Summary
Groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2's), betrokken bij type 2-ontsteking, nemen voornamelijk deel aan de reactie op worminfectie, allergische aandoeningen, metabole homeostase en weefselherstel. In deze studie wordt een procedure aangetoond om ILC2's te isoleren van murine neusslijmvlies en de expressie van CD226 te detecteren.
Abstract
Met overvloedig onderzoek naar groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2s) gepubliceerd door de jaren heen, is algemeen bekend dat ILC2's betrokken zijn bij het reguleren van verschillende pathologische processen, waaronder anti-helminth immuniteit, weefselherstel, thermogenese en auto-immuunziekten zoals astma en allergische rhinitis (AR). ILC2's bevinden zich permanent in perifere weefsels zoals de huid, darmen, longen en neusholte; Er is echter beperkte informatie over hun exacte functies in nasale mucosale immuniteit. CD226 is een activerend kostenimulatoir molecuul, voornamelijk uitgedrukt op natural killer (NK) cellen, T-cellen en inflammatoire monocyten. Of ILC2's CD226 tot expressie brengen of een rol spelen in de pathogenese van ILC2s-gerelateerde ziekten blijft echter onbekend. Hier hebben we een methode vastgesteld om ILC2's uit het neusslijmvlies te isoleren en te identificeren en CD226-expressie gedetecteerd op ILC2's verkregen van gezonde en AR-muizen. Hierin beschrijven we dit protocol voor de isolatie en identificatie van ILC2's uit neusslijmvlies van muizen, dat zal helpen bij het verkennen van het interne pathologische mechanisme van immunologische aandoeningen bij neusslijmvliesaandoeningen.
Introduction
Groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2's) werden voor het eerst ontdekt in de peritoneale holteweefsels van muizen en bleken vervolgens aanwezig te zijn in het bloed en andere perifere weefsels zoals de longen, huid en neusholte 1,2,3. Als weefsel-residente cellen worden ILC2's voornamelijk lokaal onderhouden en geprolifereerd en functioneren ze als de eerste bewakers die reageren op exogene schadelijke stimuli door talrijke type 2 cytokines te produceren en type 2 immuniteit 4,5,6 te induceren. ILC2's kunnen ook hun effecten uitoefenen door te smokkelen naar de geïnfecteerde weefsels 7,8.
Net als T-helper 2 (Th2) cellen, zorgen de gecompliceerde regulerende netwerken van ILC2's voor hun significante betrokkenheid bij de progressie van verschillende type 2 ontstekingsziekten, waaronder allergische aandoeningen van de luchtwegen 8,9. Bij astma kunnen van epitheelcellen afgeleide alarmins ILC2's activeren, die longontsteking verder bevorderen door de secretie van interleukine (IL) -4, IL-5 en IL-1310. Klinische studies hebben ook aangetoond dat ILC2-niveaus significant verhoogd waren in het sputum en bloed van patiënten met ernstig astma, wat wijst op een associatie van ILC2's met astma-ernst en hun functie als voorspeller van astmaprogressie11.
Allergische rhinitis (AR) is een veel voorkomende chronische ontstekingsziekte die jaarlijks miljoenen mensen treft, en effectieve behandelingen voor deze ziekte zijn beperkt12,13. ILC2's spelen een cruciale rol in de pathofysiologie van AR, of het nu gaat om de sensibilisatiefase of symptoomgeneratie en ontstekingsfase14. Bij patiënten met AR zijn de niveaus van ILC2 in het perifere bloed zowel lokaal als systemisch verhoogd15. Bepaalde effecten en de onderliggende mechanismen van ILC2's op de pathofysiologie en progressie van AR vereisen echter nog steeds verder onderzoek.
CD226 - een transmembraan glycoproteïne dat dient als een costimulatory molecuul - wordt voornamelijk uitgedrukt op natural killer (NK) cellen, T-cellen en andere inflammatoire monocyten16,17. De interactie van CD226 en zijn liganden (CD155 en/of CD112) of concurrent (TIGIT) stelt het in staat om deel te nemen aan de biologische functies van verschillende immuuncellen18. De binding van de liganden op antigeen-presenterende cellen aan CD226 op cytotoxisch lymfocyt (CTL) bevordert de activering van beide cellen tegelijkertijd, terwijl de activering van CTL verder kan worden onderdrukt door TIGIT (T-cel immunoreceptor met Ig- en ITIM-domeinen), de concurrent van CD22619,20. Een menselijke ex vivo studie toonde aan dat CD226 en CD155 op T-cellen de balans tussen Th1/Th17 en Th2 reguleren door differentieel modulerende Th-deelverzamelingen21. CD226 kan eveneens bloedplaatjesadhesie en NK tumordodende activiteit bemiddelen22,23. Ondertussen is CD226 goed bestudeerd in de pathogenese van verschillende infectieziekten, auto-immuunziekten en tumoren 18,24,25. Op dit moment is CD226 een nieuw lichtpuntje geworden voor immunotherapie. Studies hebben aangetoond dat extracellulaire blaasjes CD226-expressie op NK-cellen kunnen omkeren om hun cytotoxische activiteit te herstellen en in te grijpen in de progressie van longkanker26. Een recente studie heeft een subcluster van foetale intestinale groep 3 ILC's onthuld die worden gekenmerkt door hoge CD226-expressie door eencellige RNA-sequencing27, wat aangaf dat CD226 een rol zou kunnen spelen in de aangeboren lymfoïde celgemedieerde immuniteit.
Onze kennis over ILC2's bij luchtwegontsteking is voornamelijk gebaseerd op studies over astma; Er is echter weinig bekend over hun functies in nasale mucosale immuniteit. Zo werd een protocol opgesteld om ILC2's uit het neusslijmvlies te isoleren en te identificeren. De studie richt zich op de expressie van CD226 op ILC2's in neusweefsels en de variatie tussen gezonde en AR-muizen. Dit kan nieuwe inzichten opleveren in de onderliggende mechanismen van ILC2-gemedieerde regulatie in de lokale immuniteit en dienen als basis voor het ontwikkelen van nieuwe benaderingen voor AR-behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor verzorging en gebruik van proefdieren. Alle procedures en protocollen werden goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Wetenschappelijk Onderzoek van de Vierde Militaire Medische Universiteit (nr. 20211008).
1. Murine AR-modelvestiging
- Huis mannelijke en vrouwelijke wild-type (WT) C57BL / 6 muizen in de leeftijd van 8-12 weken onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden en bieden standaard laboratorium chow en water.
- Emulgeer 50 μg ovalbumine (OVA) in 0,2 ml steriele PBS met 2 mg aluminiumhydroxide op een schone bank om de steriliteit te behouden. Injecteer op dag 0, 7 en 14 intraperitoneaal vrouwelijke of mannelijke muizen met elk 50 μg geëmulgeerde OVA.
- Op dag 21, 22, 23, 24 en 25, intranasaal inbrengen muizen met 50 μg OVA opgelost in 30 μL steriele PBS (15 μL per neusgat) onder inhalatie-anesthesie (2-3% isofluraan met een zuurstofstroomsnelheid of 0,5 l / min).
- Euthanaseer de muizen 24 uur na de laatste uitdaging (dag 26).
2. Isolatie van mononucleaire cellen (MNC's) uit het neusslijmvlies
- Euthanaseer de muizen door cervicale dislocatie onder diepe anesthesie. Week de muizenkop gedurende 5 minuten in 75% ethanol en vermijd dat ethanol het externe neusgat binnendringt. Plaats de buik naar beneden op de operatietafel.
- Knip de voortanden af. Maak op de middellijn van het hoofd een incisie en knip de huid open met een schaar.
- Verwijder de onderkaak, snijd de hele neus langs het uiteinde van het gehemelte af en plaats het weefsel in een petrischaal van 60 mm met 5 ml ijskoude PBS. Verwijder met een schaar en een tang het vlees en de spieren die zich aan de botten hechten.
- Breng de muisneus over in een nieuwe petrischaal van 60 mm met 5 ml ijskoud PBS. Was de botten twee keer met 5 ml ijskoude PBS.
- Breng de neus over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Sla de neus voldoende kapot en breng deze over in een buis van 15 ml met 2 ml voorverwarmde verteringsbuffer (RPMI 1640 medium aangevuld met 1 mg/ml collagenase IV en 10 U/ml DNase I).
- Bevestig het deksel en plaats de buis verticaal in een orbitale schudder bij 37 °C, met continu roeren bij 120-150 tpm gedurende 40 minuten.
OPMERKING: Verwarm de verteringsbuffer voor tot 37 °C om de hoogste enzymactiviteit te bereiken. - Voeg 5 ml ijskoud RPMI 1640-medium met 10% foetaal runderserum (FBS) toe om het verteringsproces te stoppen.
- Filter door een 70 μm celzeef om vaste fragmenten te verwijderen.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten op 500 x g en gooi het supernatant voorzichtig weg.
- Resuspendie van de pellet in ijskoud RPMI 1640 medium en centrifugeer gedurende 5 minuten op 500 x g . Gooi het supernatant voorzichtig weg.
- Resuspendeer de celpellet in 4 ml 40% dichtheidsgradiëntmedia (160 μl 10x PBS + 1,44 ml dichtheidsgradiëntmedia-voorraadoplossing + 2,4 ml RPMI 1640-medium).
- Plaats voorzichtig een Pasteur-pipet op de bodem van de buis en voeg langzaam 2,5 ml 80% dichtheidsgradiëntmedia toe (200 μL 10x PBS + 1,8 ml dichtheidsgradiëntmedia-voorraadoplossing + 0,5 ml RPMI 1640-medium).
- Stel de versnellings- en vertragingssnelheid van de centrifuge lager in dan de derde versnelling en centrifugeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) op 400 x g .
- Verwijder de bovenste laag onzuiverheden voordat u de cellen op het grensvlak afvoert om mogelijke besmetting te voorkomen. Giet de mononucleaire cellen (MNC's) laag op de 40%/80% dichtheid gradiënt media interface voorzichtig af in een buis van 15 ml met 2 ml ijskoude PBS met behulp van een pipet. Was de cellen twee keer met ijskoude PBS.
3. Oppervlaktekleuring voor FCM-analyse
- Oogst de cellen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C. Resuspendeer de celpellet in kleurbuffer (PBS aangevuld met 2% FBS en 0,1% NaN3) en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
LET OP: Wees voorzichtig bij het voorbereiden van de kleuringsbuffer. NaN3 is zeer giftig en kan schade aan organen veroorzaken bij inslikken, inademen of in contact komen met de huid. Vermijd ook afgifte aan de omgeving. - Resuspendeer de cellen in 80 μL blokkerende oplossing (anti-CD16/32 antilichaam (1:100) verdund in kleuringsbuffer) per buis. Incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij 4 °C.
- Voeg zonder wassen 20 μl van de juiste verdunning van de oppervlaktekleuringscocktail van antilichamen toe (tabel 1).
- Voeg 1 μL (per test) fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof 520 (FVD) toe vlak voordat u de antilichaamcocktail aan de monsters toevoegt. Incubeer in het donker bij 4 °C gedurende 30 min. Stel overeenkomende isotype-antilichamen en fluorescentie minus één (FMO) in als de negatieve controles.
- Was de cellen in 500 μL kleuringsbuffer door gedurende 5 minuten bij 4 °C te centrifugeren op 500 x g .
- Resuspendeerde de celkorrel in 200 μL kleuringsbuffer. Voeg 50 μL vortexed absolute telparels toe aan de gekleurde cellen en roer. Onderwerp ze aan een flowcytometrie (FCM) analyse.
OPMERKING: FCM-gegevens werden verkregen met behulp van een spectrale celanalysator en geanalyseerd met flowcytometrie (FCM) analysesoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een OVA-geïnduceerd muizenmodel werd ontwikkeld om de rol van ILC2's in AR te onderzoeken. De constructie van het AR-muizenmodel was gebaseerd op eerdere studies met kleine wijzigingen 28,29,30,31. Een video van 10 minuten werd opgenomen om de frequentie van niezen en nasale krabben na de laatste neusuitdaging te meten. Allergische symptomen van de OVA-geïnduceerde-AR-muizen werden weergegeven in figuur 1. De frequentie van neuswrijven en niezen bij de AR-muizen was significant hoger dan in de controlegroep.
Vervolgens beschreven we een procedure om MNC's te isoleren van murine neusslijmvlies en hun karakterisering uit te voeren met behulp van FCM-analyse. Ongeveer 2-3 x 106 lymfocyten werden verkregen uit elke muizenneus. De dode cellen werden uitgesloten door FVD-kleuring. De gatingstrategie voor ILC2's onder de geïsoleerde cellen was Lin (CD11b, CD11c, CD3 en B220)− CD45+ CD90.2+ KLRG1+ cellen. Alle poorten werden getekend op basis van isotype of FMO-besturing. Typisch werd ~2%-3% van lin-35+ cellen geïdentificeerd in het neusslijmvlies van gezonde controlemuizen (figuur 2). Het absolute aantal ILC2's in muizenneusslijmvlies varieert van 2.000-4.000.
Vervolgens isoleerden we de ILC2's van de AR-muizen met behulp van de hierboven beschreven methode. Er was geen verschil in het absolute aantal lymfocyten tussen HC- en AR-muizen. De FCM-resultaten gaven aan dat de fractie ILC2's in de AR-muizen 9% -14% was van het totale aantal Lin-CD45+ lymfocyten, wat wijst op een opmerkelijke toename van het aantal ILC2's in AR-neusslijmvlies in vergelijking met dat in gezonde controlemuizen (figuur 3).
We hebben de expressie van CD226 op de ILC2's gedetecteerd. Gemiddeld drukte 51,9% van de ILC2's CD226 uit onder niet-gevaccineerde omstandigheden, terwijl de gemiddelde verhouding van ILC2's die CD226 tot expressie brachten 54,8% was in de AR-muizen, die een niet-significante neiging vertoonden om toe te nemen in vergelijking met die bij controlemuizen. Naast de celfrequentie werd ook het expressieniveau van CD226 van het celoppervlak bepaald met behulp van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) die automatisch werd berekend door FCM-analysesoftware. Interessant is dat de MFI van CD226 significant upregulated was in de AR-muizen in vergelijking met de controlemuizen (figuur 4), wat wijst op een verhoogde expressie van CD226 op de ILC2's van het allergische neusslijmvlies.
Figuur 1: OVA-geïnduceerd murine AR-model. (A) Het schematische diagram van de instelling van het murine AR-model. De frequentie van neuswrijven (B) en niezen (C) in een periode van 10 minuten. Waarden worden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking (SD) (n = 3). Voor het vergelijken van de twee groepen werd de t-toets van Student uitgevoerd; P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: FCM gating strategie voor ILC2's. MNC's werden geïsoleerd zoals hierboven beschreven. (A) De dichtheidsgrafiek toont de verdeling van geïsoleerde MNC's langs de FSC- en SSC-assen. (B) Singlets werden omheind op basis van FSC-kenmerken. (C) Lin−-cellen werden gedefinieerd als CD11b, CD11c, CD3 en B220 negatieve expressie om de myeloïde cellen, B-cellen en T-cellen in MNC's uit te sluiten. Dode cellen werden uitgesloten door middel van fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof (FVD) kleuring. (D) ILC's worden gekenmerkt door Lin− CD45+. (E) ILC2's worden afgesloten door CD90.2+ KLRG1+ onder ILC's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: ILC2's in het neusslijmvlies van gezonde en AR-muizen. (A) Representatieve FCM-afbeeldingen illustreren de verhoudingen van ILC2's onder ILC's uit het neusholteslijmvlies van gezonde controle (HC) en AR-groepen. (B) De verhoudingen van ILC2's in Lin− CD45+-cellen in HC- en AR-groepen. Waarden worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD (n = 3). De t-toets van de student werd uitgevoerd voor een vergelijking van twee groepen. P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: CD226 expressie in neusslijmvlies ILC2's. ILC2's werden gekarakteriseerd met behulp van de bovengenoemde strategie. De expressie van CD226 op ILC2's werd geëvalueerd met behulp van FCM. (A) Representatieve histogrammen van CD226-expressie in HC- en AR-groepen; blauw gebied staat voor de CD226 FMO-besturing. (B,C) De verhoudingen van CD226-positve ILC2's en gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van CD226 in de HC-groep en AR-groep. Waarden worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD (n = 3). De t-toets van de student werd uitgevoerd ter vergelijking tussen de twee groepen. P < 0,05 werd als significant beschouwd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Antistof | Fluorochroom | Kloon | Verdunning |
| CD11b | Fitc | M1/70 | 1:100 |
| CD11C | Fitc | N418 | 1:200 |
| CD226 | PE/Cyaan7 | 10E5 | 1:50 |
| CD3e | Fitc | 145-2C11 | 1:100 |
| CD45 | Alexa Fluor 700 | 30-F11 | 1:200 |
| CD45R(B220) | Fitc | RA3-6B2 | 1:100 |
| CD90,2 | PE | 30-H12 | 1:100 |
| KLRG1 | APC | 2F1 | 1:160 |
Tabel 1: Oppervlaktekleuring antilichaamcocktail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ILC2's zijn nauw verbonden met type 2-ontsteking en ontstekingsstoornissen, zoals aangetoond door een toenemend aantal studies. Zowel muismodellen als menselijke observatie dragen bij aan een beter begrip van de functie ervan in de bovenste luchtwegen. In astmapathofysiologie worden ILC2's geactiveerd door thymusstromale lymfopoietine, IL-25 en IL-33, die meestal worden geproduceerd door epitheelcellen. Vervolgens spiegelen ze Th2-cellen en produceren ILC2's IL-4, IL-5 en IL-13 om type 2-ontstekingte verergeren 32. Bovendien produceren verschillende subsets van ILC2's ook IL-10 en IL-1733,34,35. AR is ook een soort allergische ontsteking van de luchtwegen die wordt aangedreven door type 2-cellen. De deelname van ILC2's aan AR-pathofysiologie is onlangs aangetoond14. De potentiële reguleringsmechanismen van ILC2's onder AR blijven echter grotendeels onbekend.
Er zijn aanwijzingen dat de interactie tussen verschillende ILC2's afhankelijk kan zijn van de oppervlaktemoleculen36. Zo zijn zowel ICOS- als ICOS-liganden die tot expressie komen op ILC2's noodzakelijk voor hun overleving en functies37. Daarnaast drukken ILC2's ook ICAM-1 en LFA-1 uit, die belangrijke effecten hebben op celmigratie en cel-celinteractie 7,38. Bovendien kunnen ILC2's kruisverwijzingen maken met andere immuuncellen via deze celoppervlakmoleculen. OX40L is bijvoorbeeld een dominante mediator voor de interactie tussen CD4+ T-cellen en ILC2's bij longontsteking39. Omdat CD226, als een transmembraan costimulatoir molecuul, expressie uitdrukt op verschillende immuuncellen, evalueerden we ook de expressie ervan op ILC2's in neusweefsels van gezonde en AR-muizen in deze studie.
Algemene OVA-geïnduceerde AR-modellering omvat intraperitoneale systemische sensibilisatie en intranasaal lokale stimulatie, die meestal ten minste 3-4 weken nodig hebben om bevredigende modelleringsresultaten te bereiken31. Een ander OVA-geïnduceerd nasaal afgifte-AR-model duurt even lang als de algemene modelmethode om een geschat niveau van type 2-ontsteking en AR-symptomen te bereiken40. Het aantal en de functie van nasale ILC2's door deze twee AR-modelleringsmethoden moeten echter nog verder worden onderzocht. We beoordeelden niezen en neuswrijven om AR-symptomen te evalueren. Hoewel het overtuigender zou zijn om de beoordeling voor rhinorrhea op te nemen, ontdekten we dat het moeilijk is om de rhinorrhea te zien zonder het gedrag van muizen tijdens de evaluatie te verstoren, dus we hebben deze criteria helaas uitgesloten. Bovendien kan de evaluatie voor niezen en neuswrijven diepgaand genoeg zijn om de ernst van murine AR-symptomen te illustreren voor veel van de relevante artikelen die alleen deze twee criteria gebruikten41,42,43.
Eerdere studies over nasale ILC2's van muizen hebben de isolatie van muizenneusslijmvliesbeschreven 44,45. Hun protocol is als volgt: Verwijder kort het zachte weefsel rond de schedel, open het neusbot om de neusholte bloot te leggen en schraap het neusslijmvliesweefsel van het oppervlak van de schedel met een tang. Hoewel het grootste deel van het geïsoleerde slijmvlies werd gebruikt voor IF, IHC of qPCR, wordt er weinig gerapporteerd over de volgende isolatie van mononucleaire cellen (MNC's) en FCM-analyse. In deze studie, gezien de lage hoeveelheden ILC2's in het neusslijmvlies, behield de operatie het maximale volume van het neusslijmvlies door de hele neus te verteren in plaats van het slijmvlies van het oppervlak van het neusbeen te strippen. Om het verteringsprotocol te optimaliseren, evalueerden we drie digestiemedia: 0,5 mg / ml collagenase IV, 1 mg / ml collagenase IV en 1 mg / ml collagenase IV en 10 U / ml DNase I, en vergeleken het percentage levende cellen en lymfocytenfrequentie verkregen door deze drie verteringsmedia. Het aandeel levende cellen dat door alle drie de media wordt verkregen, heeft geen verschil (90% -95%); de eerste twee soorten vertering waren echter ontoereikend met een lagere lymfocytenfrequentie (~ 5%). Zo werden 1 mg / ml collagenase IV en 10 U / ml DNase I gekozen als de digest media in deze studie. Andere enzymen zoals liberase en dispase die collagenase kunnen vervangen, zijn echter niet onderzocht. Aangezien het type en de concentratie van enzymen van cruciaal belang zijn voor de levensvatbaarheid van cellen en de expressie van celoppervlakmoleculen46,47, moeten het gebruik en de dosering van deze alternatieven tijdens de neusvertering nog steeds zorgvuldig worden onderzocht en geoptimaliseerd. We gebruikten FVD eFluor 520 om de levensvatbaarheid van cellen te controleren, omdat het kan worden gedetecteerd met behulp van een 530/30-banddoorlaatfilter dat gelijkwaardig is aan FITC, zodat we de dode cellen konden uitsluiten tijdens het gaten van Lin-cellen. Andere kleurstoffen voor de levensvatbaarheid van cellen zijn ook optioneel volgens specifieke antilichaampanelen. Bovendien, in plaats van intracellulaire kleuring van transcriptiefactoren GATA3, die meestal wordt uitgevoerd in andere ILC2-gerelateerde studies, werden ILC2's in de huidige studie gekarakteriseerd op basis van celoppervlakmarkers zoals Lin (CD11b, CD11c, CD3 en B220), CD45, CD90.2 en KLRG1 in FCM-analyse. Onder hen is KLRG1 uitgedrukt op ILC2s geïdentificeerd als een specifieke marker van volwassen weefsel ILC2s48,49. Hoewel CD90.2 minder specifiek is, wordt het nog steeds geaccepteerd als een ILC2-geassocieerde oppervlaktemarker50. In deze studie werden muizen niet onderscheiden door geslacht. Onderzoek heeft aangetoond dat de abundantie en celoppervlakantigenen van pulmonale ILC's bij muizen verschillend zijn in geslacht, maar de correlatie van nasale ILC2's met geslacht moet nog worden bestudeerd50. Bovendien richtte het protocol zich niet op de verhouding van andere hematopoëtische cellen. Verschillende FCM-antilichaampanelen zouden helpen om dit probleem op te lossen.
Dit protocol beschreef een methode om ILC2's te isoleren van het muizenneusslijmvlies. De geïsoleerde ILC2's kunnen worden gekleurd voor FCM-karakterisering, gesorteerd voor celkweek of in vitro worden gestimuleerd voor verdere analyses. In overeenstemming met de bevindingen van de eerdere studies 10,45,51, werd een aanzienlijke accumulatie van ILC2's waargenomen in het neusslijmvlies van AR-muizen. Met name CD226 werd uitgedrukt op lokale ILC2's en het niveau ervan nam aanzienlijk verder toe bij allergische aandoeningen. Daarom suggereren de bevindingen in deze studie de betrokkenheid van CD226 in ILC2-afhankelijke AR. Of ILC2's bij patiënten met AR CD226 tot expressie brengen en of de CD226-expressie op ILC2's toeneemt bij allergische aandoeningen, moet in toekomstige studies worden onderzocht.
Tot slot hebben we een protocol opgesteld om ILC2's uit het neusslijmvlies te isoleren en te identificeren en de expressie van adhesiemoleculen daarin te detecteren. Het protocol vereist verdere optimalisatie; Het gebrek aan studies die systematisch en minutieus de procedure beschrijven voor het isoleren en karakteriseren van lymfocyten, met name aangeboren lymfoïde cellen in het neusslijmvlies, maakt dit protocol echter een voorlopige referentie voor onderzoekers die de lokale nasale immunologische omgeving verkennen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
R.Z. werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 81871258) en fondsen verstrekt door de Fourth Military Medical University (nr. 2020rcfczr). Y.Z. werd ondersteund door het Natural Science Basic Research Program van Shaanxi (Nr. 2021JM-081).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
References
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Price, A. E., et al. Systemically dispersed innate IL-13-expressing cells in type 2 immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11489-11494 (2010).
- Ebihara, T., et al. Trained innate lymphoid cells in allergic diseases. Allergology International. 70 (2), 174-180 (2021).
- Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y., Rudensky, A. Y. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science. 350 (6263), 981-985 (2015).
- Moro, K., et al. Interferon and IL-27 antagonize the function of group 2 innate lymphoid cells and type 2 innate immune responses. Nature Immunology. 17 (1), 76-86 (2016).
- Helou, D. G., et al. LAIR-1 acts as an immune checkpoint on activated ILC2s and regulates the induction of airway hyperreactivity. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 149 (1), 223-236 (2022).
- Karta, M. R., et al. beta2 integrins rather than beta1 integrins mediate Alternaria-induced group 2 innate lymphoid cell trafficking to the lung. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 329-338 (2018).
- Helou, D. G., et al. PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity. Nature Communications. 11 (1), 3998 (2020).
- Kabata, H., Moro, K., Koyasu, S. The group 2 innate lymphoid cell (ILC2) regulatory network and its underlying mechanisms. Immunological Reviews. 286 (1), 37-52 (2018).
- Zheng, H., et al. The role of Type 2 innate lymphoid cells in allergic diseases. Frontiers in Immunology. 12, 586078 (2021).
- Maggi, L., et al. The dual function of ILC2: From host protection to pathogenic players in type 2 asthma. Molecular Aspects of Medicine. 80, 100981 (2021).
- Meltzer, E. O., et al. Burden of allergic rhinitis: results from the Pediatric Allergies in America survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124, 3 Suppl 43-70 (2009).
- Wheatley, L. M., Togias, A.
- Bousquet, J., et al.
- Kato, A. Group 2 innate lymphoid cells in airway diseases. Chest. 156 (1), 141-149 (2019).
- Nakamura-Shinya, Y., et al. DNAM-1 promotes inflammation-driven tumor development via enhancing IFN-gamma production. International Immunology. 34 (3), 149-157 (2022).
- Braun, M., et al. CD155 on Tumor cells drives resistance to immunotherapy by inducing the degradation of the activating receptor CD226 in CD8(+) T cells. Immunity. 53 (4), 805-823 (2020).
- Huang, Z., Qi, G., Miller, J. S., Zheng, S. G. CD226: An emerging role in immunologic diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 564 (2020).
- Gilfillan, S., et al. DNAM-1 promotes activation of cytotoxic lymphocytes by nonprofessional antigen-presenting cells and tumors. Journal of Experimental Medicine. 205 (13), 2965-2973 (2008).
- Zhang, D., et al. TIGIT-Fc alleviates acute graft-versus-host disease by suppressing CTL activation via promoting the generation of immunoregulatory dendritic cells. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease. 1864, 3085-3098 (2018).
- Lozano, E., Joller, N., Cao, Y., Kuchroo, V. K., Hafler, D. A. The CD226/CD155 interaction regulates the proinflammatory (Th1/Th17)/anti-inflammatory (Th2) balance in humans. Journal of Immunology. 191 (7), 3673-3680 (2013).
- Kojima, H., et al. CD226 mediates platelet and megakaryocytic cell adhesion to vascular endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (38), 36748-36753 (2003).
- Martinet, L., Smyth, M. J. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nature Reviews. Immunology. 15 (4), 243-254 (2015).
- Yeo, J., Ko, M., Lee, D. H., Park, Y., Jin, H. S. TIGIT/CD226 axis regulates anti-tumor immunity. Pharmaceuticals. 14 (3), Basel, Switzerland. 200 (2021).
- Nakano, M., et al. Association of elevated serum soluble CD226 levels with the disease activity and flares of systemic lupus erythematosus. Scientific Reports. 11 (1), 16162 (2021).
- Chang, W. A., et al. miR-150-5p-containing extracellular vesicles are a new immunoregulator that favor the progression of lung cancer in hypoxic microenvironments by altering the phenotype of NK cells. Cancers. 13 (24), 6552 (2021).
- Stehle, C., et al. T-bet and RORalpha control lymph node formation by regulating embryonic innate lymphoid cell differentiation. Nature Immunology. 22 (10), 1231-1244 (2021).
- Piao, C. H., Fan, Y. J., Nguyen, T. V., Song, C. H., Chai, O. H. Mangiferin alleviates ovalbumin-induced allergic rhinitis via Nrf2/HO-1/NF-kappaB signaling pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3415 (2020).
- Zhao, Y., Tao, Q., Wu, J., Liu, H. DMBT1 has a protective effect on allergic rhinitis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 121, 109675 (2020).
- Piao, C. H., et al. Ethanol extract of Dryopteris crassirhizoma alleviates allergic inflammation via inhibition of Th2 response and mast cell activation in a murine model of allergic rhinitis. Journal of Ethnopharmacology. 232, 21-29 (2019).
- Liang, M. J., et al. Immune responses to different patterns of exposure to ovalbumin in a mouse model of allergic rhinitis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 273 (11), 3783-3788 (2016).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vely, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews. Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Seehus, C. R., et al. Alternative activation generates IL-10 producing type 2 innate lymphoid cells. Nature Communications. 8 (1), 1900 (2017).
- Cai, T., et al. IL-17-producing ST2(+) group 2 innate lymphoid cells play a pathogenic role in lung inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 229-244 (2019).
- Golebski, K., et al. IL-1beta, IL-23, and TGF-beta drive plasticity of human ILC2s towards IL-17-producing ILCs in nasal inflammation. Nature Communications. 10 (1), 2162 (2019).
- Lei, A., Zhou, J. Cell-surface molecule-mediated cell-cell interactions in the regulation of ILC2-driven allergic inflammation. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (22), 4503-4510 (2019).
- Maazi, H., et al. ICOS:ICOS-ligand interaction is required for type 2 innate lymphoid cell function, homeostasis, and induction of airway hyperreactivity. Immunity. 42 (3), 538-551 (2015).
- Lei, A. H., et al. ICAM-1 controls development and function of ILC2. The Journal of Experimental Medicine. 215 (8), 2157-2174 (2018).
- Drake, L. Y., Iijima, K., Kita, H. Group 2 innate lymphoid cells and CD4+ T cells cooperate to mediate type 2 immune response in mice. Allergy. 69 (10), 1300-1307 (2014).
- Wang, Y., et al. The comparation of intraperitoneal injection and nasal-only delivery allergic rhinitis model challenged with different allergen concentration. American Journal of Rhinology & Allergy. 33 (2), 145-152 (2019).
- Niu, Y., et al. HIF1alpha deficiency in dendritic cells attenuates symptoms and inflammatory indicators of allergic rhinitis in a SIRT1-dependent manner. International Archives of Allergy and Immunology. 181 (8), 585-593 (2020).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of alpha-lipoic acid via balancing Th17/Treg expression and enhancing Nrf2/HO-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Pyun, B. J., et al. Gardenia jasminoides attenuates allergic rhinitis-induced inflammation by inhibiting periostin production. Pharmaceuticals (Basel). 14 (10), 986 (2021).
- Liu, Z., et al. Analysis of expression of ILC2 cells in nasal mucosa based on animal model of allergic bacterial infection rhinitis. Journal of Infection and Public Health. 14 (1), 77-83 (2021).
- Hu, B., Wang, Y., Zheng, G., Zhang, H., Ni, L. Effect of parasympathetic inhibition on expression of ILC2 cells in a mouse model of allergic rhinitis. The World Allergy Organization journal. 14 (9), 100582 (2021).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Krisna, S. S., et al. Optimized protocol for immunophenotyping of melanoma and tumor-bearing skin from mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100627 (2021).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Loering, S., et al. Differences in pulmonary group 2 innate lymphoid cells are dependent on mouse age, sex and strain. Immunology and Cell Biology. 99 (5), 542-551 (2021).
- Lin, L., et al. Allergic inflammation is exacerbated by allergen-induced type 2 innate lymphoid cells in a murine model of allergic rhinitis. Rhinology Journal. 55 (4), 339-347 (2017).
