Summary
Infrapatellar fedtpude mesenkymale stamceller (IFP-MSC'er) kan let isoleres fra knæleddets infrapatellære fedtpude. De formerer sig godt in vitro, danner CFU-F-kolonier og differentierer sig til adipogene, kondrogene og osteogene slægter. Heri gives metoden til isolering, udvidelse og differentiering af IFP-MSC'er fra gedekvælningsled.
Abstract
IFP, der findes i knæleddet, fungerer som en lovende kilde til MSC'er. IFP er et let tilgængeligt væv, da det rutinemæssigt resekteres og kasseres under artroskopiske procedurer og knæudskiftningsoperationer. Derudover er dens fjernelse forbundet med minimal morbiditet på donorstedet. Nylige undersøgelser har vist, at IFP-MSC'er ikke mister deres spredningskapacitet under in vitro-ekspansion og har aldersuafhængigt osteogent differentieringspotentiale. IFP-MSC'er har overlegen kondrogen differentieringspotentiale sammenlignet med knoglemarvsafledte MSC'er (BMSC'er) og fedtafledte stamceller (ADSC'er). Selvom disse celler let kan fås fra ældre og syge patienter, er deres effektivitet begrænset. Derfor er det vigtigt at bruge IFP-MSC'er fra raske donorer for at bestemme deres effektivitet i biomedicinske applikationer. Da adgang til en sund menneskelig donor er udfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ til at muliggøre grundlæggende forståelse. Store dyr som hunde, heste, får og geder spiller en afgørende rolle i translationel forskning. Blandt disse kunne geden være en foretrukken model, da gedens kvæleled har den nærmeste anatomi til det menneskelige knæled. Desuden kan gede-IFP opfylde de højere MSC-numre, der er nødvendige for vævsregenereringsapplikationer. Desuden gør lave omkostninger, tilgængelighed og overholdelse af 3R-principperne for dyreforsøg dem til en attraktiv model. Denne undersøgelse demonstrerer en simpel protokol til isolering af IFP-MSC'er fra gedens kvæleled og in vitro-kulturbetingelser for deres ekspansion og differentiering. Den aseptisk isolerede IFP fra geden blev vasket, hakket og fordøjet enzymatisk. Efter filtrering og centrifugering blev de opsamlede celler dyrket. Disse celler var klæbende, havde MSC'er-lignende morfologi og viste bemærkelsesværdig klonogen evne. Endvidere differentierede de sig i adipogene, kondrogene og osteogene slægter, hvilket demonstrerede deres multipotens. Afslutningsvis viser undersøgelsen isolering og udvidelse af MSC'er, som viser potentiale inden for vævsteknik og regenerativ medicin.
Introduction
Mesenkymale stamceller (MSC'er) er en attraktiv kandidat til cellebaserede terapier inden for regenerativ medicin 1,2. De kan høstes fra en række vævskilder såsom knoglemarv, navlestreng, placenta, tandmasse og subkutant fedtvæv3. Da tilgængeligheden af stamceller hos voksne imidlertid er begrænset, og deres isolationsprocedure ofte er invasiv (hvilket resulterer i sygelighed på donorstedet), er det ønskeligt at have en alternativ stamcellekilde, der kan omgå disse udfordringer.
Knæleddet er et depot af forskellige celletyper, såsom infrapatellar fedtpudeafledte MSC'er, synoviale membranafledte MSC'er, synovialvæskeafledte MSC'er, ligamentfibroblaster, artikulære chondrocytter osv. 4,5,6. Disse celler har potentiale til at blive bredt udforsket i muskuloskeletale vævsteknologibaserede undersøgelser. Derfor kan knæleddet være en mulig og pålidelig kilde til flere typer MSC'er. Fedtdepot placeret i knæleddet, kendt som den infrapatellar fedtpude (IFP) eller Hoffas fedtpude, er et lovende og alternativt valg af MSC-depot. IFP er en relativt let tilgængelig og klinisk tilgængelig kilde til MSC'er, da den rutinemæssigt resekteres og kasseres som kirurgisk affald under knæartroskopi eller åben knæoperation. Fjernelse af IFP er forbundet med minimal morbiditet på donorstedet, hvilket også gør det til en attraktiv vævskilde. MSC'er fra IFP (IFP-MSC'er) har en lignende fænotypisk profil, men har forbedret klonogent potentiale sammenlignet med knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller (BM-MSC'er)6 og bedre proliferativ kapacitet sammenlignet med subkutane fedtafledte stamceller (ADSC'er)7. Interessant nok mister IFP-MSC'er sammenlignet med synovialvæskeafledte MSC'er (SF-MSC'er) ikke deres proliferative kapacitet ved sene passager, og fordoblingstiden øges heller ikke ved sene passager. Dette tyder på, at IFP-MSC'er under celleekspansion kan opnå et tilstrækkeligt stort antal celler til in vitro-vævstekniske applikationer uden at gå på kompromis med deres spredningshastighed8. Nylige undersøgelser har også antydet, at IFP-MSC'er har overlegen kondrogen differentieringspotentiale sammenlignet med knoglemarvsafledte MSC'er (BMSC'er) og fedtafledte MSC'er (ADSC'er), sandsynligvis på grund af deres anatomiske nærhed til ledbrusk, hvilket indikerer deres egnethed til bruskvævsteknik 6,7,9,10. Desuden har de også aldersuafhængigt osteogent differentieringspotentiale11. Intraartikulær injektion af IFP-MSC'er har vist sig at reducere smerter og forbedre knæledsfunktioner hos patienter med slidgigt (OA)12,13. Endvidere er der også rapporteret stærke immunsuppressive reaktioner og forbedrede immunmodulerende egenskaber af IFP-MSC'er i nærvær af inflammatoriske cytokiner under patologiske tilstande6.
IFP-MSC'er er en lovende og alternativ kilde til MSC'er; Imidlertid er deres terapeutiske fordel inden for vævsteknik og regenerativ medicin relativt mindre udforsket. De eksisterende undersøgelser af IFP-MSC'er har hovedsageligt udnyttet celler fra menneskelige donorer. Blandt disse har nogle få nylige undersøgelser undersøgt IFP-MSC'er fra raske humane donorer (ikke-gigtpatienter, i alderen 17-60 år)6,14, mens de fleste af undersøgelserne har brugt IFP-MSC'er fra ældre patienter, der gennemgår total knæalloplastik (syge patienter, alder 70-80 år). Da både alder og sygdom vides at ændre stamcellernes normale funktion (reduceret antal og tab af funktionelt potentiale), kan dette potentielt føre til uoverensstemmelser i resultatet af de MSC-baserede studier 7,15,16,17. Derudover giver brugen af IFP-MSC'er fra patienter med patofysiologiske tilstande (f.eks. arthritis og fedme) også svært ved at forstå de grundlæggende egenskaber ved sunde celler in vitro og fungerer dermed som en begrænsende faktor i udviklingen af MSC-baserede terapier. For at overvinde disse problemer er brugen af IFP-MSC'er fra raske donorer afgørende. Da adgang til en sund menneskelig donor er udfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ. I denne henseende er der et par undersøgelser, hvor IFP er blevet isoleret fra mus18. På grund af fedtpudens lille størrelse i normale mus er fedtvæv fra flere dyr imidlertid blevet kombineret for at få nok væv til at udføre detaljerede eksperimentelle procedurer19. Derfor er der behov for en stor dyremodel, der kan opfylde kravet om det højere antal celler og samtidig overholde 3R-principperne (forfine, erstatte og reducere) i dyreforsøg20. Brugen af store dyr har betydelige konsekvenser i translationel forskning. Specifikt inden for muskuloskeletal vævsteknik er en række store dyr som hunde, svin, får, geder og heste blevet undersøgt21. Geder (Capra aegagrus hircus) er et glimrende valg af store dyr, da dets kvæleled har den nærmeste anatomi til det menneskelige knæled22,23,24. Den subchondral knogletrabekulære struktur og subchondral knogletykkelse hos geder ligner mennesker, og andelen af brusk til knogle rapporteres også at være tæt på mennesker21. Derudover er geder blevet bredt tæmmet over hele verden, hvilket gør dem let tilgængelige, når de er skeletmodne. Desuden har lave vedligeholdelsesomkostninger og nem håndtering gjort dem til en attraktiv dyremodel til forskning22.
I denne undersøgelse demonstreres en simpel protokol til isolering af IFP-MSC'er fra kvæleleddet af Capra aegagrus hircus (ged) og in vitro-dyrkningsbetingelser for deres ekspansion og differentiering. De isolerede celler er klæbende, har MSC-lignende morfologi, danner CFU-F (kolonidannende enhedsfibroblast) kolonier og besidder adipogen, kondrogene og osteogene differentieringspotentialer. Derfor viser IFP-MSC'er potentiale som en alternativ kilde til MSC'er til biomedicinske applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er baseret på isolering af IFP-MSC'er fra geder. Geder IFP og blod blev indsamlet fra et lokalt slagteri. Da sådanne vævssamlinger ligger uden for en institutionel dyreetisk komités ansvarsområde, var etisk godkendelse ikke påkrævet.
1. Isolering af IFP-MSC'er fra lårbensleddet i gedeknæet
- Saml gedens femorotibiale led (prøve), der omfatter ~ 15 cm hver af lårbens- og tibialområderne i bagbenene. Prøven anbringes straks i en steriliseret prøveopsamlingsboks og opbevares ved 4 °C med henblik på transport til laboratoriet til videre forarbejdning. Behandl prøverne aseptisk i et biosikkerhedsskab ved hjælp af steriliserede kirurgiske værktøjer under hele proceduren (figur 1, trin 1).
- Prøven anbringes på en 150 mm petriskål og skylles grundigt med autoklaveret fosfatbufret saltvand (PBS) suppleret med antibiotika (5 μg/ml amphotericin B, 200 E/ml penicillin-streptomycin og 50 μg/ml ciprofloxacin) for at undgå kontaminering. Sørg altid for, at prøven holdes hydreret ved hjælp af PBS.
- Undersøg omhyggeligt prøvens anatomiske områder. For at lette adgangen til ledkapslen skal du sørge for, at det ekstra væv fra begge de lange knogler fjernes fuldstændigt (figur 1, trin 2).
- For at opnå dette skal du først holde lårbenets endeflade med den ene hånd og med en skarp saks skære i længderetningen mod leddet. Fjern de omgivende muskler og fedtvæv fra knoglen under processen. Vær forsigtig med, at vævet omkring den umiddelbare ledkapsel forbliver uforstyrret i starten.
- På samme måde skal du lave et andet snit i tibialenden af prøven og fjerne muskler og fedtvæv fra tibialbenet. Sørg for, at begge de lange knogler er helt eksponerede, og at ledkapslen er tydeligt synlig efter dette trin (figur 1, trin 3).
- Lav derefter et snit fra hver side af synoviummembranen for at skære ledleddet op (figur 1, trin 4). Skær knæskallen fri fra både synoviummembranen og patellar ledbånd ved hjælp af en frisk batch steriliseret saks og tang. Opbevar straks den adskilte patella i en petriskål, der indeholder PBS (figur 1, trin 5).
- Fjern hele fedtpuden på den indre overflade af knæskallen ved hjælp af saks og tang og saml fedtpuden i en anden frisk petriskål (figur 1, trin 6). Hak den opsamlede fedtpude ved hjælp af en skalpel. Inkluder andre kirurgiske værktøjer (f.eks. saks eller kirurgiske blade) efter behov for at opnå de mindst mulige fedtstykker/segmenter på ~2-3 mm.
BEMÆRK: God hakning er afgørende for at resultere i et godt udbytte af celler. Hold altid vævet hydreret og lad det ikke tørre på noget tidspunkt i isolationsproceduren. - Det hakkede væv overføres ved hjælp af en spatel til et 50 ml centrifugerør og vaskes med PBS suppleret med antibiotika ved stuetemperatur (RT) i 15 minutter i en reagensglasblander. Gentag vasketrinnet 3x, 15 min hver.
- Til enzymatisk nedbrydning inkuberes hakket væv (~5 g) i Dulbeccos modificerede ørnemedier (DMEM lav glukose) indeholdende 1,5 mg/ml type II collagenase (20 ml) og suppleret med 2% FBS ved 37 °C i 12-16 timer.
BEMÆRK: Udfør fordøjelsen i en reagensglasblander ved ~ 15 rotationer pr. Minut (RPM). - Aspirer forsigtigt det fordøjede væv og filtrer det gennem en cellesi (70 μm) for at fjerne ufordøjet væv. Filtratet centrifugeres i et 15 ml centrifugeglas ved 150 x g i 5 min. Supernatanten fjernes og pelleten vaskes med DMEM med lav glukose på mindst 2x.
BEMÆRK: Hæld det fordøjede væv langsomt i silen for at undgå spild. Brug et centrifugerør med lavt volumen (15 ml) for at få en god pellet. - Resuspender den opnåede cellepellet i komplette DMEM-medier (DMEM lav glucose suppleret med 10% FBS og antibiotika [2,5 μg / ml amphotericin, 100 U / ml penicillin-streptomycin og 25 μg / ml ciprofloxacin]), benævnt ekspansionsmedier i protokollen i de efterfølgende trin.
- Frø cellerne på 150 mm petriskåle og dyrk dem i ekspansionsmediet suppleret med 5 ng/ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) og 50 μg/ml 2-phospho-L-ascorbinsyre trinatriumsalt. Cellerne inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator for at lade cellerne klæbe og proliferere. Overvåg cellernes vedhæftning og vækst dagligt.
2. Vedligeholdelse og udvidelse af isolerede celler
- Skift mediet hver 3. dag, indtil cellerne bliver sammenflydende. Tilsæt frisk 5 ng/ml bFGF og 50 μg/ml 2-phospho-L-ascorbinsyre trinatriumsalt direkte til petriskålen, hver gang mediet skiftes. Efter at cellerne er blevet 80% -90% sammenflydende, subkultur cellerne.
BEMÆRK: Fjern de ikke-klæbende enheder under hver medieændring. Hvis der ses oliedråber efter 3 dages inkubation, vaskes cellerne med PBS 1x og tilsættes derefter friske medier til petriskålen. Fortsæt med PBS-vask før hvert medieskift, indtil oliedråberne er helt fjernet. - Subdyrkning af celler: Fjern ekspansionsmediet fra petriskålen og vask cellerne 1x med PBS. Tilsæt 4 ml 0,25% trypsin / EDTA til skålen og inkuber cellerne ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i 4 min.
BEMÆRK: Confluency (80% -90%) opnås inden for 7 dage. Fordel trypsin / EDTA-opløsningen ensartet over hele overfladen af petriskålen under trypsinisering. - Løsn cellerne ved at banke pladen på siden og observere under et mikroskop for at bekræfte, at alle cellerne er løsnet. Neutraliser trypsin efter tilsætning af et lige volumen (4 ml) ekspansionsmedier.
- De dissocierede celler opsamles med en pipette i et frisk 15 ml polypropylenrør og centrifugeres ved 150 x g i 5 minutter ved RT. Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i den ønskede mængde ekspansionsmedier.
- Cellerne tælles ved hjælp af standardcelletællingsmetoden og subkulturen i 150 mm petriskåle ved en såtæthed på 1 x 104 celler/cm2 for yderligere ekspansion. For alle assays skal du bruge et sammenflydende monolag af celler med passagenummer P2-P5.
BEMÆRK: Kryopræserver de overskydende celler.
3. Vurdering af IFP-MSC'ers klonogene evne ved hjælp af kolonidannende assay (CFU-F)
- Til CFU-F-analyse frø cellerne i ekspansionsmedier i en 6-brønds vævskulturplade med en såtæthed på 50-100 celler / cm2. Tilføj medier for at opnå et slutvolumen på 3 ml.
BEMÆRK: Optimer cellekoncentrationen til analyser og behandling. - Cellerne dyrkes i 12 dage ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator under standarddyrkningsbetingelser, så cellerne kan danne kolonier. Skift medie hver 3. dag. Vær forsigtig, mens du skifter medie.
- Efter 12 dage skylles kolonierne 1x med PBS og fikseres med 20% methanol i 20 minutter ved RT. Plet kolonierne med krystalviolet farvestof (0,5% [w/v] i 20% methanol) i 20 minutter ved RT. Tæl de enkelte kolonier ved hjælp af et omvendt mikroskop.
BEMÆRK: En koloni defineres som en klynge på mere end 50 celler.
4. IFP-MSC'ers differentieringspotentiale
- Inducering af adipogen differentiering af IFP-MSC'er
- For at inducere adipogenese, frø cellerne med en densitet på 25 x 103 celler / cm2 i en 24-brønd vævskultur plade. Der tilsættes medier for at opnå et slutvolumen på 500 μL. Cellerne dyrkes ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator.
- En dag efter sammenløbet udskiftes ekspansionsmediet med 500 μL adipogene differentieringsmedier. Det kræver cirka 2 dage for cellerne at nå sammenløb.
- Forbered de adipogene differentieringsmedier ved at supplere ekspansionsmedier (DMEM + 10% FBS + 2,5 μg/ml amphotericin, 100 E/ml penicillin-streptomycin og 25 μg/ml ciprofloxacin) med 25 mM D (+)-glucose, 10 μg/ml insulin, 1 μM dexamethason og 100 μM indomethacin.
BEMÆRK: Differentieringsmedier er ustabile ved 4 °C efter 1 måned; Forbered derfor medierne efter behov. - Betragt cellerne dyrket i ekspansionsmediet suppleret med 25 mM D (+) glucose som ikke-inducerede kontroller. Skift medie hver 3. dag i 14 dage. I slutningen af de 14 dage vaskes cellerne 1x med PBS. Cellerne fikseres med neutralt bufret formalin (NBF; 4 % formaldehyd i PBS) i 15 minutter ved 4 °C.
- Efter fiksering vaskes hullerne 1x med destilleret vand og inkuberes derefter cellerne med 60% isopropanol i 5 minutter ved RT. Efter fjernelse af isopropanol plettes lipiddråberne ved at inkubere cellerne med 500 μL af arbejdsløsningen af Oil Red O-farvestof i 5 minutter ved RT. Vask brøndene 1x med destilleret vand for at fjerne det ubundne farvestof og billede cellerne ved hjælp af et omvendt mikroskop.
BEMÆRK: Forbered stamopløsningen af Oil Red O (ORO) ved at opløse 300 mg ORO i 100 ml 99% isopropanol. For at forberede arbejdsløsningen blandes tre dele lager ORO og to dele destilleret vand og lad det blandes ved RT i 10 minutter. Filtrer blandingen med 0,2 μm filterpapir. Arbejdsløsningen er klar til brug. Stamopløsningen kan tilberedes og opbevares hos RT i 1 måned i mørke, mens arbejdsløsningen skal tilberedes frisklavet før hver brug/farvning.
- Inducering af kondrogen differentiering af IFP MSC'er
- Isolering af gedeplasma:
- Forbered 3,4% (w / v) natriumcitrat i destilleret vand. Der tilsættes 5 ml af den fremstillede natriumcitratopløsning til et 50 ml centrifugeglas.
- Saml 45 ml af det nyligt isolerede gedeblod i samme rør. Vip straks røret for at blande blodet grundigt med natriumcitrat for at forhindre koagulation og transporter det til laboratoriet ved 4 °C.
- Det opsamlede gedeblod centrifugeres ved 1000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Supernatanten (plasma) overføres til et frisk glas inde i et biosikkerhedsskab. Plasmaet filtreres gennem 0,2 μm filtre, alikvote, og opbevares ved -20 °C til videre brug.
BEMÆRK: Hold temperaturen på 2-8 °C under håndtering af prøverne. Det er vigtigt at minimere plasmaets fryse-optøningscyklusser.
- Dyrk de ekspanderede celler til 80% -90% sammenløb, dissocier cellerne ved hjælp af trypsin / EDTA-opløsning, og pellet cellerne ned ved 150 x g i 5 minutter i et 15 ml centrifugerør. Resuspender pellet i gedeplasma ved en densitet på 2 x 106 celler pr. 50 μL plasmaopløsning.
- Tilsæt en dråbe plasmaholdige celler (50 μL) på en steriliseret 90 mm petriskål og tilsæt derefter calciumchlorid i en slutkoncentration på 0,3% (w / v). Bland godt for at fremstille tværbundet plasmahydrogel.
- Den fremstillede hydrogel inkuberes ved 37 °C i 40 minutter. Efter inkubation overføres hydrogelerne til 24-brønds vævskulturplader indeholdende kondrogene medier.
- Forbered kondrogene medier ved at supplere DMEM lav glucose med 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsyre (HEPES), 1,25 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 1 mM prolin, 50 μg/ml 2-phospho-L-ascorbinsyre trinatriumsalt, 100 nM dexamethason, 1x insulin, transferrin, natriumselenit + linolsyre-BSA (ITS+1), antibiotika (2,5 μg/ml amphotericin, 100 E/ml penicillin-streptomycin og 25 μg/ml ciprofloxacin), og 10 ng/ml transformerende vækstfaktor- β1 (TGF-β1).
- Hydrogelerne dyrket i komplette DMEM-medier (DMEM lav glucose med 10% FBS og antibiotika [2,5 μg / ml amphotericin, 100 U / ml penicillin-streptomycin og 25 μg / ml ciprofloxacin]) uden TGF-β1 betragtes som ikke-inducerede kontroller. Skift medie hver 3. dag i 14 dage.
- Efter 14 dages kondrogen differentiering af celler i plasmahydrogeler vaskes hydrogelerne med PBS 3x i 5 minutter hver og fastgøres derefter prøverne i NBF i 3 timer.
FORSIGTIG: Formaldehyd er et potentielt kræftfremkaldende stof og kan forårsage irritation af næse, hals og lunger ved indånding. Udfør alle procedurer relateret til formaldehyd i en damphætte. - NBF fjernes, hydrogelerne vaskes med PBS 3x i 5 minutter hver, og inkuberes derefter i 35% (w/v) saccharose ved RT natten over, så opløsningen absorberes fuldstændigt i prøverne. Akklimatisere hydrogelerne i optimal skæretemperatur (OCT) forbindelse i 3 timer. Integrer prøverne i OCT-forbindelse ved hjælp af silikoneforme under flydende nitrogen.
- Prøverne skæres i en tykkelse på 10-12 μm på gelatinebelagte glasglas ved hjælp af et kryotome, og opbevar dem ved -20 °C til fremtidig brug. For at undersøge tilstedeværelsen eller aflejringen af den ekstracellulære matrix efter kondrogen differentiering plettes sektionerne med Alcian Blue og Safranin-O-farvestof, som binder til sulfaterede glycosaminoglycaner.
BEMÆRK: For at forberede Alcian Blue-farvestof opløses 1 g Alcian Blue-farvestof i 100 ml 0,1 N HCI og blandes grundigt i en reagensglasblander natten over. Opløsningen kan opbevares hos RT i 1 måned i mørke. For at forberede Safranin-O-farvestof opløses 0,1 g Safranin-O-farvestof i 100 ml destilleret vand og blandes grundigt i en reagensglasblander natten over. - Til Alcian Blue-farvning vaskes hydrogelsektionerne 1x med destilleret vand i 5 min. For at rette sektionerne skal du tilføje 4% NBF til diasene og inkubere i 30 minutter.
- Vask sektionerne 1x med destilleret vand i 5 min og derefter 2x med 0,1 N HCl i 30 s hver. Fjern HCI og tør forsigtigt diasene med silkepapir. Tilsæt den tilberedte Alcian Blue-plet til sektionerne og inkuber i 30 minutter ved 37 °C i et befugtet kammer.
- Vask det ubundne farvestof med 0,1 N HCl og destilleret vand i 3 min. Dehydrer sektionerne i absolut ethanol, ryd dem i xylen, og monter til sidst de farvede sektioner i et harpiksholdigt medium til billeddannelse.
- Til Safranin-O-farvning vaskes hydrogelsektionerne med destilleret vand 1x i 5 min. For at rette sektionerne skal du tilføje 4% NBF til diasene og inkubere i 30 minutter. Vask sektionerne 1x med destilleret vand i 5 min, og dypp derefter diasene i 1% eddikesyre i 10-15 s. Tør diasene forsigtigt med silkepapir.
- Tilsæt forberedt Safranin-O-farvestof til sektionerne og inkuber i 10 minutter ved RT. Vask det ubundne farvestof med 100% ethanol. Dyp objektglassene i 100% ethanol i 5 min. Lufttør diasene, ryd dem i xylen, og monter til sidst de farvede sektioner i et harpiksholdigt medium til billeddannelse.
- Isolering af gedeplasma:
- Inducering af osteogen differentiering af IFP MSC'er
- For at inducere osteogen differentiering trypsiniserer cellerne som tidligere nævnt (trin 2.2.). Frø cellerne med en densitet på 3 x 103 celler / cm2 i en 24-brønds vævskulturplade. Der tilsættes medier for at opnå et slutvolumen på 500 μL. Cellerne dyrkes ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator. 1 dag efter såning udskiftes ekspansionsmediet med 500 μL osteogene differentieringsmedier.
- Forbered de osteogene medier ved at supplere ekspansionsmedier (DMEM + 10% FBS +2,5 μg / ml amphotericin, 100 E / ml penicillin-streptomycin og 25 μg / ml ciprofloxacin) med 25 mM D (+) -glucose, 10 nM dexamethason, 10 mM β-glycerophosphat, 50 μg / ml 2-phospho-L-ascorbinsyre trinatriumsalt og 10 nM vitamin D3.
BEMÆRK: De celler, der dyrkes i ekspansionsmedier suppleret med 25 mM D (+) glucose, betragtes som ikke-inducerede kontroller. - Skift det osteogene medie hver 3. dag i 14 dage eller 28 dage. Ved udgangen af 14 dage måles omfanget af osteogenese ved alkalisk fosfatase (ALP) farvning.
BEMÆRK: For at forberede substratet til ALP-farvning opløses en 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP)/nitroblå tetrazolium (NBT) tablet i 10 ml destilleret vand i et 15 ml centrifugerør. Lad tabletten opløses helt. Substratopløsningen er klar til brug. Da substratopløsningen ikke kan opbevares i længere tid, baseret på behov, skal du bryde tabletten i to og opløse den i 5 ml destilleret vand. For at forberede permeabiliseringsbufferen tilsættes Tris-buffer (100 mM) og magnesiumchlorid (5 mM) til destilleret vand. Tilsæt Triton X100 (0,1%) til opløsningen og lad den opløses. Opløsningens pH justeres til 9,25-9,75. - Ved ALP-farvning skal du fjerne mediet efter 14 dages induktion og vaske cellerne med PBS. Fastgør cellerne ved hjælp af NBF (4%) i 1 min. Cellerne vaskes med PBS og permeat med den tilberedte lysisbuffer i 2-3 min.
- Der tilsættes 500 μL af den fremstillede substratopløsning til cellerne, og lad den inkubere i 15 min til 1 time, afhængigt af ekspressionsniveauet. Kontroller udviklingen af lilla / blå farve imellem.
- Fjern substratopløsningen og vask med destilleret vand. Billede af de farvede celler ved hjælp af et omvendt mikroskop.
- Ved udgangen af 28 dage måles omfanget af forkalkning efter osteogen induktion ved Alizarin Red-S-farvning.
BEMÆRK: For at forberede Alizarin Red-S-farvningsopløsningen (40 mM) opløses 2 g Alizarin Red-S i 100 ml destilleret vand og justeres pH til 4,1-4,3 med HCI eller NH4OH. Opløsningen filtreres gennem en 0,22 μm membran og opbevares ved 4 °C i mørke. Opløsningens pH er vigtig; Derfor anbefales det enten at lave en frisk opløsning eller at måle opløsningens pH-værdi igen, hvis den er mere end 1 måned gammel. - Til Alizarin Red-S-farvning skal du fjerne mediet efter 28 dages induktion og vaske cellerne 1x med kold PBS. Cellerne fikseres med 70% ethanol i 1 time ved 4 °C.
- Fjern fikseringsmidlet og vask cellerne 2x med destilleret vand. Fjern vandet helt, og tilsæt 1 ml Alizarin Red-S-opløsning til hvert hul.
- Inkuber cellerne med opløsningen i 1 time ved RT og afbild cellerne ved hjælp af et inverteret mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolering af IFP-MSC'er fra gedens femorotibiale led
De trin, der er involveret i isolering af IFP-MSC'er fra en geds kvæleled, er afbildet i figur 1. Fedtpuden til stede i den indre ikke-artikulerende overflade af patella blev fjernet, hakket og enzymatisk fordøjet. IFP-MSC'erne blev med succes isoleret og dyrket in vitro (figur 2A).
Udvidelse og klonogen evne af IFP-MSC'er
De isolerede celler blev dyrket in vitro i ekspansionsmedier. Cellerne begyndte at klæbe til vævskulturpladen inden for 12 timer efter såning og var for det meste runde i form på dag 0. De klæbede homogent til pladen og opnåede langstrakt morfologi inden for 24 timer. Denne morfologi blev opretholdt gennem hele kulturens varighed. Cellerne spredte sig effektivt i kultur og blev 80% -90% sammenflydende inden for 6 dage efter ekspansion (figur 2A). Derudover viste de isolerede celler klonogen kapacitet, vurderet ved kolonidannende enhedsfibroblast (CFU-F) assay (figur 2B). Disse resultater indikerer, at de isolerede celler har effektive proliferative og selvfornyende kapaciteter in vitro.
IFP-MSC'ers differentieringspotentiale
For at karakterisere, om de isolerede celler var multipotente og havde karakteristiske træk ved MSC'er, blev de induceret til at differentiere sig i flere slægter. De isolerede celler, når de blev induceret mod adipogen afstamning, producerede lipiddråber, som det kan observeres fra brightfield-billederne (figur 3A). Dette blev yderligere bekræftet af Oil Red O-farvning på dag 14 og dag 21, hvilket tyder på disse cellers evne til at differentiere sig til adipocytter. På den anden side blev der ikke observeret synlige oliedråber i de dyrkede celler i fravær af adipogene inducerende faktorer (figur 3B,C).
For at bestemme de isolerede cellers kondrogene potentiale blev cellerne indkapslet i plasmahydrogel og fik lov til at differentiere sig til den kondrogene afstamning. Som afbildet fra de grove billeder af plasmahydrogelen (figur 4A) syntes neovævet dannet efter 14 dage i den inducerede gruppe hvidt og blankt (svarende til ledbrusk), mens det i den ikke-inducerede gruppe var svagt hvidt, og reduceret glans blev observeret. Derudover var cellerne i den inducerede gruppe i stand til at udskille en af hovedkomponenterne i bruskmatrixen (dvs. sulfaterede glycosaminoglycaner), hvilket fremgår af positiv histologisk farvning for Alcian Blue (figur 4B) og Safranin O (figur 4C). I modsætning hertil var hydrogelsektionerne fra de ikke-inducerede grupper negative for Safranin O- og Alcian Blue-farvning. Disse resultater indikerer tilsammen kun MSC'ernes kondrogene differentieringspotentiale i nærvær af kondrogene stimuli.
De isolerede celler viste også osteogent differentieringspotentiale. Efter 14 dage og 21 dage i kultur blev der ikke observeret spontan mineralisering (uinduceret gruppe). Ved inducering med osteogene medier var mineralisering imidlertid tydelig ved den positive farvning for alkalisk fosfatase (ALP) i slutningen af 14 dage (figur 5A). Desuden blev forkalkede aflejringer efter 28 dages kultur i osteogene medier visualiseret ved positiv Alizarin Red-S-farvning (figur 5B). Disse resultater viser, at de isolerede celler fra gedens infrapatellære fedtpude, når de induceres, har potentialet til at differentiere sig til adipogene, kondrogene og osteogene slægter.
Figur 1: Skematisk for isolering af IFP-MSC fra kvæleleddet i gedeknæet. Trin 1. Gedeknæprøven indsamles fra slagteriet, og dissektionen behandles i et biosikkerhedsskab. Trin 2. Undersøg omhyggeligt vævets anatomi og fjern de omgivende muskler og fedtvæv; Trin 3. Uden at forstyrre ledkapslen skal du fjerne muskler og fedtvæv for fuldstændigt at udsætte begge de lange knogler (lårben og skinneben); Trin 4. Lav et snit i synoviummembranen og skær leddet op for at udsætte patella og trochlear brusk; Trin 5. Fjern patellaen forsigtigt fra ledleddet uden at forstyrre den infrapatellære fedtpude (IFP), og opbevar den på en petriskål indeholdende PBS; Trin 6. Fjern langsomt hele fedtpuden fra patellaen og opbevar den i en frisk petriskål til hakning og enzymatisk fordøjelse. (a. Femur, b. Tibia, c. Patella, d. Trochlear brusk, e. Infrapatellar fedtpude). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: IFP-MSC'ers morfologi og klonogene potentiale . (A) Mikrografier blev taget ved passage 3 ved hjælp af et omvendt brightfield-mikroskop ved 10x forstørrelse. Umiddelbart efter såning (dag 0) forblev cellerne runde i form, på dag 3 opnåede de fleste celler langstrakt morfologi, og på dag 6 blev IFP-MSC'erne 80% -90% sammenflydende (skalabjælke = 100 μm). (B) Repræsentative billeder (n = 3) af CFU-F-kolonier farvet med krystalviolet farvestof efter 12 dages såning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Adipogen differentiering af IFP-MSC'er. Det øverste panel angiver mikrografier af ikke-inducerede IFP-MSC'er, og det nederste panel repræsenterer IFP-MSC'er induceret i den adipogene afstamning. (A) Repræsentative brightfield-billeder, der viser dannelsen af lipidvakuoler under adipogenese (skalabjælke = 100 μm). Repræsentative billeder af Oil Red O-farvning af lipiddråber på (B) dag 14 og (C) dag 21 af differentiering (skalabjælke = 20 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Chondrogen differentiering af IFP-MSC'er. Det øverste panel angiver hydrogelkonstruktioner/sektioner fra uinduceret hydrogel, og bundpanelet repræsenterer hydrogel, der udsættes for kondrogenese. (A) Bruttobilleder af plasmahydrogelkonstruktioner efter 14 dage i kultur i fravær (ikke-induceret) eller tilstedeværelse (induceret) af kondrogene medier suppleret med TGF-β1. Repræsentative billeder af 10 μm sektioner af hydrogel farvet med sGAG bindende farvestof (B) Alcian Blue (blå) og (C) Safranin O (rød) (skalabjælke = 100 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Osteogen differentiering af IFP-MSC'er. Det øverste panel angiver ikke-inducerede celler, og det nederste panel angiver celler induceret med osteogene medier. Mikrografier og repræsentative billeder af IFP-MSC'er farvet med (A) BCIP-NBT (alkalisk fosfatase) efter 14 dage og (B) Alizarin Red-S (calciumaflejring) efter 28 dages differentiering (skalabjælke = 100 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol er der tilvejebragt en enkel, pålidelig og reproducerbar metode til isolering af MSC'er fra ged IFP. Celler isoleret ved hjælp af denne metode er blevet anvendt med succes i vores tidligere undersøgelser til in vitro vævsregenerering. Det blev observeret, at de isolerede celler var proliferative, reagerede på forskellige vækstfaktorer og bevarede deres biologiske aktivitet, når de blev podet på elektrospundne fibre og stilladser25,26. Desuden blev det observeret, at et stort antal MSC'er af høj kvalitet kan opnås og dyrkes sammen med chondrocytter i injicerbare hydrogeler til konstruktion af ledbrusk in vitro27,28,29. Mens proceduren for dissektion og isolering af celler er enkel, er der et par trin, der skal følges nøje for en vellykket isolering og udvidelse af MSC'er fra IFP. For det første, da det ikke er muligt at opretholde virkelig aseptiske forhold, mens prøven tages fra slagteriet, anbefales det at tørre det ydre væv med 70% ethanol for at sterilisere vævet, inden isolationsproceduren påbegyndes. Det næste vigtige trin er at dissekere fedtpuden fra knæleddet. IFP er placeret under knæskallen i knæleddet. Den proksimale ende af IFP er fastgjort til den distale ende af patella30,31. Derfor bliver det meget vigtigt at identificere den korrekte placering af patellaen, mens du udfører isolationsproceduren. Dernæst, da IFP artikulerer med trochlear brusk i lårbenet og er dækket af synoviummembranen30,31, er det nødvendigt at lave et snit i synoviummembranen for at skære knæleddet op. Det er også afgørende at observere den generelle sundhed for den indsamlede infrapatellar fedtpude. Da IFP består af adipocytter (celler) og fedtbindevæv, såsom kollagen og glycosaminoglycaner, hakkes vævet og fordøjes under anvendelse af kollagenaseenzym for at frigive cellerne 9,32. De flydende adipocytter adskilles ved centrifugering med langsom hastighed for at have en homogen kultur af MSC'er. De resterende adipocytter i den stromale vaskulære fraktion skal fjernes fra vævskulturpladen ved hvert medieskift ved at vaske cellemonolaget med PBS, før der tilsættes friske medier. Dette trin skal fortsættes, indtil alle de synlige adipocytter er fjernet. Det foreslås at genfrø cellerne i en ny plade, efter at P0-celler når sammenløbet for at slippe af med de resterende adipocytter, som muligvis har klæbet til pladevæggen og er vanskelige at fjerne. Da gedeprøverne for det meste er taget fra et slagteri, er det vanskeligt at spore gedens nøjagtige alder, og derfor skal variationen mellem prøverne nøje observeres og dokumenteres under isolering af cellerne. Det foreslås at karakterisere cellerne til selvfornyelse (CFU-F), proliferation og differentieringspotentiale efter hver isolering, før de anvendes til forskellige applikationer og mekanistiske undersøgelser. På grund af kravet om et stort antal celler i cellebaserede vævstekniske applikationer bliver dyrkningsbetingelserne, der letter spredning, forsinker ældning og opretholder cellernes stamme, centralt vigtige. Det blev observeret, at MSC'er dyrket i 2-phospho-L-ascorbinsyretrinatriumsalt (PAA) og basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) viste en ~ 42 gange stigning i deres antal sammenlignet med MSC'er dyrket i bFGF alene. Derudover reducerede sambehandlingen af PAA og bFGF produktionen af reaktive iltarter (på grund af deres antioxidantegenskaber) og ældning i stamceller. Derfor er det ønskeligt at anvende PAA under in vitro-ekspansion af MSC'er33.
Mens enzymatisk fordøjelse af væv anvendes universelt og er en effektiv metode til isolering af MSC'er, er brugen af enzymer såsom collagenaser tidskrævende og dyr34. I denne undersøgelse tog den fuldstændige fordøjelse af vævet ved hjælp af kollagenase 12-16 timer (natten over), hvilket kan føre til nedsat levedygtighed eller ændret overfladefænotype af celler35. Derfor kan metoden yderligere optimeres til at reducere varigheden af kollagenasebehandling til vævsfordøjelse. Alternativt kan en enzymfri eksplantatkulturmetode, der anvendes til isolering af fedtafledte MSC'er fra lipoaspirater eller lyskefedtpuder, også undersøges til isolering af IFP-MSC'er34,36,37.
IFP-MSC'er har på grund af deres evne til at differentiere sig til kondrogene, adipogene og osteogene slægter et bredt terapeutisk potentiale. Tidligere rapporter har vist, at IFP-MSC'er udviser bedre kondrogent potentiale end andre stamceller 6,7,9,10. Derfor har IFP-MSC'er fået interesse og betragtes som en bedre kandidat til cellebaseret terapi til reparation af bruskdefekter og lindring af brusknedbrydning i slidgigt. I et præklinisk studie resulterede samtidig levering af IFP-MSC'er med bruskekstracellulære matrixkomponenter gennem intraartikulær injektion i forbedret bruskregenerering ved osteokondrale defekter38. Tilsvarende førte intraartikulær injektion af IFP-MSC'er i kaninslidgigtmodellen (OA) til et fald i følgende sygdomsparametre: brusknedbrydning, osteofytdannelse, subchondral knoglefortykkelse og synovitis39. Desuden har resultater fra et tidligere rapporteret randomiseret klinisk forsøg13 og et nyligt offentliggjort åbent niveau fase 1 klinisk forsøg40 vist, at intraartikulære injektioner af IFP-MSC'er hos patienter med knæartrose er sikre og resulterer i reduktion af smerte og forbedring af ledfunktion, hvilket indikerer deres lovende terapeutiske potentiale til at forbedre OA-relaterede komplikationer i knæet. IFP-MSC'er har også vist sig at udvikle forstærkede immunmodulerende egenskaber i nærvær af proinflammatoriske signaler ved at lette nedbrydningen af en inflammatorisk regulator, stof P (SP), hvilket fører til en reduktion i proinflammatoriske og kataboliske molekyler og som følge heraf forbedret behandling af inflammation og fibrose af synovium og IFP6 . Endnu vigtigere viste IFP-MSC'er behandlet under regulatoriske betingelser bedre spredning, differentieringskapacitet og immunmodulerende egenskaber sammenlignet med standard in vitro-dyrkningsbetingelser, hvilket demonstrerer deres potentiale for klinisk succes, når de anvendes til mesenkymal stamcellebehandling (MSC)41.
Afslutningsvis beskriver denne protokol isoleringen af infrapatellar fedtpude (IFP)-afledte mesenkymale stamceller (MSC'er) fra gedekvælende led ved enzymatisk fordøjelse og deres vedligeholdelse i kultur. De isolerede celler har proliferativt og selvfornyelsespotentiale og kan differentiere sig til adipogene, osteogene og kondrogene slægter. IFP-MSC'er er en lovende kilde til MSC'er og har translationelt potentiale til regenerative medicinske applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
SH anerkender støtte fra Institute Post-Doctoral Fellowship of IIT Kanpur og SYST grant fra DST (SEED Division) (SP/YO/618/2018). AM anerkender Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) for et institutstipendium. DSK anerkender Gireesh Jankinath Chair Professorship og Institut for Bioteknologi, Indien, for finansiering (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH og DSK takker The Mehta Family Center for Engineering in Medicine ved IIT-Kanpur for deres generøse støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
| 0.25% Trypsin- 0.02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
| 15-mL centrifuge tube | Corning | ||
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | 50 µg/mL |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
| 50-mL centrifuge tube | Corning | ||
| Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | For calcium deposition |
| Amphotericin B | HiMedia | A011 | 2.5 µg/mL |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
| BCIP/NBT ALP Substrate | Sigma | B5655-5TAB | For ALP staining |
| Biological safety cabinet | |||
| BSA | HiMedia | MB-083 | Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL ) |
| Cell strainer | HiMedia | TCP-182 | 70 µm |
| Centrifuge | REMI | ||
| Ciprofloxacin | RANBAXY LAB. Limited | B17407T1 | 2.5 µg/mL |
| Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µM |
| DMEM LG | SIGMA | D5523 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FBS | Gibco | 10270 | Long name: Fetal Bovine Serum |
| Formaldehyde solution 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 µM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µg/mL |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS 100 | ||
| ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA |
| L-Proline | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
| Magnesium chloride | Merck | 61751605001730 | For lysis buffer |
| Methanol | Meck | 1.07018.2521 | |
| Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Thermoscientific | ||
| MUSE Cell analyser | Merck Millipore | For cell counting | |
| OCT compound | Tissue-Tek | 4583 | Long name: Optimal Cutting Temperature |
| Oil Red O dye | S D Fine-Chem Limited | 54304 | For lipid vacuole staining |
| Penicillin-Streptomycin | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
| Petri dishes (150 mm and 90 mm) | NEST | ||
| Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C3434 | 3.4 % (w/v) |
| Sterile scissors, forceps and scalpels | For isolation of IFP-MSC | ||
| Sucrose | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (w/v) |
| TGF-β1 | Sino Biologicals | Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL) | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
| Tris buffer | Merck | 61771405001730 | For lysis buffer |
| Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | For lysis buffer |
| Type II collagenase | Gibco | 17101015 | 1.5 mg/mL |
| Vitamin D3 | Sigma | C9756-1G | 10 nM |
| Well plates (6 -WP and 24-WP) | NEST |
References
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regenerative Medicine. 4 (1), 22 (2019).
- Guo, Y., Yu, Y., Hu, S., Chen, Y., Shen, Z. The therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cardiovascular diseases. Cell Death & Disease. 11 (5), 349 (2020).
- Ge, Z., Goh, J. C. H., Lee, E. H. Selection of cell source for ligament tissue engineering. Cell Transplantation. 14 (8), 573-583 (2005).
- Harvanová, D., Tóthová, T., Sarissky, M., Amrichová, J., Rosocha, J. Isolation and characterization of synovial mesenchymal stem cells. Folia Biologica. 57 (3), 119-124 (2011).
- Kouroupis, D., et al. Infrapatellar fat pad-derived MSC response to inflammation and fibrosis induces an immunomodulatory phenotype involving CD10-mediated Substance P degradation. Scientific Reports. 9 (1), 10864 (2019).
- Lopa, S., et al. Donor-matched mesenchymal stem cells from knee infrapatellar and subcutaneous adipose tissue of osteoarthritic donors display differential chondrogenic and osteogenic commitment. European Cells & Materials. 27, 298-311 (2014).
- Garcia, J., et al. Characterisation of synovial fluid and infrapatellar fat pad derived mesenchymal stromal cells: The influence of tissue source and inflammatory stimulus. Scientific Reports. 6 (1), 24295 (2016).
- Tangchitphisut, P., et al. Infrapatellar fat pad: an alternative source of adipose-derived mesenchymal stem cells. Arthritis. 2016, 4019873 (2016).
- Ding, D. -C., et al. Human infrapatellar fat pad-derived stromal cells have more potent differentiation capacity than other mesenchymal cells and can be enhanced by hyaluronan. Cell Transplantation. 24 (7), 1221-1232 (2015).
- Khan, W., Adesida, A., Tew, S., Andrew, J., Hardingham, T. The epitope characterisation and the osteogenic differentiation potential of human fat pad-derived stem cells is maintained with ageing in later life. Injury. 40 (2), 150-157 (2009).
- Koh, Y. G., et al. Mesenchymal stem cell injections improve symptoms of knee osteoarthritis. Arthroscopy. 29 (4), 748-755 (2013).
- Koh, Y. G., Choi, Y. J. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis. Knee. 19 (6), 902-907 (2012).
- Kouroupis, D., Willman, M. A., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell-based spheroids enhance their therapeutic efficacy to reverse synovitis and fat pad fibrosis. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 44 (2021).
- Stocco, E., et al. Infrapatellar fat pad stem cells responsiveness to microenvironment in osteoarthritis: from morphology to function. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 323 (2019).
- Hindle, P., Khan, N., Biant, L., Péault, B. The infrapatellar fat pad as a source of perivascular stem cells with increased chondrogenic potential for regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 77-87 (2017).
- Stolzing, A., Jones, E., McGonagle, D., Scutt, A. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (3), 163-173 (2008).
- Wu, C. L., Diekman, B. O., Jain, D., Guilak, F. Diet-induced obesity alters the differentiation potential of stem cells isolated from bone marrow, adipose tissue and infrapatellar fat pad: the effects of free fatty acids. International Journal of Obesity (2005). 37 (8), 1079-1087 (2013).
- Barboza, E., et al. Profibrotic infrapatellar fat pad remodeling without M1 macrophage polarization precedes knee osteoarthritis in mice with diet-induced obesity. Arthritis & Rheumatology. 69 (6), 1221-1232 (2017).
- Allen, M. J., Hankenson, K. D., Goodrich, L., Boivin, G. P., von Rechenberg, B. Ethical use of animal models in musculoskeletal research. Journal of Orthopaedic Research. 35 (4), 740-751 (2017).
- Moran, C. J., et al. The benefits and limitations of animal models for translational research in cartilage repair. Journal of Experimental Orthopaedics. 3 (1), (2016).
- Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11 (1), 19 (2016).
- Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
- Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. The Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
- Bhutada, S. S., Sriram, M., Katti, D. S. Sulfated carboxymethylcellulose conjugated electrospun fibers as a growth factor presenting system for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 268, 118256 (2021).
- Waghmare, N. A., Arora, A., Bhattacharjee, A., Katti, D. S. Sulfated polysaccharide mediated TGF-β1 presentation in pre-formed injectable scaffolds for cartilage tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 193, 62-72 (2018).
- Arora, A., Mahajan, A., Katti, D. S. TGF-β1 presenting enzymatically cross-linked injectable hydrogels for improved chondrogenesis. Colloids & Surfaces B: Biointerfaces. 159, 838-848 (2017).
- Arora, A., Sriram, M., Kothari, A., Katti, D. S. Co-culture of infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cells and articular chondrocytes in plasma clot for cartilage tissue engineering. Cytotherapy. 19 (7), 881-894 (2017).
- Mahajan, A., Singh, A., Datta, D., Katti, D. S. Bioinspired injectable hydrogels dynamically stiffen and contract to promote mechanosensing-mediated chondrogenic commitment of stem cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (6), 7531-7550 (2022).
- Nakano, T., Wang, Y. W., Ozimek, L., Sim, J. S. Chemical composition of the infrapatellar fat pad of swine. Journal of Anatomy. 204 (4), 301-306 (2004).
- Sun, Y., Chen, S., Pei, M. Comparative advantages of infrapatellar fat pad: an emerging stem cell source for regenerative medicine. Rheumatology. 57 (12), 2072-2086 (2018).
- Han, W., et al. Infrapatellar fat pad in the knee: is local fat good or bad for knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 16 (4), 1-8 (2014).
- Bae, S. H., et al. L-ascorbic acid 2-phosphate and fibroblast growth factor-2 treatment maintains differentiation potential in bone marrow-derived mesenchymal stem cells through expression of hepatocyte growth factor. Growth Factors. 33 (2), 71-78 (2015).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Jing, W., et al. Explant culture: an efficient method to isolate adipose-derived stromal cells for tissue engineering. Artificial Organs. 35 (2), 105-112 (2011).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
- Toghraie, F., et al. Treatment of osteoarthritis with infrapatellar fat pad derived mesenchymal stem cells in Rabbit. The Knee. 18 (2), 71-75 (2011).
- Chen, H. -H., et al. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cell product for treatment of knee osteoarthritis: a first-in-human study with evaluation of the potency marker. Cytotherapy. 24 (1), 72-85 (2022).
- Kouroupis, D., Bowles, A. C., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. CD10/Neprilysin enrichment in infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cells under regulatory-compliant conditions: implications for efficient synovitis and fat pad fibrosis reversal. The American Journal of Sports Medicine. 48 (8), 2013 (2020).
