Uso de una inyección de trazador celular para investigar el origen de las células formadoras de neointima en un modelo de pared lateral saccular de rata

La hemorragia subaracnoidea causada por la ruptura de un aneurisma intracraneal (AI) es una condición neuroquirúrgica devastadora asociada con una alta morbilidad y mortalidad 1,2,3,4. Además del recorte microquirúrgico, que proporciona contacto directo de endotelio a endotelio, los dispositivos endovasculares han ganado cada vez más importancia en las últimas décadas para tratar las IA rotas e incidentalmente descubiertas. La respuesta de curación en las EA tratadas endovascularmente depende principalmente de la formación de neoíntima y la organización del trombo. Ambos son procesos sinérgicos, dependiendo de la migración celular desde el vaso adyacente y la pared del aneurisma. ^{5 Hasta} la fecha, el origen de las células endoteliales en la formación neointima de aneurismas tratados con endovascular sigue sin estar claro. Hay un debate en curso en la literatura sobre la fuente de la que se reclutan las células formadoras de neointima.

Mediante el uso de una inyección de trazador celular de colorante CM-Dil (ver la Tabla de Materiales) en la aorta abdominal de ratas, nuestro objetivo fue analizar el papel de las células endoteliales, originadas en la arteria madre, en la formación de neointima en dos puntos de tiempo fu diferentes (día 7 y día 21) (Figura 1). Una ventaja del modelo es la incubación local directa del trazador celular in vivo en una arteria madre antes de la sutura del aneurisma, lo que permite la FU en puntos de tiempo posteriores. Las técnicas de inyección in vivo , como la incubación de trazadores celulares, no se han descrito en la literatura. Una ventaja de esta técnica es la inyección directa, de un punto, intraoperatoria, in vivo , que hace que el modelo sea robusto y reproducible.

El apoyo veterinario se realizó de acuerdo con las directrices institucionales. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética Local, Suiza (BE 60/19). Las directrices de ARRIVE y los principios de 3R se han seguido estrictamente ^6,7. Se incluyeron treinta y una ratas Lewis macho, de 12 semanas de edad y con un peso de 492 ± 8 g. Alojar a todas las ratas a una temperatura ambiente de 23 °C y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Proporcionar acceso gratuito a agua y pellets. Los análisis estadísticos se han realizado mediante la prueba no paramétrica U de Wilcoxon-Mann-Whitney. Los valores de probabilidad (p) de ≤ 0,05 y/o ≤ 0,01 se consideraron significativos.

1. Preparación general de fase preoperatoria y aspectos anestesiológicos

1. Aleatorizar ratas en grupos de tratamiento de bobina o stent (Figura 2) a través de un sistema de aleatorización basado en la web. Ahora, realice un examen clínico preoperatorio de todos los animales planificados para la cirugía junto a un quirófano tranquilo y aséptico manteniendo una temperatura ambiente de 23 ± 3 ° C. Analizar el comportamiento de los animales e inspeccionar las membranas mucosas y la turgencia como parte del examen clínico preoperatorio.
2. Registra el peso de cada animal.
3. Antes de la cirugía, incubar las bolsas arteriales de ratas donantes en dodecil sulfato de sodio al 0,1% durante 10 h a 37 °C para obtener aneurismas descelularizados⁸. Recoja estas bolsas de animales donantes unos días antes de la cirugía.
   1. Prepare toda la longitud de la aorta abdominal con microscisores y fórceps y aplique 6-0 ligaduras no absorbibles en un intervalo de 3-4 mm.
   2. Generar directamente aneurismas vitales intraoperatoriamente por una bolsa de vasos arteriales previamente ligada desde la parte torácica de un animal donante⁹. Realizar toracotomía con tijeras y pinzas quirúrgicas en el punto de tiempo FU indicado y ligar la bolsa del vaso a la longitud deseada.
4. Implantar directamente la bolsa en el receptor y cosechar el aneurisma del animal donante para su posterior análisis macroscópico y procesamiento histológico.
5. Para la inducción de la anestesia, coloque a todas las ratas en una caja limpia provista de oxígeno (O₂) hasta la pérdida del conocimiento después de 5-10 min. Anestesiar a las ratas con una inyección subcutánea (SC) de una mezcla de fentanilo 0,005 mg/kg, medetomidina 0,15 mg/kg y midazolam 2 mg/kg.
   NOTA: Esto asegura un plano quirúrgico de al menos 45 min.
6. Comprobar la profundidad de la anestesia por la ausencia del reflejo de retirada del pedal.
7. Coloque las ratas en posición supina y afeite la parte toracoabdominal con una afeitadora eléctrica.
8. Fije las 4 patas de las ratas con cinta adhesiva en una placa, cubierta por una almohadilla térmica conectada a una sonda rectal autorreguladora. Inserte la sonda rectal en el ano de la rata para mantener la temperatura deseada de 37 ° C con la ayuda de la almohadilla térmica.
9. Ahora, instale un sensor en la pata trasera derecha conectado a un sistema computarizado para verificar los signos vitales intraoperatoriamente.
10. Cubra la nariz y la boca de la rata con una máscara facial. Si requiere anestesia prolongada, comience con isoflurano (1.0-2.0% titulado para efecto en 100% O₂).
11. Desinfecte el campo quirúrgico con povidona yodada o desinfectantes alternos y cubra el campo quirúrgico de manera estéril.
12. Para el cuidado perianestésico, aplique un lubricante oftálmico estéril en los ojos y cúbralos con una máscara de lámina opaca para evitar el secado y el daño de la lámpara quirúrgica.
13. Durante la cirugía, suministre oxígeno continuamente a través de la máscara facial, controle la temperatura corporal y proporcione calor con una almohadilla térmica, manteniendo la normotermia.
14. Controle continuamente otros signos vitales (distensión del pulso y la respiración, frecuencia cardíaca y respiratoria, y saturación de oxígeno).

2. Fase operatoria - inyección de trazador celular

NOTA: El enfoque quirúrgico detallado en el modelo 9 de aneurisma microquirúrgico de la pared lateral^{de la} rata de Helsinki y las técnicas para la implantación de bobinas y stents se describen en otra parte ^8,10,11.

1. Guarde el trazador de células lipofílicas fluorescente a ≤ -20 °C todo el tiempo, protegido de la luz.
2. Realice la cirugía preparando la aorta de rata y la vena cava, seguida de la separación de ambas, así como el pinzamiento temporal proximal y distal de la aorta.
   NOTA: Esta técnica ha sido descrita anteriormente⁹.
   1. Sujete las partes proximal y distal de la aorta con dos clips temporales de titán.
3. Coloque un microswab con acolchado púrpura cada uno debajo de las partes proximal y distal de la aorta para una mejor visualización de la arteria.
4. Ahora, proteja el abdomen con una gasa húmeda.
5. El día de la operación, disolver 2 μL del trazador celular mediante pipeteo en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
6. Transfiera la mezcla a una jeringa de 1 ml equipada con una cánula estéril de 27-1/2 G (0,4 x 13 mm).
   NOTA: Tenga cuidado de evitar la exposición a la luz mientras realiza los pasos 2.5 y 2.6.
7. Apague la luz en el quirófano. Mientras mira bajo un microscopio, realice la inyección de un punto en la parte ventral media de la aorta usando micro fórceps e inyecte cuidadosamente 1 ml de solución salina heparinizada al 0,9%.
8. Inyecte el trazador celular con cuidado (Video 1) e inmediatamente apague el microscopio operativo también. Una vez más, proteja el abdomen con una gasa húmeda.
9. Deje que el tinte se incube durante al menos 15 min. Después del período de incubación, encienda el microscopio y las luces de la sala de operaciones.
10. Realizar la arteriotomía longitudinal y sutura del aneurisma, como se describe en otra parte¹¹.
    1. Use microfuerzas y microscisores para realizar la arteriotomía de modo que su longitud promedie el diámetro del aneurisma cosechado (paso 1.3). Para asegurar la longitud correcta, coloque el aneurisma al lado de la aorta antes de realizar la arteriotomía. Suturar el aneurisma con 8-10 puntos únicos utilizando una sutura 10-0 no absorbible, y retirar cuidadosamente las abrazaderas temporales -comenzando distalmente- bajo riego continuo con solución salina heparinizada. Cierre la herida en capas. Cabe destacar que utilice una densidad de embalaje de bobina de 1 cm.
       NOTA: La técnica de implantación de bobina o stent se ha descrito en otra parte ^8,10.

3. Monitorización de fase postoperatoria y cuidados analgésicos

1. Al final de la cirugía, invierta la anestesia con una mezcla de inyección SC de buprenorfina 0,05 mg/kg, atipamezol 0,75 mg/kg y flumazenil 0,2 mg/kg. Deje que cada animal operado se recupere en una jaula limpia hasta que esté completamente despierto y caliente, según sea necesario, con una lámpara de calefacción.
2. Durante 3 días, administrar 1 mg/kg de meloxicam (una inyección o aplicación oral al día) y buprenorfina (0,05 mg/kg cuatro veces al día) SC. Durante la noche, proporcione buprenorfina continuamente en el agua potable con la misma dosis: 6 ml de buprenorfina 0,3 mg/ml, 360 ml de agua potable, 10 ml de glucosa al 5%.
3. En la fase postoperatoria inmediata, alberge a cada animal en una sola jaula para su protección. Reagrupar a los animales después de 24 h.
4. Si alguna rata muestra un comportamiento angustiado o agresivo después de la inyección de SC, administre buprenorfina en el agua potable durante el día.
5. Proporcione alimentación suave en el piso de la jaula para apoyar la alimentación y la recuperación después de la operación.
6. Observe y cuide a todos los animales de acuerdo con la hoja de puntuación de bienestar y dolor.
7. Administrar analgesia de rescate SC (meloxicam 1 mg/kg y 0,05 mg/kg buprenorfina) cuando sea necesario.

Un total de 31 animales fueron incluidos en el entorno de laboratorio: 27 ratas fueron incluidas en el análisis estadístico final; 4 ratas murieron prematuramente (tasa de mortalidad del 12,9%). Intraoperatoriamente, la distensión respiratoria se redujo significativamente (p = 0,03) en ratas con stent (12,9 μm ± 0,7) en comparación con ratas tratadas con bobina (13,5 μm ± 0,6). Se realizó una angiografía por fluorescencia para cada rata al final de la FU final. La reperfusión se indicó en los 6 animales tratados con bobina, mientras que la reperfusión se observó en solo el 12,5% de los 8 animales tratados con stent.

Los volúmenes basales agrupados de aneurismas para el día 7 y el día 21 no difirieron significativamente (ni para los aneurismas descelularizados (p = 0,9) ni vitales (p = 0,1)) entre los grupos de tratamiento con bobina o stent (Figura 3). Los volúmenes de FU agrupados para aneurismas descelularizados mostraron un crecimiento de aneurisma no significativo en enrollados en comparación con los aneurismas con stent (p = 0,28), significativamente mayor en el grupo vital en espiral que en el stent (60,1 mm3 ± 31,1 mm3 vs. 20,5 mm3 ± 20,6 mm3; p = 0,002).

Las cantidades de células positivas para trazadores celulares en la neointima de aneurismas descelularizados no difirieron significativamente entre los grupos tratados con stent o bobina en el día 7 FU (p = 0,8), pero fueron significativamente mayores en ratas con stent en el día 21 FU (Figura 4; p = 0,04). En ratas con aneurisma vital, no se observaron diferencias significativas a los 7 días (p = 1,0) o a los 21 días (Figura 5) FU (p = 0,66). En los aneurismas descelularizados a los 7 días de FU, permanecieron significativamente más células positivas para trazadores celulares en el trombo del grupo tratado con stent en comparación con el grupo tratado con bobina (p = 0,01). Esta diferencia no se observó en los aneurismas vitales a los 7 días de FU. Consulte la Tabla 1 para la proporción de células positivas para trazadores celulares para descelularizados, así como aneurismas vitales en espiral y con stent para el día 7 y el día 21 fu. La contratinción para el factor de von Willebrand (F8) se realizó en las células endoteliales de la neointima de cada rata (Figura 6).

La duración media del procedimiento quirúrgico fue de 119,1 ± 21,3 min para el grupo de enrollamiento en comparación con 154,1 ± 30,2 min para el grupo de stent (p = 0,001). El número de puntos para las suturas de aneurisma también difirió significativamente (p = 0,000002) para los grupos de bobina (15,6 ± 2,9 puntos) y stent (11,3 ± 1,1).

Figura 1: Diagrama de flujo de la configuración experimental. Un total de 35 animales fueron operados y aleatorizados a grupos de enrollamiento o colocación de stents. Dos animales del grupo de stent murieron en el curso postoperatorio inmediato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Fotografías intraoperatorias de aneurismas durante la embolización de la bobina y el stent. (A) representa un aneurisma de la pared lateral (#), suturado en la aorta abdominal de la rata (*). Tenga en cuenta el dispositivo de bobina introducido en el aneurisma antes de realizar la última puntada única para completar la sutura del aneurisma. Observe la tinción rosada (flecha) en el lado izquierdo de la arteriotomía, lo que indica la distribución correcta del trazador celular. (B) La misma configuración que en A, mostrando el dispositivo de stent ya in situ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Mediciones macroscópicas post mortem en 31 animales. Los volúmenes de aneurisma (mm3) se documentaron antes de la implantación y en el seguimiento, representados a lo largo del eje y. (A) Línea de base (descelularizada), (B) seguimiento (descelularizada), (C) línea de base (vital), (D) seguimiento (vital). Se agrupan los datos del día 7 y el día 21. ** p < 0,01. Los valores se expresan como medianas con rangos intercuartílicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Imagen ejemplar de un aneurisma descelularizado tratado con stent en el día 21. A la derecha, se muestra una descripción general de la imagen de un aneurisma monoclonal antiα-SMA, agotado de células (aumento de 2 veces); barra de escala = 150 μm. Izquierda, contramantada con DAPI; los glóbulos rojos son células trazadoras positivas (A) en la pared del aneurisma, (B) en el trombo, (C) células residuales teñidas pero descoloridas positivas para trazadores celulares en la neointima, y (D) en el complejo de vasos adyacentes. Barras de escala = 100 μm (A-D). Una sola flecha marca la pared del aneurisma, la flecha doble la arteria madre. Abreviaturas: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; α-SMA = actina del músculo α liso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Imagen ejemplar de un aneurisma vital tratado con bobina en el día 21. Lado derecho, se muestra una descripción general de la imagen de un antiα-SMA monoclonal, aneurisma rico en células (aumento de 2 veces); barra de escala = 150 μm. Lado izquierdo, contramantado con DAPI; los glóbulos rojos son células trazadoras positivas (A) en la pared del aneurisma, (B) en el trombo, (C) células múltiples positivas en la neoíntima y (D) en el complejo de vasos adyacentes. Barras de escala = 100 μm (A-D). Una sola flecha marca la pared del aneurisma, la flecha doble la arteria madre. Abreviaturas: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; α-SMA = actina del músculo α liso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Aumento de 40 veces de la tinción F8. # representa la formación de trombos, * la neointima y § el lado endoluminal debajo del orificio del aneurisma. Nótese la estratificación endotelial que se muestra como tinción púrpura en la capa endoluminal de la neointima. Barra de escala = 175 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Proporción de células positivas para trazadores celulares en neoíntima, arteria madre, trombo y pared del aneurisma. Los valores se representan como porcentajes para bolsas descelularizadas y vitales para el tratamiento con bobinas y stents para el día 7 y el día 21. Abreviatura: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol.

Video 1: Inyección de trazador celular en la parte abdominal de la aorta de rata. Esta técnica se realiza mediante una inyección de un punto en la aorta de rata sujetada. Haga clic aquí para descargar este video.

Los autores son los únicos responsables del diseño y la realización del estudio presentado y no declaran intereses contrapuestos.