og en 12-brønds plade (til GSIS-assay; 1 x 106 celler / plade) og inkuberes i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator i komplette medier (som beskrevet i trin 1.9.) i 3 dage for at nå næsten 90% sammenløb.
- På induktionsdagen skal du fjerne mediet, vaske cellerne med PBS og derefter inducere cellerne i 2 dage ved hjælp af præinduktionsmedier (DMEM / F12 suppleret med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amfotericin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM nicotinamid [NA] og 1mM β-mercaptoethanol [β-ME]).
- Inducer cellerne i yderligere 1 dag ved hjælp af DMEM med høj glucose (HG-DMEM, 4,5 g / L glucose) suppleret med 2,5% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amfotericin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM NA og 1mM β-mercaptoethanol. Saml cellepiller i slutningen af dette trin (betegnet D3-celler i denne protokol).
- Cellerne inkuberes i yderligere 7 dage i det endelige differentieringsindukationsmedie sammensat af HG-DMEM suppleret med 2,5% FBS, 100 U/ ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amphotericin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM NA, 1mM β-mercaptoethanol og 10 nM exendin-4.
- Ved udgangen af den angivne periode skal du indsamle cellepiller (navngivet Final i denne protokol) og vurdere den vellykkede differentiering af cellerne ved DTZ-farvning og GSIS-assay som følger i denne protokol.
- Vurder de genererede IPC'er ved at følge trin 5 og 6 nedenfor.
5. Dithizone farvning
- Der fremstilles en pletopløsning af dithizon (DTZ) som følger: Opløsningen af 25 mg DTZ opløses fuldstændigt i 2,5 ml dimethylsulfoxid (DMSO), opdeles i alikvoter, og der opbevares ved -20 °C i mørke indtil brug.
- Til farvning fremstilles en arbejdsløsning 1:100 (volumen/ volumen) ved fortynding af stamopløsningen i komplet kulturmedium (HG-DMEM suppleret med 5% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amfotericin B og 2 mM L-glutamin). Derefter filtreres arbejdsløsningen gennem et 0,2 μm sprøjtefilter.
- Dernæst for de specificerede DTZ-farvningskulturceller i en 6-brønds plade og efter opsugning af kulturmediet vaskes cellerne en gang med PBS, og der tilsættes derefter 2 ml DTZ-arbejdsløsning i hver brønd. Der inkuberes i mindst 2 timer ved 37 °C i CO2 - inkubatoren.
- Vask forsigtigt cellerne 2 gange med PBS. Efter den sidste vask tilsættes 2 ml PBS i hver brønd. Observer derefter de crimson rødfarvede IPC'er under et omvendt mikroskop. Brug ikke-inducerede ad-MSC'er, der oprindeligt blev dyrket i komplet vækstmedium (10% FBS - DMEM / F12) som en kontrol.
6. Genekspression af β-cellemarkører ved RT-qPCR
- RNA-ekstraktion
- Efter differentiering opsamles cellepillerne og opbevares ved -80 °C indtil brug. Suspendere hver cellepellet (afledt af de seks brønde i en 6-brønds plade samlet) i 1 ml guanidiumthiocyanat RNA-ekstraktionsreagens i et 1,5 ml nukleasefrit rør sammen med pipettering op og ned flere gange. Inkuber de lysede prøver ved stuetemperatur i 5 minutter for at muliggøre fuldstændig dissociation af nukleoproteinkomplekserne.
- Der tilsættes 200 μL chloroform pr. 1 ml RNA-ekstraktionsreagens, og rørene skal rystes kraftigt i hånden i 15 s. Derefter inkuberes i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Prøverne centrifugeres ved 13.800 x g i 15 minutter ved 4 °C. Dette vil føre til blandingsadskillelse i en nedre chloroformfase, en interfase og en farveløs øvre vandig fase, hvor RNA'et forbliver i den vandige fase.
- Placer den øverste vandige fase i et nyt rør, mens du omhyggeligt undgår at røre ved interfasen.
- Der tilsættes 600 μL 100% isopropanol til den vandige fase (1:1 volumen), blandes derefter prøverne grundigt ved inversion 25 gange, og der inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Prøverne centrifugeres ved 18.800 x g i 30 minutter ved 4 °C. Det udfældede RNA danner en lille gellignende pille på rørsiden.
- Fjern supernatanten og vask pellets med 1 ml 80% iskold ethanol. Efter tilsætning af ethanolen udføres langsomt flere pipetter af RNA-pelleten i 10 s.
- Prøverne centrifugeres i 5 minutter ved 9.600 x g ved 4 °C. Kassér supernatanten, og lad RNA-pillerne lufttørre i 5-10 minutter.
- Efter tørring opløses RNA-pellets i 25-100 μL RNasefrit vand (i henhold til den oprindelige pelletstørrelse) ved at pipettere op og ned flere gange indtil fuldstændig opløselighed i 1,5 ml nukleasefrie rør. Undgå overdreven tørring af RNA-pelleten.
BEMÆRK: Normalt bliver pelleten gennemsigtig, når den tørrer. Men når det er klart, skal du straks genbruge det for at undgå overdreven tørhed af pelleten. - Kvantificer RNA ved at bestemme de optiske tætheder (OD) ved 260 nm og 280 nm ved hjælp af nukleasefrit vand som blankt.
- Sørg for, at prøverne har OD260/OD280 = 1,8-2,0.
- cDNA syntese
- Syntetisere cDNA fra det isolerede totale RNA ved hjælp af et cDNA-syntesesæt.
- Udfør cDNA-syntesereaktionen i henhold til producentens anvisninger. I et 200 μL PCR-rør tilsættes et volumen RNA-opløsning indeholdende 0,5 μg total RNA til reaktionsmasterblandingen vist i tabel 1.
- Efter tilsætning af RNA til masterblandingen skal du indtaste blandingen gennem et cykelprogram på 50 ° C i 30 minutter i en cyklus efterfulgt af en inaktiveringscyklus på 95 ° C i 2 minutter ved hjælp af en termisk cyklist.
- CDNA fortyndes med nukleasefrit vand til en slutkoncentration på 2 ng/μL. Opbevares ved -20 °C til efterfølgende RT-qPCR.
- RT-qPCR ved hjælp af SYBR Green Master Mix
- Rt-qPCR-reaktionen udføres for hvert målgen ved hjælp af cDNA-skabelon i henhold til reaktionsblandingen vist i tabel 2. Gør alle foranstaltninger i tre eksemplarer.
- De anvendte primersæt er vist i tabel 3. Udfør alle RT-qPCR-procedurer på is.
- Udfør RT-qPCR-reaktionen ved hjælp af en PCR-maskine i realtid på standardprogramindstillinger. De termiske cyklusbetingelser omfattede indledende denaturering på 95 °C i 10 minutter efterfulgt af 45 denatureringscyklusser (95 °C, 15 s) og kombineret glødning/forlængelse (60 °C, 1 min).
- Bestem Ct-værdierne , og detekter ekspressionsniveauerne i overensstemmelse med 2-ΔΔCt med β-actin som en intern kontrol.
| cDNA syntese master mix | Volumen (μl) |
| 5x cDNA-syntesebuffer | 4 |
| dNTP | 2 |
| RNA-grundbog | 1 |
| Verso enzym mix | 1 |
| RT forstærker | 1 |
| Nuklease Frit vand | Variabel |
| Rna i alt | Variabel |
| Samlet reaktionsvolumen | 20 |
Tabel 1: cDNA-syntese master mix volumener.
| RT-qPCR reaktionsblanding | Volumen (μl) | Endelig koncentration i 10 μL |
| cDNA | 2 | 2 ng/brønd |
| RT-qPCR Fremadgående primer (3 μM) | 1 | 300 nM |
| RT-qPCR Omvendt primer (3 μM) | 1 | 300 nM |
| Nuklease frit vand | 1 | ------- |
| 2x SYBR Grøn master mix | 5 | 1x |
| Samlet reaktionsvolumen | 10 |
Tabel 2: RT-qPCR reaktionsblanding.
| Gen | Fremadgående primer | Omvendt primer |
| Foxa2 | GAGCCGTGAAGATGGAAGG | ATGTTGCCGGAACCACTG |
| Pdx-1 | ATCCACCTCCCGGACCTTTC | CCTCCGGTTCTGCTGCGTAT |
| NKX6,1 | ACACCAGACCCACATTCTCCG | ATCTCGGCTGCGTGCTTCTT |
| Mafa | TTCAGCAAGGAGGAGGTCAT | CCGCCAACTTCTCGTATTTC |
| Ins-1 | CACCTTTGTGGTCCTCACCT | CTCCAGTGCCAAGGTCTGA |
| β-actin | TGGAGAAGATTTGGCACCAC | AACACAGCCTGGATGGCTAC |
Tabel 3: Fremad og omvendt primersekvenser.
7. Glukosestimuleret insulinsekretion
- Fremstilling af Krebs Ringer bicarbonat (KRB) buffer
- Forbered Krebs Ringer bicarbonat (KRB) bufferopløsning med både 2 mM glucose (lav glucose) og 20 mM glucose (høj glucose) koncentrationer til det glucosestimulerede insulinsekretionsassay (GSIS). De komponenter, der anvendes til KRB-bufferpræparatet, er angivet i tabel 4.
- Bufferens pH justeres ved hjælp af 1 N HCI til ca. 7,25-7,35 (dvs. 0,1-0,2 enheder under den ønskede pH 7,4, fordi den kan stige under filtrering).
- Der tilsættes bovint serumalbumin (BSA) frisk i en koncentration på 0,1 % (vægt/volumen).
- Tilsæt glukose bagefter (18 mg for 50 ml KRB for at forberede 2 mM lavglukose KRB-bufferen og 180 mg for 50 ml KRB for at forberede 20 mM krb-bufferen med høj glucose).
- Steriliser de forberedte LG- og HG KRB-buffere ved filtrering gennem et 0,2 μm sprøjtefilter for at være klar til GSIS-analysen.
- GSIS-analyse
- Frø oprindeligt 1 x 105 celler / brønd i en 12-brønd cellekulturplade og inducer disse celler ved hjælp af nøjagtig den samme differentieringsinduktionsprotokol.
- I slutningen af induktionsprotokollen vaskes forsigtigt de genererede IPC'er (i plade) 2 gange med PBS og en gang med LG-KRB.
- Derefter inkuberes IPC'erne med 300 μL LG-KRB/brønd i 1 time, og denne buffer kasseres derefter.
- Derefter inkuberes IPC'erne med 300 μL enten 2 mM (LG) eller 20 mM (HG) KRB buffer i yderligere 1 time. Ved inkubationsperiodens udløb opsamles supernatanten og opbevares ved −80 °C til det efterfølgende udskillede insulinassay ved hjælp af et kommercielt ELISA-kit og efter producentens anvisninger.
BEMÆRK: Prøv at være så skånsom som muligt, mens du aspirerer eller tilføjer PBS- og KRB-bufferen, når du udfører GSIS-analysen.
| Komponent | Koncentration |
| Magnesiumchlorid (vandfri) | 0,0468 g/l |
| Kaliumchlorid | 0,34 g/l |
| Natriumchlorid | 7,00 g/l |
| Natriumphosphat dibasisk (vandfri) | 0,1 g/l |
| Natriumphosphat monobasisk (vandfri) | 0,18 g/l |
| Natriumbicarbonat | 1,26 g/l |
| Calciumchlorid | 0,2997 g/l |
Tabel 4: De komponenter, der anvendes til KRB-bufferpræparatet.
8. Statistisk analyse
- Udtryk alle data som middelværdi ± standardfejl i middelværdien (SEM). Alle sammenligninger blev udført ved hjælp af envejsanalyse af varians (ANOVA) og Tukeys post hoc-test ved hjælp af statistisk software. Resultater med p-værdier **p ≤ 0,01 og *p ≤ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolering og karakterisering af ad-MSC'er
Som vist i figur 2 viste de isolerede celler fra fedtvæv en heterogen population af afrundede og fibroblastlignende celler fra den næste isolationsdag (figur 2A). 4 dage efter isolation begyndte fibroblastcellerne at stige i antal og størrelse og vokse som en homogen population ved passage 1 (figur 2B, C). Disse celler fortsatte med at vokse som plasttilklæbende, fibroblastiske celler som vist indtil passage 3 og opfyldte det første kriterium for MSC-egenskaber (figur 2D). Disse Ad-MSC'er viste meget gode kulturkarakteristika, og denne protokol viste sig at være en relevant, let og relativt hurtig protokol til at isolere Ad-MSC'er fra epididymale fedtpuder.
Det næste skridt var at karakterisere de isolerede Ad-MSC'er. Ifølge ISCT bør MSC'er følge de tre kriterier for plastadhærens, ekspression af mesenkymale cd'er med mangel på hæmatopoietiske markører og evnen til at differentiere sig til adipocytter, osteocytter og kondrocytter. Som vist i figur 3A viste flowcytometrianalysen, at de fleste af disse celler udtrykte CD90 og CD105 (henholdsvis 76,4% og 73,6%). I mellemtiden var de næsten negative for CD34 (0,1%).
Desuden viste de ved induktion af differentiering af disse celler evnen til at differentiere sig til adipocytter, osteocytter og kondrocytter. Som vist i figur 3B (øverste panel) viste adipocytterne olierød farvning af lipidvakuoler sammenlignet med kontrolinducerede celler. Osteocytterne viste karakteristisk Alizarin Rød farvning (figur 3B, midterpanel) sammenlignet med kontrolceller. Endelig viste chondrocytinducerede celler blå farvning af den ekstracellulære matrix sammenlignet med kontrolinducerede celler (figur 3B, bundpanel).
Disse data viser tydeligt, at isolerede celler fra fedtvæv ikke kun udviser gode dyrkningsegenskaber, men også udviser alle de kriterier, der foreslås for MSC'er.
Differentiering af ad-MSC'er i insulinproducerende celler (IPC'er)
Som vist i figur 4A brugte vi en relativt enkel, kort protokol for at differentiere ad-MSC'er til IPC'er. Efter indførelsen af differentiering blev de inducerede IPC'er vurderet på flere måder. De inducerede celler viste markante morfologiske ændringer. Som vist i figur 4B (øverste panel) viste de inducerede celler afrundet, klyngelignende morfologi sammenlignet med den normale fibroblastisk-lignende morfologi af Ad-MSC'er. Interessant nok viste disse klynger ved farvning med dithizon en crimson plet, som er karakteristisk for zinkgranulat af β-celle plet (figur 4B, nederste panel).
Derefter blev de genererede IPC'er genetisk vurderet for ekspressionen af de specifikke β-cellemarkører sammenlignet med de ikke-inducerede kontrolceller. Som vist i figur 5A-E var de inducerede celler i stand til at udtrykke forskellige specifikke β-cellemarkører, hvilket indikerer deres evne til at generere IPC'er. Hvad angår FOXA2 - en endelig endodermmarkør (som vist i figur 5A) - blev den stærkt udtrykt ved D3-differentiering sammenlignet med kontrol, nåede næsten 30 gange og faldt derefter til kun 10 gange af kontrollen i de endelige differentierede celler (D3: 28,37 ± 0,88; Finale: 12.10 ± 1.27; s. < 0,05). Hvad angår Pdx-1 (som betragtes som en tidlig markør for β-celler), blev den forhøjet i både D3 og endelige differentierede celler og nåede næsten 20 gange sammenlignet med kontrolinducerede celler (D3: 22,39 ± 5,14; Finale: 17.13 ± 0.342; p < 0,05; Figur 5B). Med hensyn til de andre β-cellemarkører, nemlig NKX6.1, MafA og insulin-1 (Ins1), viste de alle højde fra D3 til endelig differentiering og nåede henholdsvis næsten 8 gange, 12 gange og 300 gange sammenlignet med kontrolinducerede celler (NKX6.1: D3: 1.94 ± 0.86, Endelig: 7.97 ± 1.34, s<0.05; MafA: D3: 6,59 ± 0,4, Finale: 11,54 ± 2,40, s < 0,05; og Ins1: D3: 27,29 ± 20,27, Endelig: 318,20 ± 76,09, s. < 0,05) (figur 5C-E). Dette indikerer, at disse Ad-MSC'er kan differentiere sig til IPC'er, der udtrykker β-cellemarkører.
Endelig blev disse celler vurderet for udskillelse af insulin, når de blev udfordret med stigende koncentrationer af glukose. Som vist i figur 5F var det insulin, der udskilles i supernatanten af de inducerede IPC'er, når det blev udfordret med 20 mM glucose, signifikant højere end det, der blev udskilt, når cellerne blev udfordret med 2 mM glucose (HG: 390 pg / ml ± 33 pg / ml; LG: 234 pg/ml ± 32 pg/ml, p < 0,05; Figur 5F)
Disse data bekræftede, at den anvendte protokol formåede at differentiere Ad-MSC'erne til IPC'er, hvilket blev genetisk og funktionelt bekræftet.
Figur 1: En skematisk præsentation af trinnene i protokollen, der anvendes til isolering og karakterisering af ad-MSC'er. Genereret af Biorender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fotomikrografer, der viser de isolerede Ad-MSC'er. (A) Isolerede celler, der udviser plasthæk, fibroblastlignende morfologi, begynder at dukke op dagen efter isolering. (B) Over tid spredes disse ad-MSC'er (med fibroblastlignende morfologi) og stiger i antal og når en mere homogen fibroblastlignende population i (C) P1 og (D) P3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Karakterisering af Ad-MSC'er. (A) Flowcytometrisk analyse af Ad-MSC'er viser, at disse celler er næsten negative for CD34 (øverste panel), mens størstedelen af cellerne udtrykker CD90 og CD105 (nederste panel). Ad-MSC'er kan differentiere sig i de tre mesenkymale afstamninger, nemlig (B) adipocytter (hvor oliedråber farves af olierød), (C) osteocytter, farvet af alizarinrød og (D) kondrocytter, farvet af Alcian Blue (sammenlignet med kontrolinducerede celler). Kontrol: ikke-inducerede celler, Diff: differentierede celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Differentiering af ad-MSC'er i IPC'er. (A) Skematisk præsentation af differentieringsprotokollen, der bruges til at generere IPC'er fra Ad-MSC'er, sammen med fotomikrografer for cellerne på hvert trin under induktionen af differentiering mod IPC'er. Ved differentiering mister celler deres fibroblastiske morfologi og har tendens til at aggregere dannende klynger, som har tendens til at løsne sig og vokse i suspensionsmedier. (B) Fotomikrografer viser kontrol Ad-MSC'er og IPC'er genereret af ovenstående protokol, der viser runde klyngemorfologiske ændringer (højre panel) sammenlignet med den fibroblastlignende morfologi af de ikke-inducerede Ad-MSC'er (venstre panel), enten ufarvet (øverste panel) eller DTZ farvet (nederste panel).
Kontrol: ikke-inducerede celler; IPC'er: insulinproducerende celler; NA: nikotinamid; β-ME: beta mercaptoethanol; D3: Inducerede celler på dag 3 under induktion af differentiering mod IPC'er; D10: endelige differentierede IPC'er i slutningen af induktionsprotokollen Eks-4: exendin-4. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Relative ekspressionsniveauer for β-cellemarkører og GSIS for IPC'er. Relative ekspressionsniveauer efter qRT-PCR for (A) FOXA2, (B) Pdx-1, (C) NKX6.1, (D) MafA og (E) Ins-1. (F) Niveauer af udskilt insulin i supernatanten ved udfordring af de genererede IPC'er med 2mM glucose (LG) eller 20mM glucose (HG). Kontrol: ikke-inducerede Ad-MSC'er, Dag-3: differentierede celler indsamlet ved D3; Endelig: endelige differentierede IPC'er; LG: lav glukose; HG: høj glukose. a: middelværdien er forskellig fra kontrol ved p < 0,05; b: middelværdien er forskellig fra dag-3 ved p < 0,05; *: middelværdien af LG er forskellig fra HG ved p < 0,05; sammenligningen blev foretaget ved hjælp af en uafhængig stikprøve t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol lykkedes det os at præsentere en detaljeret protokol for isolering af Ad-MSC'er fra rotte epididymalt fedt og differentieringen af disse Ad-MSC'er til IPC'er. Faktisk er rotteepydydmalt fedt en let opnåelig kilde til fedtvæv til opnåelse af Ad-MSC'er og kræver ikke noget specielt udstyr, hverken til indsamling eller til behandling af 15,26,27. De isolerede Ad-MSC'er viste fremragende kulturudvidelse og udviste alle de kriterier, der skulle defineres som MSC'er. Den anvendte protokol blev tidligere beskrevet med små ændringer15. Denne protokol har vist sig at være effektiv og reproducerbar. Cellerne viste fibroblastisk-lignende morfologi fra dag 1 efter isolation og fortsatte med at ekspandere, indtil de nåede en homogen population. Interessant nok brugte vi den samme protokol til at isolere humane Ad-MSC'er fra lipo-aspirat med sammenlignelig succes med rottevæv (data ikke vist). Den eneste begrænsning af denne proces er den kemiske fordøjelse ved hjælp af collagenase, når den sættes side om side med mekanisk fordøjelse i andre protokoller28. Dette trin repræsenterer også en kritisk foranstaltning, da den kemiske fordøjelse af cellerne kan påvirke deres levedygtighed negativt 29,30. Ellers giver denne protokol en god start for enhver forsker, der ville overveje at lancere en Ad-MSC-forskningslinje i deres laboratorium.
Brugen af MSC'er til behandling af diabetes har åbnet nye veje og givet nye håb til behandling af diabetes. Genereringen af fuldt modne IPC'er fra MSC'er er dog stadig et spørgsmål om debat og udfordring31. I øjeblikket er der flere protokoller til at inducere differentieringen af MSC'er mod IPC'er i litteraturen. Disse protokoller anvender en overflod af kemiske forbindelser og vækstfaktorer i forskellige perioder 20,32,33. Disse faktorer afhænger hovedsageligt af MSC-typen og kilden til at begynde med34,35. Ikke desto mindre er det stadig et spørgsmål om debat og forskning på området20 at opnå modne funktionelle IPC'er fra MSC'er.
I den præsenterede protokol giver vi en kort, relativt enkel og effektiv måde at få funktionelle IPC'er fra Ad-MSC'er. De resulterende celler viste markante morfologiske ændringer med positiv DTZ-farvning, udtrykte de fleste af de β-cellemarkører og viste øget insulinsekretion som reaktion på øget glukosekoncentrationsudfordring. Alt dette bevis bekræfter effektiviteten af denne protokol som en β-celle induktionsprotokol fra Ad-MSC'er. Vi brugte denne protokol i en anden type MSC'er, nemlig human Whartons gelé MSC'er (WJ-MSC'er), afledt af navlestrengen, og den viste faktisk lignende resultater 21,36. Disse resultater berettiger til at prøve vores protokol på andre typer og kilder til MSC'er, hvilket gør proceduren til en universel protokol til generering af IPC'er fra MSC'er. Det er bemærkelsesværdigt at fremhæve vigtigheden af at inducere cellerne ved tidlige passager, normalt mellem P3-P5, da sene passager påvirker cellernes egenskaber og differentieringsevner negativt17,24.
Som tidligere nævnt er det et spørgsmål om debat og langt fra fuldstændig udredning at opnå fuldt modne β celler fra MSC'er. Sådanne protokoller som dem, der er beskrevet her, giver imidlertid et enkelt, hurtigt middel til bedre at forstå de underliggende mekanismer for differentiering af ad-MSC'er eller endda andre typer MSC'er i IPC'er. De tilsatte forbindelsers evne til induktion af Ad-MSC'erne til at udtrykke specifikke β-cellemarkører giver et nyttigt værktøj til at studere de genetiske og epigenetiske faktorer, der styrer differentieringen af MSC'er i IPC'er. Derudover giver den hurtige, enkle protokol forskere mulighed for at studere andre iboende faktorer, der kan forbedre resultatet af en sådan differentiering. Disse faktorer kan repræsentere enten en adjuverende terapi med stamceller eller endda kan give en terapeutisk modalitet for diabetes. I vores laboratorium brugte vi en lignende tilgang til at bevise, at obestatin, et tarmhormon, kan være en ny potentiel faktor for dannelsen af IPC'er fra WJ-MSC'er37.
Det er også værd at nævne, at den nuværende protokol har to hovedbegrænsninger. For det første brugte vi som tidligere nævnt kemisk fordøjelse af collagenase, hvilket kan påvirke cellernes levedygtighednegativt 29,30. For det andet anvendte vi differentieringsprocessen in vitro og undersøgte ikke den forventede yderligere modning og differentieringsforbedring af de genererede IPC'er in vivo. Det er vigtigt at påpege, at transplantationen af in vitro-differentierede MSC'er til IPC'er viste en dybtgående induktion af ekspressionen af forskellige β-cellemarkører. Denne stigning nåede ca. 100 gange 12-18 måneder efter transplantation in vivo38. Således vil fremtidige undersøgelser for yderligere at undersøge in vivo modningen af genererede IPC'er ved denne enkle protokol være af god værdi.
Afslutningsvis leverede vi en detaljeret protokol til isolering og karakterisering af Ad-MSC'er efterfulgt af en relativt enkel, hurtig og effektiv protokol til generering af IPC'er fra Ad-MSC'er. Disse protokoller er ikke kun et effektivt værktøj til at starte en stamcelleterapilinje, men kan også hjælpe med at udvikle det stadigt voksende felt inden for MSC-celleterapi til diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle medforfattere erklærer ingen interessekonflikt forbundet med dette arbejde.
Acknowledgments
Vi anerkender Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Dyrlæge Specialist, Det Farmaceutiske Fakultet, The British University of Egypt (BUE) for at hjælpe med dissektion af rotterne.
Vi vil også gerne anerkende og værdsætte indsatsen fra Fakultetet for Massekommunikation, Det Britiske Universitet i Egypten (BUE) for produktion og redigering af videoen af dette manuskript.
Vi vil gerne takke Fatma Masoud, MSc, assisterende lektor i engelsk, The British University in Egypt (BUE) for revisionen og engelsksproget korrekturlæsning af manuskriptet.
Dette arbejde blev delvist finansieret af Center for Drug Research and Development (CDRD), Det Farmaceutiske Fakultet, Det Britiske Universitet i Egypten (BUE), Kairo, Egypten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM - High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM - Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
References
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. Haider, K. H. , Springer. Singapore. 1-28 (2022).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
- Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
- Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
- Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
- Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
- Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
- Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
- Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
- Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
- Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
- Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
- Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
- Krishnamurthy, H., Cram, L. S.
- Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
- Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
- Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
- Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
- Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
- Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
- El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
- El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
- Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).
