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El campo de la biología estructural se ha convertido en un poderoso sistema de comprensión de la biología a través de los detalles atómicos de las estructuras biomoleculares, enriqueciendo nuestra comprensión de las vías bioquímicas y las bases moleculares de las enfermedades, y ofreciendo una herramienta indispensable para la investigación traslacional.
A lo largo de los años, la biología estructural ha ido mucho más allá de proporcionar estructuras estáticas, para informar también sobre las interacciones moleculares, tanto en solución como en células, examinando escalas de tiempo y dinámicas. Se puede obtener información para explicar procesos en diferentes escalas de tamaño, es decir, desde átomos y moléculas individuales hasta partículas y células de virus completas. Las diferentes tecnologías proporcionan un conjunto sinérgico de enfoques experimentales, incluidos métodos de dispersión basados en rayos X, neutrones o electrones, por ejemplo, cristalografía de rayos X (MX) o dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS); resonancia magnética nuclear (RMN) de estado sólido y solución; y reconstrucción de una sola partícula mediante criomicroscopía electrónica (crio-EM). Métodos como la tomografía crio-EM, la tomografía de rayos X crio-soft y la RMN en células se suman a este arsenal de enfoques para estudiar sistemas macromoleculares, especialmente en relación con otras herramientas de imagen. Junto con métodos biofísicos adicionales que proporcionan información complementaria sobre afinidades y escalas de tiempo de interacción molecular, la biología estructural integrativa ofrece hoy en día un paquete formidable para comprender la vida y desarrollar medicamentos, productos biológicos (anticuerpos, nanocuerpos, vacunas), biomateriales y otros agentes biológicos, como enzimas que se pueden utilizar para degradar el plástico y ayudar al medio ambiente.
Desde el principio, la Comisión Europea (CE) reconoció los beneficios que la investigación en biología estructural tiene para la sociedad, y desde la década de 1980 Europa invirtió fuertemente en abrir equipos costosos de biología estructural de forma gratuita a la comunidad científica en general. Esta democratización del acceso a instalaciones multimillonarias fue una fuerza impulsora y una piedra angular para desarrollar el área de la biología estructural a nivel internacional. Esto colocó a Europa a la vanguardia del campo, lo que permitió un sector industrial fuerte y contribuyó a las economías locales.
La CE atesora una larga e impresionante tradición de acceso y formación de investigadores externos en tecnologías de biología estructural. Tras el exitoso programa iNEXT (Infraestructura para RMN, EM y rayos X para la investigación traslacional) que permitió el acceso gratuito a la biología estructural a instalaciones de alto nivel y a todos los investigadores europeos hasta finales de 2019, el proyecto Horizon2020 iNEXT-Discovery comenzó en febrero de 2020 para otro período de cuatro años de acceso totalmente financiado a infraestructuras de biología estructural. Paralelamente, Instruct-ERIC es un hito del Foro Estratégico Europeo sobre Infraestructuras de Investigación, constituyendo un bastión sostenible en biología estructural para las comunidades científicas europeas e internacionales. Juntos, aspiran a involucrar a los científicos de la vida y a otros en la investigación de la biología estructural, y para ello ofrecen acceso a algunos de los mejores conocimientos, tecnologías e instalaciones de biología estructural del mundo, tanto a investigadores del mundo académico como de la industria. Junto con otros socios, también organizan talleres y formación práctica.
Debido a la pandemia de Covid19, viajar a las instalaciones de investigación de iNEXT-Discovery e Instruct-ERIC se ha visto afectado en gran medida, lo que esencialmente prohíbe las oportunidades de capacitación práctica. Para compensar parcialmente esto, iNEXT-Discovery e Instruct-ERIC organizaron una serie de seminarios web (https://inext-discovery.eu/events/what-can-inext-discovery-do-for-us, https://instruct-eric.eu/content/instructeric-webinar-series-structure-meets-function), así como este número especial de Métodos del Journal of Visualized Experiments. Aquí encontrará descripciones detalladas no solo de varios de nuestros procedimientos de acceso convencionales, sino también de rutinas especializadas que se están desarrollando en el campo de la biología estructural integrativa. Si bien nuestros métodos se describen en detalle en este número, algunos requieren experiencia y equipo que es difícil de establecer localmente. Las instalaciones Instruct-ERIC e iNEXT-Discovery están disponibles para proporcionar estos métodos, incluida la producción de las biomoléculas necesarias para los estudios estructurales, con la ayuda y supervisión de personal local altamente calificado.
Métodos mejorados para determinar estructuras macromoleculares
Durante la última década, la crio-EM se convirtió en una tecnología muy popular para determinar estructuras complejas macromoleculares. El equipo de la Universidad de Leeds (Reino Unido) proporciona una descripción general de todos los pasos involucrados en el análisis EM de una sola partícula, centrándose en las variables que se pueden optimizar durante el flujo de trabajo y la resoluciónde problemas comunes. Con la operación del microscopio en línea por parte de usuarios externos convirtiéndose en estándar, se requieren protocolos para una operación y obtención de imágenes remotas eficientes. Con el análisis de una sola partícula, se obtienen imágenes de muestras vitrificadas para producir películas que muestran partículas en orientaciones aleatorias. Un flujo de trabajo de procesamiento de imágenes identifica los parámetros para reconstruir la muestra en estudio. El software Scipion del CSIC (ES) proporciona todas las herramientas para crear este flujo de trabajo, permitiendo además una trazabilidad sencilla de los resultados2.
La recopilación de datos de difracción de rayos X en muestras cristalinas muy pequeñas ofrece grandes oportunidades de investigación, así como desafíos técnicos. El equipo de Diamond (Reino Unido) presenta el uso de herramientas crio-EM para preparar cientos de microcristales en una sola cuadrícula con un mínimo de líquido circundante en un soporte de bajo ruido, antes de recopilar datos en un entorno de línea de luz dedicado que incluye un vacío en la trayectoria de rayos X antes y después de la muestra3. La recopilación de datos de rayos X en serie en sincrotrones también es clave para estudiar otros sistemas cristalinos difíciles. En otra contribución, Diamond muestra instrucciones paso a paso, figuras y videos para la recopilación de datos utilizando una variedad de sistemas de administración de cristales, a través de una serie de ejemplos4.
Biología estructural integrativa moderna en el descubrimiento de fármacos
La cristalografía de rayos X está bien establecida para el descubrimiento de fármacos basados en fragmentos y ya se usa comúnmente para identificar resultados que se pueden desarrollar sin problemas en candidatos principales. Los equipos de Diamond5, Helmholtz-Zentrum Berlin (DE) y MAX IV (SE)6, y la unidad EMBL Grenoble (FR)7 describen sus últimos desarrollos en la automatización de flujos de trabajo para la cristalización eficiente de objetivos, el remojo de fragmentos, el montaje de cristales, el cribado de fragmentos impulsado por cristalografía y la deposición de estructuras. Sus pipelines están bastante automatizados y están siendo utilizados por investigadores externos de todo el mundo. Se han aplicado a más de 100 objetivos (a menudo de forma remota) para identificar resultados para un mayor diseño de compuestos y desarrollo de plomo asistido por estructura.
La RMN también se usa comúnmente para la detección de fragmentos en campañas de desarrollo de fármacos, dirigidos a proteínas o polinucleótidos, ya sean solubles o unidos a la membrana. La Universidad Goethe de Frankfurt (DE) presenta canales de cribado de RMN optimizados, lo que reduce la intervención manual durante la experimentación y los análisis8. Sus cambiadores de muestras manejan cientos de muestras de RMN en una sola ejecución durante varios días de experimentación ininterrumpida y análisis automatizado.
Además, los métodos biofísicos son complementarios a los rayos X y la RMN. El equipo del Instituto del Cáncer de los Países Bajos (NL) presenta un flujo de trabajo que utiliza calorimetría de barrido nanodiferencial para ensayos de cambio térmico para medir los cambios en la temperatura de fusión objetivo tras la adición de fragmentos9. Los requisitos previos con respecto a la calidad y concentración de proteínas son seguidos por un protocolo analítico para el diseño experimental, la recopilación de datos y el análisis.
Hacia la biología estructural celular
La tomografía crioelectrónica es a menudo el método de elección para observar complejos macromoleculares en las células. Las imágenes de muestras vitrificadas se adquieren en diferentes ángulos de inclinación y se reconstruye un tomograma 3D, del cual se extraen subvolúmenes para dar una mayor resolución mediante el promedio de subtomogramas. Como los electrones interactúan fuertemente con la materia, tales estudios requieren muestras de menos de 200 nm de espesor. El equipo de CEITEC (CZ) presenta un protocolo10 para la preparación de laminillas celulares después de la congelación por inmersión. A pesar de que la automatización en crio-ET ha logrado un progreso impresionante, se requieren horas de recopilación de datos antes de que se lleve a cabo la adquisición de la serie de inclinación, y los objetivos generalmente aún se identifican mediante la inspección visual de la cuadrícula. El EMBL Heidelberg (DE) preparó un protocolo de automatización para mapear cuadrículas y cuadrados de cuadrícula, seleccionar objetivos y configurar la adquisición de series de inclinación11.
Los sincrotrones ALBA (ES) y Diamond discuten juntos las trampas y ventajas de una alternativa a la tomografía crio-EM que permite examinar células intactas, a saber, la tomografía de rayos X crioblanda (cryo-SXT)12. La adaptación de las técnicas de superresolución a las temperaturas criogénicas permite obtener imágenes correlativas con crio-ET y crio-SXT. Además, la microscopía de iluminación crioestructurada de alto rendimiento (crio-SIM) duplica la resolución de la fluorescencia convencional, lo que lleva a la ubicación específica de moléculas o estructuras en muestras gruesas. Esto se puede correlacionar con el crio-SXT para identificar características específicas dentro del contexto celular13.
El equipo de la Universidad de Utrecht (Países Bajos) informa sobre la preparación de muestras y experimentos de RMN de estado sólido de alta sensibilidad que pueden utilizarse para estudiar sistemas fisiológicos desafiantes, incluidas las membranas naturales y los sistemas proteína-lípido-glicano14. Además, la RMN de solución en célula está evolucionando rápidamente para dilucidar los procesos funcionales. El equipo de CERM/CIRMMP (IT) describe cómo ensamblar y operar biorreactores que permiten la reposición de nutrientes y oxígeno para las células vivas dentro de la sonda de RMN en el núcleo de un imán de alto campo15. Esto permite mediciones extendidas y experimentos resueltos en el tiempo, por ejemplo, para monitorear las interacciones proteína-ligando intracelular.
Observaciones finales
Este número de JoVE está dedicado íntegramente a los recientes desarrollos y aplicaciones de la biología estructural en las infraestructuras de investigación europeas. Juntos, iNEXT-Discovery e Instruct-ERIC permiten a los especialistas en biología estructural, pero cada vez más también a los científicos de la vida no especializados y otros investigadores, perseguir sus objetivos de investigación ofreciendo servicios de vanguardia.