Aislamiento, expansión y diferenciación de células madre mesenquimales de la almohadilla de grasa infrapatelar de la articulación sofocante de cabra

Resumen

Las células madre mesenquimales de la almohadilla de grasa infrapatelar (IFP-MSC) se pueden aislar fácilmente de la almohadilla de grasa infrapatelar de la articulación de la rodilla. Proliferan bien in vitro, forman colonias de UFC-F y se diferencian en linajes adipogénicos, condrogénicos y osteogénicos. En este documento, se proporciona la metodología para el aislamiento, expansión y diferenciación de IFP-MSC de la articulación sofocante de cabra.

Resumen

El IFP, presente en la articulación de la rodilla, sirve como una fuente prometedora de MSC. El IFP es un tejido de fácil acceso, ya que se reseca y descarta rutinariamente durante los procedimientos artroscópicos y las cirugías de reemplazo de rodilla. Además, su eliminación se asocia con una morbilidad mínima en el sitio donante. Estudios recientes han demostrado que los IFP-MSC no pierden su capacidad de proliferación durante la expansión in vitro y tienen un potencial de diferenciación osteogénica independiente de la edad. Las IFP-MSC poseen un potencial de diferenciación condrogénica superior en comparación con las MSC derivadas de la médula ósea (BMSC) y las células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC). Aunque estas células se pueden obtener fácilmente de pacientes ancianos y enfermos, su efectividad es limitada. Por lo tanto, el uso de IFP-MSC de donantes sanos es importante para determinar su eficacia en aplicaciones biomédicas. Como el acceso a un donante humano sano es un desafío, los modelos animales podrían ser una mejor alternativa para permitir la comprensión fundamental. Los animales grandes como perros, caballos, ovejas y cabras juegan un papel crucial en la investigación traslacional. Entre estos, la cabra podría ser un modelo preferido ya que la articulación sofocante de la cabra tiene la anatomía más cercana a la articulación de la rodilla humana. Además, el IFP de cabra puede cumplir con los números más altos de MSC necesarios para aplicaciones de regeneración de tejidos. Además, el bajo costo, la disponibilidad y el cumplimiento de los principios de las 3R para la investigación con animales los convierten en un modelo atractivo. Este estudio demuestra un protocolo simple para aislar IFP-MSC de la articulación sofocante de cabras y condiciones de cultivo in vitro para su expansión y diferenciación. El IFP asépticamente aislado de la cabra fue lavado, picado y digerido enzimáticamente. Después de la filtración y centrifugación, las células recolectadas fueron cultivadas. Estas células eran adherentes, tenían una morfología similar a las MSC y demostraron una notable capacidad clonogénica. Además, se diferenciaron en linajes adipogénicos, condrogénicos y osteogénicos, lo que demuestra su multipotencia. En conclusión, el estudio demuestra el aislamiento y la expansión de las MSC, que muestran potencial en aplicaciones de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa.

Introducción

Las células madre mesenquimales (CMM) son un candidato atractivo para las terapias basadas en células en medicina regenerativa ^1,2. Se pueden recolectar de una variedad de fuentes de tejidos como médula ósea, cordón umbilical, placenta, pulpa dental y tejido adiposo subcutáneo³. Sin embargo, como la disponibilidad de células madre en adultos es limitada y su procedimiento de aislamiento es a menudo invasivo (lo que resulta en morbilidad en el sitio donante), es deseable tener una fuente alternativa de células madre que pueda eludir estos desafíos.

La articula....

Protocolo

El protocolo se basa en el aislamiento de IFP-MSCs de cabras. Se recogieron IFP de cabra y sangre de un matadero local. Dado que tales colecciones de tejidos están fuera del ámbito de un Comité Institucional de Ética Animal, no se requería aprobación ética.

1. Aislamiento de IFP-MSCs de la articulación femorotibial de la rodilla de cabra

1. Recolectar la articulación femorotibial de cabra (muestra) que abarca ~ 15 cm cada una de las regiones femoral y tibial de las extremidades posteriores. Coloque inmediatamente la muestra en una caja de recogida de muestras esterilizada y guárdela a 4 °C para transportarla al labor....

Resultados

Aislamiento de IFP-MSCs de la articulación femorotibial de cabra
Los pasos involucrados en el aislamiento de IFP-MSC de la articulación sofocante de una cabra se representan en la Figura 1. La almohadilla de grasa presente en la superficie interna no articulada de la rótula se eliminó, se picó y se digirió enzimáticamente. Los IFP-MSCs fueron aislados con éxito y cultivados in vitro (Figura 2A).

Ex.......

Discusión

En el presente protocolo, se ha proporcionado un método simple, confiable y reproducible para el aislamiento de MSC de IFP de cabra. Las células aisladas utilizando este método se han utilizado con éxito en nuestros estudios previos para la regeneración de tejidos in vitro. Se observó que las células aisladas eran proliferativas, respondían a diversos factores de crecimiento y conservaban su actividad biológica cuando se sembraban en fibras electrohiladas y andamios^25,26

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
β-glicerofosfato	Sigma-Aldrich	G9422-10G	10 mM
0,25% Tripsina- 0,02% EDTA	Hi-Media	TCL049
Tubo de centrífuga de 15 mL	Corning
2-Phospho-L-ascórbico ácido sal trisódica	Sigma	49752-10G	50 µ g/mL
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES)	HiMedia	TCL021-50ml	10 mM
Tubo de centrífuga de 50 mL	Corning
Alcian Blue	Hi-Media	RM471	Para tinción de gycosaminoglicanos sufados
Rojo de alizarina S	S D Fine-Chem Limited	26048-25G	Para la deposición de calcio
Anfotericina B	HiMedia	A011	2.5 y micro; g/mL
Factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF)	Sino Biologicals	10014-HNAE	5 ng/mL
BCIP/NBT Sustrato ALP	Sigma	B5655-5TAB	Para tinción de ALP
Cabina
BSA	HiMedia	MB-083	Nombre largo: Albúmina sérica bovina (1,25 mg/mL)
Filtro de células	HiMedia	TCP-182	70 y micro; m
Centrífuga	REMI
Ciprofloxacina	RANBAXY LAB. Limitado	B17407T1	2.5 y micro; g/mL
Crystal Violet	S D Fine-Chem Limited	42555
D(+)-glucosa	Merck	1.94925.0521	25 mM
Dexametasona	Sigma-Aldrich	D2915	1 µ M
DMEM LG	SIGMA	D5523	Nombre largo: Dulbecco' s Águila Modificada' s Medios de baja glucosa
Etanol	Merck 100983
FBS	Gibco	10270	Nombre largo: Fetal Bovino
Suero Solución de formaldehído 37%-41%	Merck	61780805001730
Indometacina	Sigma-Aldrich	I7378	100 µ M
Insulina	Sigma-Aldrich	I9278 10	µ g/mL
Microscopio invertido	Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1	Sigma-Aldrich	I2521-5mL Nombre	largo: insulina, transferrina, selenito de sodio + linoleico-BSA
L-Proline	HiMedia	TO-109-25G	1 mM
Cloruro de magnesio	Merck	61751605001730	Para tampón de lisis
Metanol	Meck	1.07018.2521
Micropipetas y puntas estériles (20 & L, 200 y micro; L, 1000 y micro; L)	Termocientífico
MUSE Analizador de células	Merck Millipore		Para el recuento de células
Compuesto OCT	Tissue-Tek	4583	Nombre largo: Temperatura de corte óptima
Aceite Rojo O colorante	S D Fine-Chem Limited	54304	Para la tinción de vacuolas lipídicas
Penicilina-Estreptomicina	HiMedia	A007	100 U/mL
Petri placas (150 mm y 90 mm)	NEST
Safranin O	S D Fine-Chem Limited	50240	Para la tinción de gycosaminoglicanos sufados
Citrato de sodio	Sigma-Aldrich	C3434	3,4 % (p/v)
Tijeras, pinzas y bisturíes			Para el aislamiento de IFP-MSC
	Sacarosa Merck	1.94953.0521	35 % (p/v)
TGF- y beta; 1	Sino Biologicals		Nombre largo: Factor de crecimiento transformador y beta; 1 (10 ng/mL)
Incubadora de cultivo de tejidos 37 ° C, 5% CO2	Thermoscientific
Tampón Tris	Merck	61771405001730	Para tampón de lisis
Triton X100	S D Fine-Chem Limited	40632	Para tampón de lisis
Colagenasa tipo II	Gibco	17101015	1,5 mg/mL
Vitamina D3	Sigma	C9756-1G	10
nM Placas de pocillos (6 -WP y 24-WP)	nido

de seguridad biológica estériles