Summary
We voerden een éénpunts, lipofiele cel-tracer-injectie uit om endotheelcellen te volgen, gevolgd door een arteriotomie en hechting van zijwandaneurysma's op de abdominale rataorta. Neointima-vorming leek afhankelijk van de bovenliggende slagader in gedecellulariseerde aneurysmata en werd bevorderd door de rekrutering uit aneurysmawandcellen in vitale celrijke wanden.
Abstract
Microchirurgisch knippen creëert een daaropvolgende barrière van bloedtoevoer naar intracraniale aneurysma's, terwijl endovasculaire behandeling afhankelijk is van neointima- en trombusvorming. De bron van endotheelcellen die de endoluminale laag van de neointima bedekken, blijft onduidelijk. Daarom was het doel van deze studie om de oorsprong van neo-intima-vormende cellen na celtracerinjectie te onderzoeken in het reeds gevestigde Helsinki rat microchirurgische zijwandaneurysmamodel.
Zijwandaneurysma's werden gemaakt door gedecellulariseerde of vitale arteriële zakjes end-to-side aan de aorta te hechten bij mannelijke Lewis-ratten. Vóór arteriotomie met aneurysma-hechting werd een cel-traceretinjectie met CM-Dil-kleurstof uitgevoerd in de geklemde aorta om endotheelcellen in het aangrenzende vat te labelen en hun proliferatie tijdens follow-up (FU) te volgen. Behandeling gevolgd door coiling (n = 16) of stenting (n = 15). Bij FU (7 dagen of 21 dagen) ondergingen alle ratten fluorescentieangiografie, gevolgd door aneurysma-oogst en macroscopische en histologische evaluatie met immunohistologische celtellingen voor specifieke interessegebieden.
Geen van de 31 aneurysma's was gescheurd bij follow-up. Vier dieren stierven vroegtijdig. Macroscopisch residuele perfusie werd waargenomen bij 75,0% opgerold en 7,0% van de gestenteerde ratten. De hoeveelheid cel-tracer-positieve cellen was significant verhoogd in gedecellulariseerde stents in vergelijking met opgerolde aneurysma's met betrekking tot trombus op dag 7 (p = 0,01) en neointima op dag 21 (p = 0,04). Er werden geen significante verschillen gevonden in trombus of neointima in vitale aneurysma's.
Deze bevindingen bevestigen slechtere genezingspatronen in opgerolde in vergelijking met gestenteerde aneurysma's. Neointima-vorming lijkt vooral afhankelijk van de bovenwortel in gedecellulariseerde aneurysma's, terwijl het wordt ondersteund door de rekrutering van aneurysmawandcellen in vitale celrijke wanden. In termen van vertaling kan stentbehandeling meer geschikt zijn voor sterk gedegenereerde aneurysma's, terwijl coiling alleen voldoende kan zijn voor aneurysma's met meestal gezonde vaatwanden.
Introduction
Subarachnoïdale bloeding veroorzaakt door de breuk van een intracranieel aneurysma (IA) is een verwoestende neurochirurgische aandoening geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit 1,2,3,4. Naast microchirurgisch knippen, dat direct endotheel-naar-endotheelcontact biedt, hebben endovasculaire apparaten de afgelopen decennia steeds belangrijker geworden voor de behandeling van gescheurde en incidenteel ontdekte IA's. De genezingsreactie bij endovasculair behandelde IA's hangt voornamelijk af van neointimavorming en trombusorganisatie. Beide zijn synergetische processen, afhankelijk van de celmigratie van het aangrenzende vat en de aneurysmawand. 5 Tot op heden blijft de oorsprong van endotheelcellen in neo-intimavorming van endovasculair behandelde aneurysma's onduidelijk. Er is een voortdurend debat in de literatuur over de bron waaruit neo-intima-vormende cellen worden gerekruteerd.
Door gebruik te maken van een cel-tracer injectie van CM-Dil kleurstof (zie de Tabel van Materialen) in de abdominale aorta van ratten, wilden we de rol van endotheelcellen, afkomstig uit de ouderslagader, in neointimavorming op twee verschillende FU-tijdstippen (dag 7 en dag 21) analyseren (figuur 1). Een voordeel van het model is de directe lokale cel-tracer incubatie in vivo in een bovenliggende slagader voorafgaand aan de aneurysma hechting, waardoor FU op latere tijdstippen mogelijk is. In vivo injectietechnieken, zoals cell-tracer incubatie, zijn niet beschreven in de literatuur. Een voordeel van deze techniek is de directe, éénpunts, intraoperatieve, in vivo injectie, die het model robuust en reproduceerbaar maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Veterinaire ondersteuning werd uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen. De experimenten werden goedgekeurd door de Lokale Ethische Commissie, Zwitserland (BE 60/19). De ARRIVE-richtlijnen en 3R-principes zijn strikt gevolgd 6,7. Eenendertig mannelijke Lewis-ratten, 12 weken oud en met een gewicht van 492 ± 8 g, werden opgenomen. Huisvest alle ratten bij een kamertemperatuur van 23 °C en een licht/donkercyclus van 12 uur. Zorg voor gratis toegang tot water en pellets. Statistische analyses zijn uitgevoerd met behulp van de niet-parametrische Wilcoxon-Mann-Whitney U-test. Waarschijnlijkheidswaarden (p) van ≤ 0,05 en/of ≤ 0,01 werden als significant beschouwd.
1. Preoperatieve fase-algemene voorbereiding en anesthesiologische aspecten
- Randomiseer ratten in spoel- of stentbehandelingsgroepen (figuur 2) via een webgebaseerd randomisatiesysteem. Voer nu een preoperatief klinisch onderzoek uit van alle dieren die gepland zijn voor een operatie naast een rustige, aseptische operatiekamer met een kamertemperatuur van 23 ± 3 °C. Analyseer het gedrag van de dieren en inspecteer de slijmvliezen en turgor als onderdeel van het preoperatieve klinische onderzoek.
- Noteer het gewicht van elk dier.
- Incubeer voorafgaand aan de operatie de arteriële zakjes van donorratten in 0,1% natriumdodecylodylsulfaat gedurende 10 uur bij 37 °C om gedecellulariseerde aneurysma's te verkrijgen8. Verzamel deze zakjes van donordieren een paar dagen voor de operatie.
- Bereid de volledige lengte van de abdominale aorta voor met microscisors en een tang en breng 6-0 niet-absorbeerbare ligaturen aan met een interval van 3-4 mm.
- Direct vitale aneurysma's intraoperatief genereren door een eerder geligeerd arterieel vatzakje uit het thoracale deel van een donordier9. Voer thoracotomie uit met een schaar en chirurgische tang op het aangegeven FU-tijdstip en laat het vatzakje op de gewenste lengte los.
- Implanteer de buidel direct in de ontvanger en oogst het aneurysma van het donordier voor verdere macroscopische analyse en histologische verwerking.
- Voor anesthesie-inductie plaatst u alle ratten in een schone doos voorzien van zuurstof (O2) tot bewustzijnsverlies na 5-10 minuten. Verdoving ratten met een subcutane (SC) injectie van een mengsel van fentanyl 0,005 mg/kg, medetomidine 0,15 mg/kg en midazolam 2 mg/kg.
OPMERKING: Dit zorgt voor een chirurgisch vlak van ten minste 45 minuten. - Controleer de diepte van de anesthesie door de afwezigheid van de pedaalontwenningsreflex.
- Plaats de ratten in rugligging en scheer het thoracoabdominale deel met een elektrisch scheerapparaat.
- Fixeer de 4 poten van de ratten met tape op een bord, bedekt met een verwarmingskussen dat is aangesloten op een automatisch regulerende rectale sonde. Plaats de rectale sonde in de anus van de rat om de gewenste temperatuur van 37 °C te handhaven met behulp van het verwarmingskussen.
- Installeer nu een sensor op het rechterachterbeen die is aangesloten op een geautomatiseerd systeem voor het intraoperatief controleren van vitale functies.
- Bedek de neus en mond van de rat met een gezichtsmasker. Als langdurige anesthesie nodig is, start isofluraan (1,0-2,0% getitreerd om te effecteren in 100% O2).
- Desinfecteer het chirurgische veld met povidon-jodium of afwisselende ontsmettingsmiddelen en drapeer het chirurgische veld op een steriele manier.
- Breng voor perianesthetische zorg een steriel oogheelkundig glijmiddel aan op de ogen en bedek ze met een ondoorzichtig foliemasker om uitdroging en schade door de chirurgische lamp te voorkomen.
- Voer tijdens de operatie continu zuurstof via het gezichtsmasker, controleer de lichaamstemperatuur en geef warmte met behulp van een verwarmingskussen, waardoor normothermie wordt gehandhaafd.
- Controleer continu andere vitale functies (opgezette pols en ademhaling, hart- en ademhalingsfrequentie en zuurstofverzadiging).
2. Operatieve fase - cel-tracer injectie
OPMERKING: De gedetailleerde chirurgische benadering in het Helsinki rat microchirurgische zijwandaneurysma model9 en technieken voor coil- en stent-implantatie worden elders beschreven 8,10,11.
- Bewaar de fluorescerende lipofiele celtracer de hele tijd bij ≤ -20 °C, beschermd tegen licht.
- Voer de operatie uit door de aorta van de rat en de ader van de caval voor te bereiden, gevolgd door de scheiding van beide, evenals proximale en distale tijdelijke klemming van de aorta.
OPMERKING: Deze techniek is eerder beschreven9.- Klem de proximale en distale delen van de aorta vast met twee tijdelijke titanenklemmen.
- Plaats een microswab met paarse vulling elk onder de proximale en distale delen van de aorta voor een betere visualisatie van de slagader.
- Bescherm nu de buik met nat gaas.
- Los op de dag van de operatie 2 μL van de celtracer op door te pipetteren in 1 ml fosfaatbuffered saline (PBS).
- Breng het mengsel over in een spuit van 1 ml met een steriele canule van 27-1/2 g (0,4 x 13 mm).
OPMERKING: Zorg ervoor dat u blootstelling aan licht vermijdt tijdens het uitvoeren van stap 2.5 en 2.6. - Doe het licht in de operatiekamer uit. Terwijl u onder een microscoop kijkt, voert u de eenpuntsinjectie uit in het middelste ventrale deel van de aorta met behulp van een microtang en injecteert u zorgvuldig 1 ml gehepariniseerde 0,9% zoutoplossing.
- Injecteer de celtracer voorzichtig (video 1) en schakel ook onmiddellijk de operatiemicroscoop uit. Nogmaals, bescherm de buik met nat gaas.
- Laat de kleurstof minstens 15 min incuberen. Schakel na de incubatietijd de microscoop en de verlichting van de operatiekamer in.
- Voer de longitudinale arteriotomie en hechting van het aneurysma uit, zoals elders beschreven11.
- Gebruik microforceps en microscisors om de arteriotomie uit te voeren, zodat de lengte het gemiddelde is van de diameter van het geoogste aneurysma (stap 1.3). Om de juiste lengte te garanderen, plaatst u het aneurysma naast de aorta voordat u arteriotomie uitvoert. Hecht het aneurysma met 8-10 enkele hechtingen met behulp van een niet-absorbeerbare 10-0 hechting en verwijder voorzichtig de tijdelijke klemmen - die distaal beginnen - onder continue irrigatie met heparinized zoutoplossing. Sluit de wond op een gelaagde manier. Let op, gebruik een coil packing dichtheid van 1 cm.
OPMERKING: De techniek van coil- of stent-implantatie is elders beschreven 8,10.
- Gebruik microforceps en microscisors om de arteriotomie uit te voeren, zodat de lengte het gemiddelde is van de diameter van het geoogste aneurysma (stap 1.3). Om de juiste lengte te garanderen, plaatst u het aneurysma naast de aorta voordat u arteriotomie uitvoert. Hecht het aneurysma met 8-10 enkele hechtingen met behulp van een niet-absorbeerbare 10-0 hechting en verwijder voorzichtig de tijdelijke klemmen - die distaal beginnen - onder continue irrigatie met heparinized zoutoplossing. Sluit de wond op een gelaagde manier. Let op, gebruik een coil packing dichtheid van 1 cm.
3. Postoperatieve fasemonitoring en analgetische zorg
- Draai aan het einde van de operatie de anesthesie om met een SC-injectiemengsel van buprenorfine 0,05 mg / kg, atipamezol 0, 75 mg / kg en flumazenil 0, 2 mg / kg. Laat elk geopereerd dier herstellen in een schone kooi totdat het volledig wakker is en warm, indien nodig, met een verwarmingslamp.
- Dien gedurende 3 dagen 1 mg/kg meloxicam (één injectie of orale toepassing per dag) en buprenorfine (0,05 mg/kg viermaal daags) SC toe. Geef buprenorfine 's nachts continu in het drinkwater met dezelfde dosering: 6 ml buprenorfine 0,3 mg/ml, 360 ml drinkwater, 10 ml 5% glucose.
- In de onmiddellijke postoperatieve fase, huisvest elk dier in een enkele kooi voor bescherming. Hergroepeer de dieren na 24 uur.
- Als een rat na sc-injectie onrustig of agressief gedrag vertoont, dien dan overdag buprenorfine toe in het drinkwater.
- Zorg voor zacht voer op de vloer van de kooi om het voeren en herstel postoperatief te ondersteunen.
- Observeer en verzorg alle dieren volgens het welzijns- en pijnscoreblad.
- Dien indien nodig rescue analgesia SC (meloxicam 1 mg/kg en 0,05 mg/kg buprenorfine) toe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In totaal werden 31 dieren opgenomen in de laboratoriumomgeving: 27 ratten werden opgenomen in de uiteindelijke statistische analyse; 4 ratten stierven vroegtijdig (12,9% sterftecijfer). Intraoperatief was de opgezette adem significant (p = 0,03) verminderd bij stent- (12,9 μm ± 0,7) in vergelijking met met spoel behandelde (13,5 μm ± 0,6) ratten. Fluorescentieangiografie werd uitgevoerd voor elke rat aan het einde van de laatste FU. Reperfusie was geïndiceerd bij alle 6 met spoel behandelde dieren, terwijl reperfusie werd waargenomen bij slechts 12,5% van de 8 met stent behandelde dieren.
Gepoolde baseline aneurysmavolumes voor dag 7 en dag 21 verschilden niet significant (noch voor gedecellulariseerde (p = 0,9) noch vitale (p = 0,1) aneurysma's) tussen de coil- of stentbehandelingsgroepen (figuur 3). Gepoolde FU-volumes voor gedecellulariseerde aneurysma's vertoonden een niet-significante aneurysmagroei in opgerolde in vergelijking met de gestenteerde aneurysma's (p = 0,28), significant groter in de vitale opgerolde groep dan de gestenteerde groep (60,1 mm3 ± 31,1 mm3 vs. 20,5 mm3 ± 20,6 mm3; p = 0,002).
Hoeveelheden cel-tracer-positieve cellen in de neointima van gedecellulariseerde aneurysma's verschilden niet significant tussen de met stent of spoel behandelde groepen op dag 7 FU (p = 0,8), maar waren significant hoger bij gestenteerde ratten op dag 21 FU (figuur 4; p = 0,04). Bij vitale aneurysma-gehechte ratten werden geen significante verschillen opgemerkt na 7 dagen (p = 1,0) of 21 dagen (figuur 5) FU (p = 0,66). Bij gedecellulariseerde aneurysma's na 7 dagen FU bleven significant meer cel-tracer-positieve cellen achter in de trombus van de met stent behandelde groep in vergelijking met de met spoel behandelde groep (p = 0,01). Dit verschil werd niet waargenomen in vitale aneurysma's na 7 dagen FU. Zie tabel 1 voor het aandeel cel-tracer-positieve cellen voor gedecellulariseerde, evenals vitale opgerolde en gestenteerde aneurysma's voor dag 7 en dag 21 FU. Counterstaining voor von Willebrand-factor (F8) werd uitgevoerd in de endotheelcellen van de neointima van elke rat (figuur 6).
De gemiddelde duur van de chirurgische ingreep was 119,1 ± 21,3 min voor de coilinggroep vergeleken met 154,1 ± 30,2 min voor de stentgroep (p = 0,001). Het aantal hechtingen voor aneurysmahechtingen verschilde ook significant (p = 0,000002) voor de spoel (15,6 ± 2,9 steken) en stentgroepen (11,3 ± 1,1).
Figuur 1: Stroomschema van de experimentele setting. In totaal werden 35 dieren geopereerd en gerandomiseerd naar coiling- of stentinggroepen. Twee dieren van de stentgroep stierven in het onmiddellijke postoperatieve beloop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Intraoperatieve foto's van aneurysma's tijdens spoel- en stentembolisatie. (A) toont een zijwand-aneurysma (#), gehecht aan de abdominale rat aorta (*). Let op het spoelapparaat dat in het aneurysma is geïntroduceerd voordat de laatste enkele steek wordt uitgevoerd om de aneurysma-hechting te voltooien. Let op de roze kleuring (pijl) aan de linkerkant van de arteriotomie, die de juiste verdeling van de celtracer aangeeft. (B) Dezelfde instelling als in A, met vermelding van de stentinrichting die zich reeds in situ bevindt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Macroscopische postmortale metingen bij 31 dieren. Aneurysmavolumes (mm3) werden gedocumenteerd voorafgaand aan implantatie en bij follow-up, weergegeven langs de y-as. (A) Baseline (gedecellulariseerd), (B) follow-up (gedecellulariseerd), (C) baseline (vitaal), (D) follow-up (vitaal). Gegevens voor dag 7 en dag 21 worden samengevoegd. ** p < 0,01. Waarden worden uitgedrukt als medianen met interkwartielbereiken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeeldbeeld van een met stent behandeld gedecellulariseerd aneurysma op dag 21. Rechts wordt een beeldoverzicht getoond van een monoklonaal antiα-SMA, celarm aneurysma (2-voudige vergroting); schaalbalk = 150 μm. Links, counterstained met DAPI; erytrocyten zijn cel-tracer-positieve (A) in de aneurysmawand, (B) in de trombus, (C) resterende gekleurde maar vervaagde cel-tracer-positieve cellen in de neointima en (D) in het aangrenzende vatencomplex. Schaalbalken = 100 μm (A-D). Enkele pijl markeert de aneurysmawand, dubbele pijl de bovenliggende slagader. Afkortingen: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; α-SMA = α-gladde spier actine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorbeeldbeeld van een met spoel behandeld vitaal aneurysma op dag 21. Rechts wordt een beeldoverzicht van een monoklonaal antiα-SMA, celrijk aneurysma (2-voudige vergroting) getoond; schaalbalk = 150 μm. Linkerkant, counterstained met DAPI; rode bloedcellen zijn cel-tracer-positief (A) in de aneurysmawand, (B) in de trombus, (C) meerdere positieve cellen in de neointima en (D) in het aangrenzende vatencomplex. Schaalbalken = 100 μm (A-D). Enkele pijl markeert de aneurysmawand, dubbele pijl de bovenliggende slagader. Afkortingen: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; α-SMA = α-gladde spier actine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: 40-voudige vergroting van F8-kleuring. # toont de trombusvorming, * de neointima en § de endoluminale zijde onder de aneurysma-opening. Let op de endotheellagen die worden weergegeven als paarse kleuring in de endoluminale laag van de neointima. Schaalbalk = 175 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| DAPI/CM-Dil kleurstof (%) | Spoel | Stent | |||
| Dag 7 | Dag 21 | Dag 7 | Dag 21 | ||
| Gedecellulariseerde zakjes | Neointima | | 68.00% | 7.70% | 72.20% | 34.30% |
| Ouderslagader | 75.50% | 10.50% | 76.50% | 35.60% | |
| Trombus | 7.50% | 5.50% | 25.20% | 8.30% | |
| Aneurysma muur | 12.20% | 8.50% | 11.70% | 9% | |
| Vitale zakjes | Neointima | | 56.70% | 11.50% | 58.20% | 15.00% |
| Ouderslagader | 60.00% | 24.20% | 81.50% | 26.00% | |
| Trombus | 62.00% | 26.20% | 71.20% | 23.70% | |
| Aneurysma muur | 13.20% | 10.20% | 13.50% | 11.60% |
Tabel 1: Aandeel cel-tracer positieve cellen in neointima, ouderslagader, trombus en aneurysmawand. Waarden worden weergegeven als percentages voor gedecellulariseerde en vitale zakjes voor spoel- en stentbehandeling voor dag 7 en dag 21. Afkorting: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool.
Video 1: Cell-tracer injectie in het abdominale deel van de rat aorta. Deze techniek wordt uitgevoerd met behulp van een éénpuntsinjectie in de geklemde rattenaorta. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie toont aan dat neo-intimavorming wordt gemedieerd via endotheelcellen afkomstig uit de bovenwortel van het aneurysmacomplex, maar wordt ondersteund door de rekrutering van cellen afgeleid van de aneurysmawand in vitale aneurysma's. Niettemin blijft de rol van circulerende voorlopercellen bij de genezing van aneurysma's controversieel12,13. In totaal werden 31 mannelijke Lewis-ratten in dit onderzoek opgenomen; slechts 4 stierven vroegtijdig (12,9% sterfte).
In tegenstelling tot chirurgisch knippen, dat het daaropvolgende endotheel-op-endotheelcontact bevordert, is het succes van endovasculaire behandeling afhankelijk van vertraagde biologische reacties. Nieuw ontwikkelde technieken, zoals flow-diversion, bioactieve endovasculaire apparaten of intraluminale celgebaseerde therapieën, zijn opmerkelijk met betrekking tot endovasculaire behandelingsapparaten14,15. In deze context toont bewijs aan dat het succes van de behandeling bij succesvolle uitroeiing van aneurysma's additief geassocieerd is met de biologische respons van de aneurysmawand zelf 5,16,17.
Recente studies hebben gesuggereerd dat trombusorganisatie en neointima-vorming gelijktijdige processen zijn bij aneurysma-genezing na endovasculaire therapieën. Beide processen die betrokken zijn bij aneurysmagenezing zijn afhankelijk van bewegende cellen uit het aangrenzende vat van het aneurysmacomplex en de aneurysmawand zelf. Verder worden beide processen vergemakkelijkt door de aanwezigheid van endovasculaire apparaten zoals spoelen of stents. Zoals Grüter et al. hebben aangetoond,5 trombus-organiserende cellen zijn voornamelijk afkomstig van het aangrenzende vat voor beide soorten endovasculaire behandelingsbenaderingen. Hier is neointimavorming in met spoel behandelde aneurysma's voornamelijk afhankelijk van celmigratie van de vaatwand, terwijl het aangrenzende vat diende als de primaire donor in met stent behandelde aneurysma's.
Een rode draad in het vaststellen en uitbreiden van onderzoeksvragen met behulp van het Helsinki rat microchirurgische zijwand aneurysma model kon in de loop der jaren worden waargenomen. Ten eerste zijn gedecellulariseerde en daarom gedegenereerde aneurysma's gevoeliger voor groei en breuk dan celrijke vitale aneurysma's9. Verder vertoonde coilbehandeling meer succes bij aneurysmabehandeling met vitale zakjes dan sterk gedegenereerdezakjes 8. Bovendien zorgde celtransplantatie voor voldoende aneurysmagenezing bij zelfs sterk gedegenereerde aneurysma's14. Bij vergelijking van verschillende endovasculaire apparaten in dit aneurysmamodel was de stentbehandeling duidelijk superieur aan coilbehandeling alleen11. Dus, bij het waarderen van de verschillende celrekruteringsmodi in opgerolde en gestenteerde aneurysma's uit de bovenliggende slagader en aneurysmawand5, blijven de belangrijkste vragen of neointimavorming voornamelijk wordt veroorzaakt door endotheelcellen uit de bovenwortel, cellen uit de aneurysmawand of zelfs circulerende voorlopercellen. Recente bevindingen over circulerende voorlopercellen die neointima-vorming veroorzaken, zijn controversieel 12,13,15,18.
Alleen mannelijke ratten werden in deze serie opgenomen om de verstorende effecten van oestrogeen op aneurysmagroei, trombusvorming en wandontsteking te voorkomen, zoals eerder gemeld19. Naast de geavanceerde multimodale monitoring met fluorescentieangiografie20 en monitoring van vitale functies, gebruikten we een specifieke celtracer om de bovenliggende slagader te labelen om cellen afgeleid van circulerende cellen in de bloedbaan te onderscheiden van cellen die zijn afgeleid van echte migratie van naburige cellen. Niettemin kunnen we een lichte vervaging van de signaalintensiteit van de endotheelcellen met tijd en celdeling niet uitsluiten, hoewel studies een sterke signaalintensiteit van myofibroblasten op deze tijdstippen (dag 7 en dag 21) hebben aangetoond14. Ten slotte gebruikte dit aneurysmamodel hemodynamiek en daaropvolgende biologische processen, zoals de snelheid van spontane trombose of aneurysma-genezing, die sterk worden beïnvloed door het zijwandconstellatie van het aneurysma21.
Zoals aangetoond in deze bevindingen, blijft het duidelijk dat het aangrenzende vat van het aneurysmacomplex dient als een belangrijke bron van cellen bij het vormen van een neointima. Deze bevindingen zijn sterk in lijn met de onlangs gepubliceerde resultaten van Kallmes et al., waaruit blijkt dat de dikte van de veerpoot ook een determinant is van wandacpositie in stromingsafleiders, wat een belangrijke drijfveer is voor effectieve endotheelvorming. Hier vermindert het vergroten van de veerpootdikte de kans op malappositie, verbetert het contact met de bovenliggende slagaderwand en optimaliseert daarom de cellulaire reconstructie via stutten22. Bij ratten met gedecellulariseerde aneurysma's werd op dag 21 in de gestenteerde groep een significant hogere hoeveelheid cel-tracer-positieve endotheelcellen waargenomen dan in de opgerolde groep op hetzelfde tijdstip (tabel 1).
Deze bevinding kan worden toegeschreven aan het feit dat stents, toegepast in een celrijk gebied van de bovenliggende slagader in zelfs sterk gedegenereerde aneurysma's, dienen als leidende structuren voor celbewegingen, waardoor continue endotheelbekleding van de endoluminale laag van de neointima mogelijk is en progressieve aneurysmagenezing biedt. Additief, bij vergelijking van stenting en coiling op dag 7 FU, werd een significant hogere hoeveelheid cel-tracer-positieve cellen waargenomen in de trombus van gestenteerde dieren dan in opgerolde dieren. Daarom is een redelijke verklaring dat stentveren gemakkelijk celmigratie uit het aangrenzende vat in de trombus vergemakkelijken. Bij vitale aneurysma's waarbij coiling versus stenting werd vergeleken, noch voor neointima na 21 dagen, noch voor trombusvorming op dag 7, werden significante verschillen in cel-tracerpositieve cellen waargenomen. In lijn met een eerdere bevinding5 kan dit worden toegeschreven aan de ondersteuning van neointimavorming via celrekrutering in gezonde vaatwanden.
De afwezigheid van significante verschillen in de hoeveelheden cel-tracer-positieve cellen in de trombus na 21 dagen in gedecellulariseerde of vitale opgerolde en gestenteerde aneurysma's komt omdat de neointima bijna volledig was afgesloten23. Daarom is zelfs via stents celmigratie in de trombus niet meer mogelijk. Kritieke punten waarmee rekening moet worden gehouden bij het uitvoeren van stentimplantatie zijn een mogelijke iatrogene vaatruptuur tijdens stenttoepassing of kritieke stenosevorming in het gebied van de arteriotomie, met mogelijke ischemieontwikkeling in de onderste ledematen. Om ischemie te voorkomen, kiest u de arteriotomieplaats naast de vaatsplitsing voor het inbrengen van de stent die klein genoeg is om iatrogene stenose na stentimplantatie en hechting arteriotomie te voorkomen. Spoel dit gebied verder vóór sluiting met heparinized zoutoplossing om het distale transport van potentiële emboli te minimaliseren als gevolg van de aanwezigheid van een trombogene component.
Materialen die nodig zijn voor deze procedures zijn meestal extreem kostenintensief en zeldzaam, en hun beschikbaarheid is cruciaal voor jonge bewoners in neurochirurgie24,25. Naast de schat aan informatie die uit dit model wordt verkregen, zal het beoefenen van deze operatie echter helpen de chirurgische vaardigheden te verbeteren.
Concluderend is de biologische genezingsrespons van endovasculair behandelde aneurysma's in het Helsinki rat microchirurgische zijwand aneurysma model afhankelijk van celmigratie uit het aangrenzende vatencomplex. Het wordt bovendien ondersteund door de rekrutering van cellen uit een vitale, gezonde aneurysmawand. Bij gedecellulariseerde en daarom sterk gedegenereerde aneurysma's is de oudercelrijke slagader echter de belangrijkste bron van cellen voor de vorming van een neointima, die wordt vergemakkelijkt door endovasculaire apparaten, zoals stents, die de aangrenzende celrijke weefsels verbinden met de aneurysma-opening. Om deze bevinding te helpen vertalen naar klinische omgevingen, kunnen sterk gedegenereerde aneurysma's worden behandeld via steigers die in celrijke gezonde vaatregio's worden geplaatst. Spoelembolisatie alleen kan voldoende zijn voor aneurysma's met meestal gezonde vaatwanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs zijn als enige verantwoordelijk voor het ontwerp en de uitvoering van de gepresenteerde studie en verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Alessandra Bergadano, DVM, PhD, voor de toegewijde supervisie op de gezondheid van dieren op de lange termijn. Dit werk werd ondersteund door de onderzoeksfondsen van de Research Council, Kantonsspital Aarau, Aarau, Zwitserland, en de Zwitserse nationale wetenschappelijke stichting SNF (310030_182450).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Atipamezol | Arovet AG, Switzerland | ||
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bicycle spotlight | any other | ||
| Board (20 x 10 cm) | any other | ||
| Buprenorphine | Indivior, Switzerland | 1014197 | |
| Camera | Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan | ||
| Cannula (27-1/2 G) | any other | ||
| Cell count software | Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| CellTracker CM-Dil dye | ThermoFisher SCIENTIFIC, USA | C7000 | |
| Coil-Device | Styker, Kalamazoo, MI, USA | 2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter | |
| Desinfection | any other | ||
| Eye-lubricant | any other | ||
| Fentanyl | Sintetica, S.A., Switzerland | 98683 | any generic |
| Flumazenil | Labatec-Pharma, Switerzland | ||
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | any generic |
| Fluorescence microscope | Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8 | ||
| Foil mask | any other | ||
| Glucose (5%) | any other | ||
| Heating pad | Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England | any other | |
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | any generic |
| Isoflurane | any generic | ||
| Longuettes | any other | ||
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | any generic |
| Medetomidine | Virbac, Switzerland | QN05CM91 | |
| Micro needle holder | any other | ||
| Midazolam | Roche, Switzerland | ||
| Monitoring-system | Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States | ||
| Needle holder | any other | ||
| O2-Face mask | any other | ||
| Operation microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | any other | |
| Oxygen | any other | ||
| Rectal temperature probe | any other | ||
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | any other |
| Small animal shaver | any other | ||
| Smartphone | any other | ||
| Sodium dodecyl sulfate (0.1%) | Sigma-Aldrich | 11667289001 | |
| Soft feed | Emeraid Omnivore | any generic | |
| Soft tissue forceps | any other | ||
| Soft tissue spreader | any other | ||
| Stainless steel sponge bowls | any other | ||
| Stent-Device | Biotroni, Bülach, Switzerland | modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter | |
| Sterile micro swabs | any other | ||
| Straight and curved microforceps | any other | ||
| Straight and curved microscissors | any other | ||
| Straight and curved forceps | any other | ||
| Surgery drape | any other | ||
| Surgical scissors | any other | ||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | any other | ||
| Tape | any other | ||
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T | temporary |
References
- Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Macdonald, R. L., et al. Preventing vasospasm improves outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: rationale and design of CONSCIOUS-2 and CONSCIOUS-3 trials. Neurocritical Care. 13 (3), 416-424 (2010).
- Wanderer, S., et al. Levosimendan as a therapeutic strategy to prevent neuroinflammation after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Journal of Neurointerventional Surgery. , (2021).
- Wanderer, S., et al. Aspirin treatment prevents inflammation in experimental bifurcation aneurysms in New Zealand White rabbits. Journal of Neurointerventional Surgery. 14 (2), 189-195 (2021).
- Gruter, B. E., et al. Patterns of neointima formation after coil or stent treatment in a rat saccular sidewall aneurysm model. Stroke. 52 (3), 1043-1052 (2021).
- Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. British Journal of Pharmacology. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Tornqvist, E., et al. Strategic focus on 3R principles reveals major reductions in the use of animals in pharmaceutical toxicity testing. PLoS One. 9 (7), 101638 (2014).
- Nevzati, E., et al. Aneurysm wall cellularity affects healing after coil embolization: assessment in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 12 (6), 621-625 (2020).
- Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51071 (2014).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable magnesium stent treatment of saccular aneurysms in a rt model - introduction of the surgical technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56359 (2017).
- Gruter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
- Kadirvel, R., et al. Cellular mechanisms of aneurysm occlusion after treatment with a flow diverter. Radiology. 270 (2), 394-399 (2014).
- Li, Z. F., et al. Endothelial progenitor cells contribute to neointima formation in rabbit elastase-induced aneurysm after flow diverter treatment. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (5), 352-357 (2013).
- Marbacher, S., et al. Intraluminal cell transplantation prevents growth and rupture in a model of rupture-prone saccular aneurysms. Stroke. 45 (12), 3684-3690 (2014).
- Frosen, J., et al. Contribution of mural and bone marrow-derived neointimal cells to thrombus organization and wall remodeling in a microsurgical murine saccular aneurysm model. Neurosurgery. 58 (5), 936-944 (2006).
- Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
- Frosen, J. Smooth muscle cells and the formation, degeneration, and rupture of saccular intracranial aneurysm wall--a review of current pathophysiological knowledge. Translational Stroke Research. 5 (3), 347-356 (2014).
- Fang, X., et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are involved in aneurysm repair in rabbits. Journal of Clinical Neuroscience. 19 (9), 1283-1286 (2012).
- Morel, S., et al. Sex-related differences in wall remodeling and intraluminal thrombus resolution in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurosurgery. , 1-14 (2019).
- Gruter, B. E., et al. Fluorescence video angiography for evaluation of dynamic perfusion status in an aneurysm preclinical experimental setting. Operative Neurosurgery. 17 (4), 432-438 (2019).
- Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (5), 922-938 (2020).
- Ravindran, K., et al. Mechanism of action and biology of flow diverters in the treatment of intracranial aneurysms. Neurosurgery. 86, Suppl 1 13-19 (2020).
- Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
- Morosanu, C. O., et al. Neurosurgical cadaveric and in vivo large animal training models for cranial and spinal approaches and techniques - systematic review of current literature. Neurologia i Neurochirurgia Polska. 53 (1), 8-17 (2019).
- Wanderer, S., et al. Arterial pouch microsurgical bifurcation aneurysm model in the rabbit. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61157 (2020).
