Summary
우리는 내피 세포를 추적하기 위해 원 포인트, 친유성 세포 추적기 주사를 수행 한 다음 복부 쥐 대동맥에 동맥 절제술과 측벽 동맥류의 봉합을 수행했습니다. Neointima 형성은 탈세포화 된 동맥류의 부모 동맥에 의존하는 것처럼 보였고 중요한 세포가 풍부한 벽에있는 동맥류 벽 세포로부터의 모집에 의해 촉진되었습니다.
Abstract
미세 외과 적 클리핑은 두개내 동맥류로의 혈류 장벽을 만드는 반면, 혈관 내 치료는 신생내막과 혈전 형성에 의존합니다. 신생내막의 내막 층을 덮고있는 내피 세포의 근원은 불분명하다. 따라서, 본 연구의 목적은 이미 잘 확립된 헬싱키 래트 미세외과 측벽 동맥류 모델에서 세포-트레이서 주사 후 신생내막 형성 세포의 기원을 조사하는 것이었다.
측벽 동맥류는 수컷 루이스 래트에서 대동맥에 탈세포화 또는 중요한 동맥 파우치를 종단 대우로 봉합하여 생성되었다. 동맥류 봉합사로 동맥 절제술 전에, CM-Dil 염료를 함유하는 세포-트레이서 주사를 인접한 혈관의 내피 세포를 표지하고 후속 조치 (FU) 동안 그들의 증식을 추적하기 위해 클램핑된 대동맥 내로 수행하였다. 치료 후 코일링 (n = 16) 또는 스텐트 (n = 15)가 뒤 따른다. FU (7 일 또는 21 일)에서 모든 래트는 형광 혈관 조영술을 받았고 동맥류 수확 및 특정 관심 영역에 대한 면역 조직 학적 세포 수를 통한 거시적 및 조직학적 평가를 받았다.
31 개의 동맥류 중 어느 것도 후속 조치로 파열되지 않았습니다. 네 마리의 동물이 조기에 사망했습니다. 거시적 잔류 관류는 75.0% 코일링된 래트와 7.0%의 스텐트 래트에서 관찰되었다. 세포-추적자-양성 세포의 양은 7일째의 혈전(p=0.01) 및 21일째의 네오인티마(p=0.04)에 대하여 코일링된 동맥류에 비해 탈세포화된 스텐트에서 유의하게 상승하였다. 중요한 동맥류에서 혈전 또는 신생 내막에서 유의미한 차이는 발견되지 않았습니다.
이러한 발견은 스텐트 동맥류에 비해 코일에서 더 나쁜 치유 패턴을 확인합니다. Neointima 형성은 탈세포화 된 동맥류의 부모 동맥에 특히 의존하는 것처럼 보이지만, 중요한 세포가 풍부한 벽에있는 동맥류 벽 세포로부터의 모집에 의해 뒷받침됩니다. 번역 측면에서 스텐트 치료는 고도로 퇴화 된 동맥류에 더 적합 할 수 있지만 코일 만으로는 대부분 건강한 혈관벽을 가진 동맥류에 적합 할 수 있습니다.
Introduction
두개내 동맥류(IA)의 파열로 인한 Subarachnoid 출혈은 높은 이환률 및 사망률 1,2,3,4와 관련된 파괴적인 신경외과적 상태이다. 내피와 내피 간의 직접적인 접촉을 제공하는 미세 외과 적 클리핑 외에도 혈관 내 장치는 파열되고 우연히 발견 된 IA를 치료하기 위해 지난 수십 년 동안 중요성이 커지고 있습니다. 혈관 내 치료 IAs의 치유 반응은 주로 신생내막 형성 및 혈전 조직에 달려 있습니다. 둘 다 인접한 혈관과 동맥류 벽으로부터의 세포 이동에 따라 시너지 효과가있는 과정입니다. 5 현재까지 혈관 내 처리된 동맥류의 신생내막 형성에서 내피 세포의 기원은 불분명하다. 신인티마 형성 세포가 모집되는 출처에 관한 문헌에서 지속적인 논쟁이 있습니다.
쥐의 복부 대동맥에 CM-Dil 염료 ( 물질의 표 참조)를 주사 한 세포 추적기를 사용하여, 우리는 두 개의 다른 FU 시점 (7 일과 21 일째)에서 신생 내막 형성에서 부모 동맥에서 기원되는 내피 세포의 역할을 분석하는 것을 목표로했습니다 (그림 1). 이 모델의 장점은 동맥류 봉합 전에 부모 동맥 에서 생체 내에서 직접 국소 세포 추적기 인큐베이션하여 나중 시점에서 FU를 허용하는 것입니다. 생체내 주입 기술, 예컨대 세포-트레이서 인큐베이션은 문헌에 기재되어 있지 않다. 이 기술의 장점은 직접, 원 포인트, 수술 내, 생체 내 주사로 모델을 강력하고 재현 가능하게 만듭니다.
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Protocol
수의학 지원은 제도적 지침에 따라 수행되었습니다. 실험은 스위스 지역 윤리위원회 (BE 60/19)의 승인을 받았다. ARRIVE 지침과 3R 원칙은 6,7을 엄격히 준수했습니다. 12주령이고 체중이 492± 8g인 서른 마리의 수컷 루이스 래트가 포함되었다. 모든 쥐를 23 °C의 실온과 12 시간의 빛 / 어두운 사이클에 보관하십시오. 물과 펠릿에 무료로 접근 할 수 있습니다. 통계 분석은 비모수 Wilcoxon-Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 수행되었습니다. 0.05 및/또는 0.01≤의 확률 값(p)≤ 유의한 것으로 간주하였다.
1. 수술 전 단계 - 일반 준비 및 마취 학적 측면
- 웹 기반 무작위화 시스템을 통해 쥐를 코일 또는 스텐트 처리 그룹(그림 2)으로 무작위화합니다. 이제 23 ± 3 °C의 실내 온도를 유지하는 조용하고 무균 수술실 옆에서 수술을 위해 계획된 모든 동물에 대한 수술 전 임상 검사를 수행하십시오. 동물의 행동을 분석하고 수술 전 임상 검사의 일환으로 점막과 터고르를 검사하십시오.
- 각 동물의 무게를 기록하십시오.
- 수술 전에, 공여 래트로부터 동맥 파우치를 37°C에서 10시간 동안 0.1% 소듐 도데실 설페이트에 인큐베이션하여 탈세포화된 동맥류8을 얻었다. 수술 며칠 전에 기증자 동물로부터이 파우치를 수집하십시오.
- 미세 가위와 포셉으로 복부 대동맥의 전체 길이를 준비하고 3-4mm 간격으로 6-0 개의 비 흡수성 합자를 적용하십시오.
- 기증자 동물의 흉부 부분으로부터 이전에 결찰된 동맥 혈관 파우치에 의해 수술내 중요한 동맥류를 직접 생성한다9. 표시된 FU 시점에서 가위 및 수술 포셉으로 흉부 절제술을 수행하고 원하는 길이로 용기 주머니를 리게이트하십시오.
- 파우치를 수용자에게 직접 이식하고 추가 거시적 분석 및 조직학적 처리를 위해 기증자 동물로부터 동맥류를 수확합니다.
- 마취 유도를 위해, 모든 쥐를 5-10분 후에 의식이 상실될 때까지 산소(O2)가 제공된 깨끗한 상자에 넣는다. 펜타닐 0.005 mg / kg, 메데토미딘 0.15 mg / kg 및 미다 졸람 2 mg / kg의 혼합물을 피하 (SC) 주사로 쥐를 마취하십시오.
참고: 이것은 적어도 45 분의 수술 평면을 보장합니다. - 페달 금단 반사의 부재에 의해 마취의 깊이를 확인하십시오.
- 쥐를 수핀 위치에 놓고 전기 면도기로 흉부 복부 부분을 면도하십시오.
- 자동 조절 직장 프로브에 연결된 가열 패드로 덮인 보드에 테이프로 쥐의 4 발을 고정하십시오. 직장 프로브를 쥐의 항문에 삽입하여 가열 패드의 도움으로 37°C의 원하는 온도를 유지한다.
- 이제 수술 중 활력 징후를 검사하기 위해 컴퓨터 시스템에 연결된 오른쪽 뒷다리에 센서를 설치하십시오.
- 얼굴 마스크로 쥐의 코와 입을 가리십시오. 장기간의 마취가 필요한 경우, 이소플루란을 시작하십시오 (1.0-2.0 % 적정하여 100 %O2에서 효과).
- 포비돈 요오드 또는 교대 소독제로 수술 현장을 소독하고 멸균 방식으로 수술 현장을 드레이프하십시오.
- 주변 마취 치료를 위해 멸균 안과 윤활제를 눈에 바르고 불투명 한 호일 마스크로 덮어 수술 램프의 건조 및 손상을 방지하십시오.
- 수술 전반에 걸쳐 안면 마스크를 통해 지속적으로 산소를 공급하고 체온을 모니터링하며 가열 패드를 사용하여 열을 공급하여 정상 온체를 유지합니다.
- 다른 활력 징후를 지속적으로 모니터링합니다 (맥박 및 호흡 긴장, 심장 및 호흡 속도, 산소 포화도).
2. 수술 단계 - 세포 추적기 주입
참고: 헬싱키 쥐 미세외과 측벽 동맥류 모델9의 상세한 외과적 접근법 및 코일 및 스텐트-이식을 위한 기술은 다른 곳에서 기술된다 8,10,11.
- 형광 친유성 세포-트레이서를 항상 ≤-20°C에서 보관하고, 빛으로부터 보호한다.
- 쥐 대동맥 및 기병 정맥을 준비하여 수술을 수행하고, 대동맥의 근위 및 원위 임시 클램핑뿐만 아니라 둘 다의 분리를 수행한다.
참고: 이 기술은 이전에9에 설명되어 있습니다.- 대동맥의 근위 및 원위 부분을 두 개의 임시 타이탄 클립으로 고정하십시오.
- 동맥의 더 나은 시각화를 위해 대동맥의 근위 및 원위 부분 아래에 각각 보라색 패딩이있는 하나의 미세 면봉을 넣으십시오.
- 이제 젖은 거즈로 복부를 보호하십시오.
- 조작 당일에, 1 mL의 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에 피펫팅함으로써 2 μL의 세포-트레이서를 용해시킨다.
- 혼합물을 27-1/2 G (0.4 x 13 mm) 멸균 캐뉼라가 장착된 1 mL 주사기로 옮긴다.
참고: 2.5 및 2.6단계를 수행하는 동안 빛에 노출되지 않도록 주의하십시오. - 수술실의 조명을 끕니다. 현미경으로 보면서 마이크로 포셉을 사용하여 대동맥의 중간 복부 부분에 원 포인트 주사를 수행하고 헤파린화 된 0.9 % 식염수 1 mL를 조심스럽게 주입하십시오.
- 세포 추적기를 조심스럽게 주입하고 (비디오 1) 즉시 작동 현미경을 끕니다. 다시 젖은 거즈로 복부를 보호하십시오.
- 염료를 적어도 15 분 동안 인큐베이트하게하십시오. 잠복기가 끝나면 현미경과 수술실 조명을 켭니다.
- 동맥류의 종동맥 절제술 및 봉합을 수행하며, 다른 곳에서 설명된 바와 같이(11).
- 마이크로 포셉과 미세 가위를 사용하여 동맥 절제술을 수행하여 길이가 수확 된 동맥류의 직경을 평균화하도록하십시오 (단계 1.3). 정확한 길이를 보장하려면 동맥 절제술을 수행하기 전에 대동맥류를 대동맥 옆에 두십시오. 흡수되지 않는 10-0 봉합사를 사용하여 8-10 개의 단일 스티치로 동맥류를 봉합하고, 헤파린화 된 식염수로 연속 관개 하에서 원위 적으로 시작하는 임시 클램프를 조심스럽게 제거하십시오. 상처를 겹겹이 겹쳐서 닫으십시오. 참고로, 1cm의 코일 패킹 밀도를 사용하십시오.
참고 : 코일 또는 스텐트 이식 기술은 다른 곳에서 설명되었습니다 8,10.
- 마이크로 포셉과 미세 가위를 사용하여 동맥 절제술을 수행하여 길이가 수확 된 동맥류의 직경을 평균화하도록하십시오 (단계 1.3). 정확한 길이를 보장하려면 동맥 절제술을 수행하기 전에 대동맥류를 대동맥 옆에 두십시오. 흡수되지 않는 10-0 봉합사를 사용하여 8-10 개의 단일 스티치로 동맥류를 봉합하고, 헤파린화 된 식염수로 연속 관개 하에서 원위 적으로 시작하는 임시 클램프를 조심스럽게 제거하십시오. 상처를 겹겹이 겹쳐서 닫으십시오. 참고로, 1cm의 코일 패킹 밀도를 사용하십시오.
3. 수술 후 단계 모니터링 및 진통제 치료
- 수술이 끝나면 부프레노르핀 0.05 mg/kg, 아티파메졸 0.75 mg/kg 및 플루마제닐 0.2 mg/kg의 SC 주사 혼합물로 마취를 역전시킵니다. 필요에 따라 가열 램프로 완전히 깨어나고 따뜻해질 때까지 각 조작 된 동물이 깨끗한 새장에서 회복되도록하십시오.
- 3 일 동안 1 mg / kg meloxicam (하루에 1 회 주사 또는 경구 투여) 및 buprenorphine (매일 0.05 mg / kg) SC. 밤새 동일한 용량으로 음용수에 부프레노르핀을 지속적으로 제공하십시오 : 6 mL 부프레노르핀 0.3 mg / mL, 360 mL 식수, 10 mL 5 % 포도당.
- 즉각적인 수술 후 단계에서는 보호를 위해 각 동물을 단일 케이지에 보관하십시오. 24 시간 후에 동물을 재편성하십시오.
- SC 주사 후 어떤 쥐가 괴로워하거나 공격적인 행동을 보이면 하루 동안 식수에 부프레노르핀을 투여하십시오.
- 케이지 바닥에 부드러운 사료를 제공하여 수술 후 먹이와 회복을 지원하십시오.
- 웰빙 및 통증 점수 시트에 따라 모든 동물을 관찰하고 돌보십시오.
- 필요한 경우 구조 진통 SC (멜록시캄 1 mg / kg 및 0.05 mg / kg 부프레 노르 핀)를 투여하십시오.
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Representative Results
총 31마리의 동물이 실험실 환경에 포함되었다: 27마리의 래트가 최종 통계 분석에 포함되었다; 4 마리의 쥐가 조기에 사망했습니다 (사망률 12.9 %). 수술내에서, 호흡 팽만감은 코일 처리된(13.5 μm ± 0.6) 래트에 비해 스텐트-(12.9 μm ± 0.7)에서 유의하게 감소하였다(p=0.03). 형광 혈관조영술은 최종 FU의 말기에 모든 래트에 대해 수행되었다. 재관류는 코일 처리된 6마리의 동물 모두에서 나타났지만, 재관류는 스텐트 처리된 8마리의 동물 중 12.5%에서만 관찰되었다.
7일째 및 21일째에 풀링된 기준선 동맥류 부피는 코일 또는 스텐트-치료 그룹 사이에서 유의하게 다르지 않았다(탈세포화(p=0.9) 또는 생명(p=0.1) 동맥류에 대해서는 둘 수 없음). 탈세포화된 동맥류에 대한 풀링된 FU 부피는 스텐트된 동맥류에 비해 코일링된 동맥류에서 유의하지 않은 동맥류 성장을 나타냈으며(p=0.28), 스텐트된 그룹보다 바이탈 코일링된 그룹(60.1 mm3 ± 31.1mm3 대 20.5 mm3 ± 20.6 mm3; p = 0.002).
탈세포화된 동맥류의 신생내막에서 세포-트레이서-양성 세포의 양은 7일째 FU에서 스텐트- 또는 코일-처리된 그룹들 간에 유의하게 다르지 않았지만(p=0.8) 21일째 FU에서 스텐트 래트에서 유의하게 더 높았다(도 4; p = 0.04). 중요한 동맥류-봉합된 래트에서, 7일(p=1.0) 또는 21일(도 5) FU(p=0.66)에서 유의한 차이는 나타나지 않았다. 7일 FU에서의 탈세포화된 동맥류에서, 코일 처리군에 비해 스텐트-처리된 스텐트의 혈전에 유의하게 더 많은 세포-트레이서-양성 세포가 남아있었다(p=0.01). 이러한 차이는 7일 FU에서 중요한 동맥류에서는 관찰되지 않았다. 탈세포화에 대한 세포-추적자-양성 세포의 비율에 대해, 뿐만 아니라 7일째 및 21일째 FU에 대한 바이탈 코일 및 스텐트된 동맥류의 비율에 대해서는 표 1을 참조한다. 폰 빌레브란트 인자(F8)에 대한 역염색은 각 래트의 신생내막의 내피 세포에서 수행되었다(도 6).
수술 시술의 평균 지속 시간은 코일링 그룹의 경우 119.1 ± 21.3 분이었고, 스텐트 그룹의 경우 154.1 ± 30.2 분이었다 (p = 0.001). 동맥류 봉합사의 바늘 수도 코일 (15.6 ± 2.9 바늘)과 스텐트 그룹 (11.3 ± 1.1)에 대해 크게 달랐습니다 (p = 0.000002).
그림 1: 실험 설정의 순서도. 총 35마리의 동물을 조작하고 권취 또는 스텐트 그룹으로 무작위화하였다. 스텐트 그룹의 두 동물은 수술 후 즉시 사망했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 코일 및 스텐트 색전술 중 동맥류의 수술 중 사진 . (A)는 복부 쥐 대동맥류(*)에 봉합된 측벽 동맥류(#)를 묘사합니다. 동맥류 봉합사를 완료하기 위해 마지막 단일 스티치를 수행하기 전에 동맥류에 도입 된 코일 장치에 유의하십시오. 동맥 절제술의 왼쪽에있는 분홍빛이 도는 염색 (화살표)에 주목하여 세포 추적기의 올바른 분포를 나타냅니다. (B) A에서와 동일한 설정으로, 스텐트 장치가 이미 제자리에 있음을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 31마리의 동물에 대한 거시적 사후 측정. 동맥류 부피 (mm3)는 이식 전과 후속 조치에서 문서화되었으며, y 축을 따라 표현되었습니다. (A) 기준선 (탈세포화), (B) 후속 조치 (탈세포화), (C) 기준선 (바이탈), (D) 후속 조치 (바이탈). 7일과 21일에 대한 데이터가 풀링됩니다. ** p < 0.01. 값은 사분위수 범위를 갖는 중앙값으로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 21일째에 스텐트-처리된 탈세포화된 동맥류의 예시적인 이미지. 우측, 항α-SMA 모노클로날 동맥류의 이미지 개요, 세포-고갈 동맥류(2배 배율)가 도시되어 있고; 스케일 바 = 150 μm. 왼쪽, DAPI로 역염색; 적혈구는 세포-트레이서-양성 (A) 동맥류 벽에서, (B) 혈전에서, (C) 잔류 염색되었지만 퇴색된 세포-신인티마에서의 트레이서-양성 세포, 및 (D) 인접한 혈관 복합체에서. 스케일 바 = 100 μm (A-D). 단일 화살표는 동맥류 벽을 표시하고 이중 화살표는 부모 동맥을 표시합니다. 약어: DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; α-SMA = α-평활근 액틴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 21일째에 코일-처리된 바이탈 동맥류의 예시적인 이미지. 우측에는 항α-SMA 모노클로날 항진, 세포-풍부 동맥류(2배 배율)의 이미지 개요가 도시되어 있고; 스케일 바 = 150 μm. 왼쪽, DAPI로 역염색; 적혈구는 세포-트레이서-양성 (A) 동맥류 벽에서, (B) 혈전에서, (C) 신생내막에서 다중 양성 세포, 및 (D) 인접한 혈관 복합체에서. 스케일 바 = 100 μm (A-D). 단일 화살표는 동맥류 벽을 표시하고 이중 화살표는 부모 동맥을 표시합니다. 약어: DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; α-SMA = α-평활근 액틴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: F8 염색으로부터의 40배 배율 . #은 혈전 형성, *신생내막, 및 § 동맥류 오리피스 아래의 내막 측을 묘사한다. 내피 층상은 신생내막의 내막 층에서 보라색 염색으로 나타남에 주목한다. 스케일 바 = 175 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| DAPI/CM-딜 염료 (%) | 코일 | 스텐트 | |||
| 7 일째 | 21 일째 | 7 일째 | 21 일째 | ||
| 탈세포 파우치 | 네오인티마 | 68.00% | 7.70% | 72.20% | 34.30% |
| 부모 동맥 | 75.50% | 10.50% | 76.50% | 35.60% | |
| 혈전 | 7.50% | 5.50% | 25.20% | 8.30% | |
| 동맥류 벽 | 12.20% | 8.50% | 11.70% | 9% | |
| 중요한 파우치 | 네오인티마 | 56.70% | 11.50% | 58.20% | 15.00% |
| 부모 동맥 | 60.00% | 24.20% | 81.50% | 26.00% | |
| 혈전 | 62.00% | 26.20% | 71.20% | 23.70% | |
| 동맥류 벽 | 13.20% | 10.20% | 13.50% | 11.60% |
표 1: 신생내막, 모동맥, 혈전 및 동맥류 벽에서 세포-추적자 양성 세포의 비율. 값은 7일째와 21일째에 코일 및 스텐트 치료를 위한 탈세포화 및 필수 파우치에 대한 백분율로 표시됩니다. 약어: DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌.
비디오 1 : 쥐 대동맥의 복부 부분에 세포 추적기 주사. 이 기술은 클램핑된 래트 대동맥으로의 원포인트 주입을 사용하여 수행된다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구는 신생내막 형성이 동맥류 복합체의 모 동맥에서 기원 한 내피 세포를 통해 매개되지만 중요한 동맥류의 동맥류 벽에서 유래 된 세포의 모집에 의해 뒷받침된다는 것을 보여줍니다. 그럼에도 불구하고, 동맥류 치유에서 순환 전구 세포의 역할은 논란의 여지가있는12,13 가지로 남아 있습니다. 전반적으로, 31마리의 수컷 루이스 래트가 이 조사에 포함되었다; 4 명만이 조기에 사망했습니다 (12.9 % 사망률).
후속 내피-내피 접촉을 촉진하는 외과적 클리핑과는 달리, 혈관 내 치료의 성공은 지연된 생물학적 반응에 의존한다. 유동-전환, 생체활성 혈관내 혈관 장치, 또는 발광 세포 내 기반 요법과 같은 새로 개발된 기술들은 혈관내 치료 장치(14,15)와 관련하여 주목할 만하다. 이러한 맥락에서, 증거는 성공적인 동맥류 박멸에서의 치료 성공이 동맥류 벽 자체로부터의 생물학적 반응과 부가적으로 관련되어 있음을 보여준다 5,16,17.
최근 연구에 따르면 혈전 조직과 신생내막 형성은 혈관 내 치료 후 동맥류 치유에서 동시 과정이라고 제안했습니다. 동맥류 치유와 관련된 두 과정 모두 동맥류 복합체의 인접한 혈관과 동맥류 벽 자체의 움직이는 세포에 의존합니다. 또한, 두 과정 모두 코일 또는 스텐트와 같은 혈관 내 장치의 존재에 의해 촉진됩니다. Grüter et al.이 입증했듯이,5 혈전 조직 세포는 주로 두 가지 유형의 혈관 내 치료 접근법에 대해 인접한 혈관으로부터 유래한다. 여기서, 코일 처리 동맥류에서의 신생내막 형성은 주로 혈관벽으로부터의 세포 이동에 의존하는 반면, 인접한 혈관은 스텐트 처리 동맥류에서 일차 기증자 역할을 했다.
헬싱키 쥐 미세 외과 측벽 동맥류 모델을 사용하여 연구 질문을 수립하고 확장하는 공통점은 수년에 걸쳐 관찰 될 수 있습니다. 첫째, 탈세포화되고 따라서 퇴화된 동맥류는 세포가 풍부한 생명동맥류(9)보다 성장과 파열되기 쉽다. 또한, 코일 처리는 고도로 퇴화 된 파우치보다 중요한 파우치를 사용한 동맥류 치료에서 더 많은 성공을 보였다8. 더욱이, 세포 이식은 심지어 고도로 퇴화된 동맥류(14)에서도 충분한 동맥류 치유를 제공하였다. 이 동맥류 모델에서 상이한 혈관내 장치를 비교하면, 스텐트 치료는 코일 치료 단독(11)보다 분명히 우수하였다. 따라서, 부모 동맥 및 동맥류 벽(5)으로부터 코일링되고 스텐트된 동맥류에서 상이한 세포 모집 모드를 평가하면서, 신생내막 형성이 주로 모 동맥으로부터의 내피 세포, 동맥류 벽으로부터의 세포, 또는 심지어 순환 전구 세포에 의해 촉발되는지에 대한 주요 의문이 남아있다. 신생내막 형성을 촉발시키는 순환 전구 세포에 대한 최근의 발견은 논란의 여지가있는 12,13,15,18.
이전에 보고된바와 같이 동맥류 성장, 혈전 형성 및 벽 염증에 대한 에스트로겐의 혼란스러운 영향을 피하기 위해 수컷 쥐만이 이 시리즈에 포함되었다. 형광 혈관조영술20 및 활력 징후 모니터링을 통한 정교한 다중 모드 모니터링 외에도, 우리는 특정 세포 추적기를 사용하여 부모 동맥을 표지하여 혈류의 순환 세포로부터 유래 된 세포를 이웃 세포의 진정한 이동에서 파생 된 세포로 분화시켰다. 그럼에도 불구하고, 우리는 시간과 세포 분열에 따른 내피 세포의 신호 강도의 약간의 퇴색을 배제 할 수는 없지만,이 시점 (7 일과 21 일째)14에서 근섬유아세포의 강한 신호 강도가 연구 결과를 보여 주었음에도 불구하고. 마지막으로,이 동맥류 모델은 혈류 역학 및 자발적 혈전증 또는 동맥류 치유의 속도와 같은 후속 생물학적 과정을 사용했으며, 이는 동맥류21의 측벽 별자리에 의해 크게 영향을받습니다.
이러한 발견에서 입증 된 바와 같이, 동맥류 복합체의 인접한 혈관이 네오 인티마를 형성하는 데 중요한 세포 공급원 역할을한다는 것은 명백합니다. 이러한 발견은 Kallmes et al.에 의해 최근에 발표 된 결과와 강하게 일치하며, 스트럿 두께가 효과적인 내피화의 중요한 동인 인 흐름 전환기에서 벽 할당의 결정 요인임을 보여줍니다. 여기서, 스트럿 두께를 증가시키면 부드러움의 확률이 감소하고, 부모 동맥 벽과의 접촉이 개선되며, 따라서 스트럿(22)을 통한 세포 재구성이 최적화된다. 탈세포화된 동맥류를 가진 래트에서, 동시에 코일링된 그룹에서보다 21일째에 스텐트 그룹에서 유의하게 더 많은 양의 세포-트레이서-양성 내피 세포가 관찰되었다(표 1).
이 발견은 고도로 퇴화 된 동맥류에서도 부모 동맥의 세포가 풍부한 영역에 적용된 스텐트가 세포 운동을위한 안내 구조 역할을하여 신생 내막의 내피 층의 지속적인 내피 내피를 허용하고 진행성 동맥류 치유를 제공한다는 사실에 기인 할 수 있습니다. 첨가제적으로, 7 FU에서의 스텐트와 코일링을 비교하면, 코일 된 동물보다 스텐트 동물의 혈전에서 상당히 많은 양의 세포 추적자 양성 세포가 관찰되었습니다. 따라서, 합리적인 설명은 스텐트 스트럿이 혈전 내의 인접한 혈관으로부터의 세포 이동을 용이하게 한다는 것이다. 코일링과 스텐트를 비교하는 중요한 동맥류에서, 21 일 후 neointima에 대해서도, 7 일째의 혈전 형성에 대해서도, 세포 추적자 양성 세포의 유의 한 차이가 관찰되지 않았습니다. 이전의 발견5와 일치하여, 이것은 건강한 혈관 벽에서 세포 모집을 통한 신생 내막 형성에 대한 지원에 기인 할 수 있습니다.
탈세포화 또는 바이탈 코일 및 스텐트 동맥류에서 21일 후에 혈전에서 세포-트레이서-양성 세포의 양에 유의한 차이가 없는 것은 신생내막이 거의 완전히 봉합되었기 때문이다(23). 따라서 스텐트를 통해서도 혈전으로의 세포 이동은 더 이상 불가능합니다. 스텐트 이식을 수행하는 동안 고려해야 할 중요한 포인트는 스텐트 적용 동안 가능한 의원 성 혈관 파열 또는 동맥 절제술 영역에서 치명적인 협착 형성, 하지에서 잠재적 허혈 발생을 포함한다. 허혈을 예방하려면 스텐트 이식 및 봉합 동맥 절제술 후 의원 성 협착을 피할 수있을만큼 작은 스텐트를 삽입하기 위해 혈관 분기 옆의 동맥 절제술 부위를 선택하십시오. 또한, 폐쇄 전에, 이 영역을 헤파린화 식염수로 플러시하여 임의의 혈전형성 성분의 존재로 인한 임의의 잠재적인 색전증의 원위 수송을 최소화한다.
이러한 절차에 필요한 재료는 일반적으로 매우 비용 집약적이며 드물며, 그 가용성은 신경 외과24,25의 젊은 거주자에게 중요합니다. 그러나이 모델에서 얻은 풍부한 정보 외에도이 수술을 연습하면 수술 기술을 향상시키는 데 도움이됩니다.
결론적으로, 헬싱키 래트 미세외과적 측벽 동맥류 모델에서 혈관내 처리된 동맥류의 생물학적 치유 반응은 인접한 혈관 복합체로부터의 세포 이동에 의존한다. 그것은 또한 중요하고 건강한 동맥류 벽에서 세포의 모집에 의해 지원됩니다. 그러나, 탈세포화되고, 따라서, 고도로 퇴화된 동맥류에서, 부모 세포-풍부 동맥은 신내막의 형성을 위한 세포의 가장 중요한 공급원이며, 이는 인접한 세포-풍부 조직을 동맥류 오리피스에 연결하는 스텐트와 같은 혈관 내 장치에 의해 촉진된다. 이 발견을 임상 환경으로 번역하는 것을 돕기 위해, 고도로 퇴화 된 동맥류는 세포가 풍부한 건강한 혈관 영역에 배치 된 스캐폴드를 통해 치료할 수 있습니다. 코일 색전술만으로도 대부분 건강한 혈관 벽을 가진 동맥류에 충분할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 제시된 연구의 설계 및 수행에 대한 전적인 책임이 있으며 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 Alessandra Bergadano, DVM, PhD에게 장기적인 동물 건강에 대한 헌신적 인 감독에 감사드립니다. 이 연구는 연구위원회, Kantonsspital Aarau, Aarau, Switzerland 및 Swiss National Science Foundation SNF (310030_182450)의 연구 기금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Atipamezol | Arovet AG, Switzerland | ||
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bicycle spotlight | any other | ||
| Board (20 x 10 cm) | any other | ||
| Buprenorphine | Indivior, Switzerland | 1014197 | |
| Camera | Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan | ||
| Cannula (27-1/2 G) | any other | ||
| Cell count software | Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| CellTracker CM-Dil dye | ThermoFisher SCIENTIFIC, USA | C7000 | |
| Coil-Device | Styker, Kalamazoo, MI, USA | 2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter | |
| Desinfection | any other | ||
| Eye-lubricant | any other | ||
| Fentanyl | Sintetica, S.A., Switzerland | 98683 | any generic |
| Flumazenil | Labatec-Pharma, Switerzland | ||
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | any generic |
| Fluorescence microscope | Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8 | ||
| Foil mask | any other | ||
| Glucose (5%) | any other | ||
| Heating pad | Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England | any other | |
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | any generic |
| Isoflurane | any generic | ||
| Longuettes | any other | ||
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | any generic |
| Medetomidine | Virbac, Switzerland | QN05CM91 | |
| Micro needle holder | any other | ||
| Midazolam | Roche, Switzerland | ||
| Monitoring-system | Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States | ||
| Needle holder | any other | ||
| O2-Face mask | any other | ||
| Operation microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | any other | |
| Oxygen | any other | ||
| Rectal temperature probe | any other | ||
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | any other |
| Small animal shaver | any other | ||
| Smartphone | any other | ||
| Sodium dodecyl sulfate (0.1%) | Sigma-Aldrich | 11667289001 | |
| Soft feed | Emeraid Omnivore | any generic | |
| Soft tissue forceps | any other | ||
| Soft tissue spreader | any other | ||
| Stainless steel sponge bowls | any other | ||
| Stent-Device | Biotroni, Bülach, Switzerland | modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter | |
| Sterile micro swabs | any other | ||
| Straight and curved microforceps | any other | ||
| Straight and curved microscissors | any other | ||
| Straight and curved forceps | any other | ||
| Surgery drape | any other | ||
| Surgical scissors | any other | ||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | any other | ||
| Tape | any other | ||
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T | temporary |
References
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