Summary
La dysrégulation protéomique joue un rôle important dans la propagation des gliomes infiltrant de manière diffuse, mais plusieurs protéines pertinentes restent non identifiées. Le traitement spatial numérique (DSP) offre une approche efficace et à haut débit pour caractériser l’expression différentielle des protéines candidates qui peuvent contribuer à l’invasion et à la migration des gliomes infiltrants.
Abstract
Les gliomes infiltrant de manière diffuse sont associés à une morbidité et une mortalité élevées en raison de la nature infiltrante de la propagation tumorale. Ce sont des tumeurs morphologiquement complexes, avec un degré élevé de variabilité protéomique à la fois dans la tumeur elle-même et dans son microenvironnement hétérogène. Le potentiel malin de ces tumeurs est renforcé par la dérégulation des protéines impliquées dans plusieurs voies clés, y compris les processus qui maintiennent la stabilité cellulaire et préservent l’intégrité structurelle du microenvironnement. Bien qu’il y ait eu de nombreuses analyses de gliome en vrac et unicellulaire, il y a une relative rareté de stratification spatiale de ces données protéomiques. Comprendre les différences dans la distribution spatiale des facteurs tumorigènes et des populations de cellules immunitaires entre la tumeur intrinsèque, la bordure invasive et le microenvironnement offre des informations précieuses sur les mécanismes sous-jacents à la prolifération et à la propagation des tumeurs. Le profilage spatial numérique (DSP) représente une technologie puissante qui peut constituer la base de ces importantes analyses multicouches.
DSP est une méthode qui quantifie efficacement l’expression des protéines dans les régions spatiales spécifiées par l’utilisateur dans un échantillon de tissu. DSP est idéal pour étudier l’expression différentielle de plusieurs protéines dans et entre les régions de distinction, permettant plusieurs niveaux d’analyse quantitative et qualitative. Le protocole DSP est systématique et convivial, permettant une analyse spatiale personnalisée des données protéomiques. Dans cette expérience, des puces à ADN tissulaires sont construites à partir de biopsies de forage de glioblastome archivées. Ensuite, un panel d’anticorps est sélectionné, ciblant les protéines d’intérêt dans l’échantillon. Les anticorps, qui sont préconjugués aux oligonucléotides d’ADN photoclivables par UV, sont ensuite incubés avec l’échantillon de tissu pendant une nuit. Dans le cadre de la visualisation par microscopie à fluorescence des anticorps, les régions d’intérêt (ROI) dans lesquelles quantifier l’expression des protéines sont définies avec les échantillons. La lumière UV est ensuite dirigée vers chaque ROI, clivant les oligonucléotides d’ADN. Les oligonucléotides sont microaspirés et comptés dans chaque ROI, quantifiant la protéine correspondante sur une base spatiale.
Introduction
Les gliomes infiltrant de manière diffuse sont le type le plus courant de tumeur cérébrale maligne chez l’adulte et sont invariablement mortels. La propension des cellules de gliome à migrer largement dans le cerveau est un défi thérapeutique majeur. Le mécanisme par lequel ils se propagent implique une migration dirigée et une invasion incontrôlée. Il a été démontré que les cellules de gliome invasives présentent un tropisme et une migration le long des faisceaux de substance blanche1, des recherches récentes impliquant la démyélinisation de ces voies comme une caractéristique protumorigène active2. L’invasion est médiée par une transition épithélio-mésenchymateuse, dans laquelle les cellules de gliome acquièrent des propriétés mésenchymateuses en réduisant l’expression des gènes codant pour les protéines de la matrice extracellulaire et les molécules d’adhésion cellulaire, amplifiant la migration et facilitant la propagation à travers le microenvironnement tumoral 3,4,5.
Au niveau moléculaire, la perturbation de plusieurs protéines qui confèrent une stabilité cellulaire et une interface avec des composants immunogènes a été démontrée6. Les gliomes infiltrants sont connus pour subir la suppression de protéines ayant des propriétés anti-apoptotiques (par exemple, PTEN)7. Ils surexpriment également des protéines qui favorisent l’évasion de la réponse immunitaire de l’hôte (p. ex. PD1/PDL1)8. La dérégulation de ces voies complexes augmente la tumorigénicité et augmente le potentiel malin.
Dans des échantillons de gliome invasif, l’objectif était d’évaluer l’expression différentielle de protéines essentielles à la croissance, à la survie et à la prolifération cellulaires, ainsi qu’à l’intégrité structurelle du microenvironnement entre les composants invasifs et non invasifs. De plus, nous avons cherché à étudier la régulation différentielle des protéines ayant un rôle immunogène actif, offrant un aperçu du mécanisme par lequel les défenses immunitaires de l’hôte compromis peuvent améliorer le potentiel prolifératif et invasif des gliomes. Ceci est particulièrement pertinent compte tenu de l’ampleur récente de la recherche démontrant comment les marqueurs immunitaires et les facteurs de dérégulation dans la malignité peuvent servir de cibles de l’immunothérapie. L’identification de cibles thérapeutiques viables parmi les nombreuses protéines impliquées dans l’immunosurveillance et la réactivité nécessite une approche très sensible et globale.
Compte tenu du large éventail de protéines candidates pouvant être étudiées, nous avons cherché une méthode semblable à l’immunohistochimie, mais avec une efficacité accrue du traitement des données. Dans le domaine de la biologie du cancer, DSP est apparu comme une technologie puissante avec des avantages importants par rapport aux outils alternatifs pour l’analyse et la quantification protéomique. La caractéristique du DSP est sa capacité de multiplexage à haut débit, permettant l’étude simultanée de plusieurs protéines différentes dans un échantillon, marquant une distinction importante des technologies standard mais à plus faible plex telles que l’immunohistochimie (IHC)9,10. La caractéristique multiplex du DSP ne compromet pas sa fidélité en tant qu’outil quantitatif et analytique, comme le démontrent les études comparant le DSP à l’IHC. Lorsqu’il est utilisé pour la quantification protéomique d’échantillons de cancer du poumon non à petites cellules, par exemple, il a été démontré que le DSP donne des résultats similaires à IHC11. En outre, DSP offre une spécification régionale personnalisable, dans laquelle les utilisateurs peuvent définir manuellement des régions dans lesquelles effectuer une analyse protéomique. Cela présente un avantage par rapport aux méthodes multiplex à section entière10,12. En un seul cycle de traitement, DSP offre ainsi plusieurs couches d’analyse en examinant plusieurs cibles protéiques dans plusieurs régions d’intérêt.
DSP a des applications dans plusieurs contextes pathologiques différents. La DSP est particulièrement avantageuse dans l’analyse oncologique, car la variation spatiale peut être corrélée à la transformation cellulaire et à l’expression différentielle des protéines. Par exemple, le DSP a été utilisé pour comparer le profil protéomique du cancer du sein au microenvironnement tumoral adjacent. Cela comporte des implications importantes pour la compréhension de l’histoire naturelle de cette tumeur et de sa progression, ainsi que de la réponse potentielle au traitement13. D’autres contextes illustrant la polyvalence du DSP comprennent la quantification spatiale de la diversité des protéines dans le cancer de la prostate14, l’association de l’expression des marqueurs cellulaires immunitaires avec la progression de la maladie dans le carcinome épidermoïde de la tête et du cou 15 et la démonstration d’un gradient épithélial-mésenchymateux de l’expression protéique distinguant le cancer de l’ovaire métastatique du cancer primaire de l’ovaire à cellules claires16 . En implémentant DSP, nous caractérisons la topographie spatiale des protéines qui pourraient avoir un impact sur la tumorigenèse et l’invasion des gliomes.
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Protocol
Le protocole décrit ci-dessous suit les lignes directrices du Comité d’éthique de la recherche sur les êtres humains de Dartmouth-Hitchcock. Le consentement éclairé a été obtenu des patients dont les échantillons de tissus ont été inclus dans cette étude. Voir la section Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.
1. Préparation des diapositives17
- Récupérer ou préparer du tissu fixé au formol et incorporé dans la paraffine de gliomes de type adulte humain infiltrant de manière diffuse.
REMARQUE: Dans cette expérience, des blocs de biopsies incorporés à la paraffine de trois patients atteints de glioblastome ont été utilisés. - Créez un bloc de microréseau tissulaire (TMA). Prélever plusieurs carottes de 2 mm de chaque biopsie et les placer dans un seul bloc TMA (Figure 1, en haut). Couper des sections du bloc TMA à 4 μm et les monter sur des lames de verre. Placez chaque glissière à l’intérieur du joint du porte-lame. Incuber la lame à 60 °C pendant 30 min.
2. Préparation semi-automatisée du système IHC et configuration logicielle (pour le chargement et l’exécution des diapositives)17
- Configurez les réactifs. Cliquez sur le bouton Reagent Setup (Configuration du réactif ). Cliquez sur Ajouter dans l’onglet Configuration .
- Enregistrez un tampon de lavage en tapant un nom dans le champ Nom . Sélectionnez Auxiliaire dans le champ Type . Cliquez sur Enregistrer.
- Enregistrez une solution bloquante en répétant les mêmes étapes que ci-dessus (modifiées le cas échéant, par exemple, dans le champ Nom ), mais en sélectionnant Anticorps primaire dans le champ Type . Sélectionnez les protocoles souhaités dans les listes déroulantes Protocole de coloration par défaut et Protocole HIER par défaut. Sélectionnez une option Protocole enzymatique par défaut si vous le souhaitez (cette case a été laissée vide dans le protocole actuel). Cliquez sur Enregistrer.
- Enregistrez le système de détection, composé d’un plateau contenant de réactifs à code à barres. Scannez le code-barres.
- Commencez à entrer les détails du système de réactif dans la fenêtre Ajouter un système de réactif de recherche . Tapez un Nom pour le système de détection.
- Tapez une date d’expiration. Mettez en surbrillance la première rangée du graphique Réactifs et scannez le code-barres d’un nouveau contenant de réactifs de 30 mL, auquel cas le code-barres remplira la ligne 1.
- Placez le récipient à la position 1 du système de détection. Sélectionnez le nom du tampon de lavage dans la liste déroulante de la colonne Réactif et cliquez sur Ajouter. Répétez ces étapes pour ajouter des réactifs supplémentaires dans les lignes suivantes, y compris la solution bloquante.
- Configurez le protocole protéique pour IHC. Cliquez sur Configuration du protocole. Mettez en surbrillance la ligne correspondant au protocole souhaité et cliquez sur Copier. Entrez le Nom et remplissez tous les autres champs pertinents dans la fenêtre Modifier les propriétés du protocole.
- Cochez la case Afficher les étapes de lavage. Vérifiez que les champs Inc (min) et DispenseType sont corrects pour chaque réactif (10 min pour la solution de blocage, 0 min pour le tampon de lavage et 150 μL pour chaque DispenseType). Cliquez sur Enregistrer.
- Préparez l’étude. Remplissez le récipient en position 1 avec un tampon de lavage. Remplir 150 μL par lame et 5 mL de volume mort; Laissez le couvercle ouvert. Répétez ces étapes pour le récipient en position 2, qui doit être rempli d’une solution bloquante. Ce contenant doit contenir 150 μL par lame et 350 μL de volume mort.
- Chargez le bac contenant de réactifs sur la machine. Laissez le système effectuer des mesures de reconnaissance de conteneur et de confirmation de volume. Cliquez sur Slide Setup | Ajouter une étude. Entrez l’ID de l’étude et le nom de l’étude et sélectionnez 150 μL sous Dispense Volume | le protocole souhaité dans la liste déroulante Protocole de préparation (Bake and Dewax est suggéré). Mettez en surbrillance l’étude et cliquez sur Ajouter une diapositive.
- Sélectionner le tissu d’essai sous le type de tissu | 150 μL sous Volume de distribution | Single et Routine dans les listes déroulantes Mode de coloration. Sélectionnez un processus (IHC pour l’étude actuelle) | le nom de la solution de blocage dans la liste déroulante du champ Marqueur | Protocole DSP IHC dans le champ Coloration de l’onglet Protocoles | *Cuire et décirer pour préparation | *HIER 20 min avec ER1 pour HIER. Laissez le champ Enzyme vide.
- Répétez ce processus pour chaque diapositive. Cliquez sur Fermer une fois terminé, puis cliquez sur Imprimer les étiquettes. Cochez toutes les étiquettes de diapositives non encore imprimées pour l’étude actuelle et cliquez sur Imprimer. Apposez des étiquettes sur le haut des diapositives.
- Chargez et exécutez des diapositives. Chargez les lames sur le plateau de glissière, en veillant à ce que l’échantillon et l’étiquette soient orientés vers le haut. Placez les tuiles de couverture sur les diapositives, en veillant à ce que les diapositives soient orientées avec des languettes en bas. Chargez les plateaux coulissants sur l’instrument.
- Appuyez sur le bouton LED pour abaisser le plateau et permettre à l’instrument de commencer la numérisation et la reconnaissance des diapositives. Cliquez sur le bouton Démarrer pour commencer l’expérience.
- Terminez l’expérience. Appuyez sur le bouton LED lorsqu’il clignote en vert, indiquant la fin de l’exécution. Retirez le plateau de l’instrument et soulevez délicatement les carreaux de couvercle de chaque glissière. Placez les lames dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), retirez l’excès de tampon et délimitez chaque section de tissu avec un stylo hydrophobe pour créer une barrière hydrophobe.
3. Incubation d’anticorps et coloration des noyaux17
- Sélectionnez un panel d’anticorps pour localiser les antigènes d’intérêt (voir le tableau 1 pour les anticorps utilisés dans cette expérience).
REMARQUE : Chaque anticorps a déjà été conjugué à un oligonucléotide d’ADN avec un segment photoclivable aux UV (oligo-PC) qui l’identifie de manière unique (oligos indexés, Figure 2). - Faire une solution anticorps-PC-oligo fonctionnelle en ajoutant, pour chaque lame, 8 μL de chaque anticorps (dilué 1:40) dans le panneau. Utilisez le réactif bloquant comme diluant pour atteindre le volume final de 200 μL pour chaque lame. Incuber pendant une nuit à 4 °C (Figure 3, Étape 1).
REMARQUE: Des marqueurs morphologiques, des colorants biologiques ou des anticorps marqués par fluorescence peuvent également être ajoutés à la solution à cette étape. - Le lendemain, placez la lame dans un bocal Coplin et lavez 3 x 10 min dans 1x TBS-T. Postfixe dans 4% de paraformaldéhyde pendant 30 min à température ambiante, suivi de 2 x 5 min dans 1x TBS-T.
- Ajouter la coloration nucléaire SYTO13 (diluée 1:10 dans 1x TBS) pendant 15 min à température ambiante. Lavez 2x avec 1x TBS-T, puis rangez la lame dans 1x TBS-T.
4. Visualisation de fluorescence, identification du retour sur investissement et photoclivage UV sur l’instrument DSP17
- Après avoir passé la souris sur la collecte de données dans le Centre de contrôle, sélectionnez Nouveau/Continuer l’exécution.
- Placez la diapositive dans le porte-lame, avec l’étiquette vers l’utilisateur. Abaissez la pince du plateau coulissant, en veillant à ce que le tissu soit visible dans la fenêtre allongée. Ajouter 6 mL de tampon S.
- Suivez les invites du Centre de contrôle. Zoomez entre différents axes à l’aide des curseurs X et Y pour délimiter une région à numériser. Sélectionnez Scan. Laissez l’analyse se poursuivre jusqu’à ce que toute la zone cible définie ait été imagée.
- Générez une image 20x. Définissez les retours sur investissement automatiquement ou manuellement (Figure 3, étape 2). Pour suivre ce protocole, sélectionnez trois ROI circulaires de taille égale (diamètre de 250 μm) pour chaque noyau tissulaire (Figure 4, en bas).
REMARQUE: Les ROI sont personnalisables en taille et en forme. Plusieurs ROI peuvent être sélectionnés dans chaque section. Dans cette expérience, les ROI circulaires sont définis manuellement. - Approuvez le retour sur investissement en cliquant sur le bouton Quitter l’espace de travail d’analyse . Attendez que la lumière UV clive les oligos des anticorps.
- Une fois le processus de nettoyage de l’instrument terminé, sélectionnez Nouvelle collecte de données pour continuer avec les lames ou la plaque actuelles. Sinon, sélectionnez Supprimer les lames et la microplaque.
- Ouvrez la fenêtre Finaliser la plaque en double-cliquant sur la zone de l’icône de plaque en bas à droite du centre de contrôle. Si le numéro de lot (#) du pack de codes d’hybridation (Hyb) est connu, entrez le numéro et cliquez sur Mettre à jour (facultatif pendant cette étape). Cliquez sur Finaliser.
- Détachez le support de glissière et la plaque de collecte en suivant les instructions. Conservez les diapositives dans TBS-T. Si les lames ne doivent pas être utilisées pendant une longue période, recouvrez-les d’un milieu aqueux et d’une lame.
5. Lecture des protéines17
- Utiliser un joint perméable et sécher les aspirats à 65 °C dans un thermocycleur avec le couvercle ouvert. Ajouter 7 μL d’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle et mélanger. Incuber à TA pendant 10 min, puis tourner rapidement.
- Choisissez les équations Sonde R et Sonde U appropriées dans le Tableau 2 pour guider la création du mélange sonde/tampon. Sur la base du nombre de codes Hyb nécessaires à l’hybridation dans la présente expérience, appliquer l’équation (1) comme ci-dessous. Mélangez et faites tourner vers le bas rapidement.
# Hyb Codes Sonde R Piscine de travail Sonde U Bassin de travail Hybridation Tampon n = ________ (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1) - Ajouter 84 μL de mélange sonde/tampon à chaque pack de codes Hyb à utiliser. Faites glisser pour mélanger et faire tourner vers le bas. Dans une nouvelle plaque d’hybridation à 96 puits, ajouter 8 μL de chaque Hyb Code Master Mix dans les 12 puits de la rangée indiquée.
- Transférer 7 μL de la plaque collectrice DSP au puits correspondant dans la plaque d’hybridation. Mélanger délicatement. Thermosceller et effectuer une rotation rapide. Ensuite, incuber pendant la nuit à 67 °C. Refroidissez l’assiette sur de la glace et faites tourner rapidement.
- Regrouper les produits hyb de chaque puits dans un tube en bande, en canalisant doucement chaque puits 5x pour mélanger. Boucher le tube de bande et faire tourner vers le bas. Congeler tous les produits hyb non groupés restants à -80 °C. Chargez les tubes de bande dans le système d’analyse.
- Enregistrez le fichier CDF sur une clé USB, puis transférez les données de l’instrument DSP vers Digital Analyzer. Terminez la configuration en procédant comme suit.
- Chargez les consommables et les échantillons regroupés sur la station de préparation. À l’écran, appuyez sur Démarrer le traitement. Sélectionnez Haute sensibilité, puis Suivant. Appuyez sur Sélectionner tout pour obtenir le nombre de puits avec échantillons | Terminer | Suivant sur la notification par e-mail | Démarrer.
- Une fois la station de préparation terminée, scellez la cartouche et transférez-la dans l’analyseur numérique. Appuyez sur Start Counting, sélectionnez Stage Position (Position de la scène), Load Existing CDF file (Charger le fichier CDF existant) et sélectionnez Previous uploaded file (Fichier précédemment téléchargé). Appuyez sur Terminé, sélectionnez à nouveau la position de la scène, appuyez sur Terminé | Commencez à exécuter le programme.
- Enregistrez le fichier compressé des fichiers de conversion du décompte du rapporteur du système d’analyse sur une clé USB, puis insérez le lecteur dans la machine DSP. Dans le Centre de contrôle DSP, passez la souris sur Collecte de données, puis cliquez sur Nombre de téléchargements. Sélectionnez le fichier compressé approprié.
6. Analyse des données17
- Cliquez sur Enregistrements dans le centre de contrôle DSP. Pour afficher les analyses dans la file d’attente, sélectionnez Ajouter les analyses sélectionnées à la file d’attente | Ma file d’attente d’analyse. Sélectionnez Nouvelle étude dans la file d’attente après avoir survolé l’option Analyse des données dans le Centre de contrôle.
- Choisissez QC dans les options de la barre des tâches. Continuez avec les valeurs par défaut ou ajustez si vous le souhaitez. Sélectionnez Exécuter QC et passez en revue la grille de résultats. Cliquez sur Exécuter QC pour continuer et créer un nouveau jeu de données, normalisant les valeurs aux contrôles d’hybridation positive.
- Importez les nouvelles balises dans un fichier XLSX. Sélectionnez Gérer les annotations dans le volet Analyses , puis téléchargez un modèle, insérez les balises et importez le fichier.
- FACULTATIF : Après avoir exécuté QC, ajustez davantage les données à l’aide d’autres options de la barre d’outils. Utilisez les outils du volet Visualisations pour tracer les données transformées.
- Parcourez la liste déroulante grise des paramètres pour composer chaque tracé dans le volet Visualisations . Sélectionnez une région particulière dans un tracé pour visualiser les segments en surbrillance correspondants dans le volet Scans et cliquez avec le bouton droit de la souris pour générer des balises ou des groupes. Dans Résumé du jeu de données, passez en revue les graphiques de Normalisation, Mise à l’échelle et d’autres options pour l’analyse et l’affichage.
- Enregistrez une visualisation en sélectionnant l’icône à enregistrer ; passez en revue les visualisations déjà enregistrées sous Résumé. Sélectionnez le bouton Exporter (.svg) pour exporter une visualisation dans .svg format. Exportez les données sur lesquelles repose une visualisation en cliquant sur le bouton Exporter (.xlsx). Exportez toutes les données contenues dans un jeu de données spécifique en plaçant le curseur sur le nom du jeu de données dans le deuxième volet et en cliquant sur l’icône d’exportation .
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Representative Results
La figure 4 montre les résultats représentatifs d’une expérience DSP réalisée sur des échantillons de glioblastome. Une carte thermique est présentée, illustrant l’une des méthodes permettant de capturer visuellement des données à l’aide du logiciel DSP. Les lignes représentent les cibles protéiques, et chaque colonne correspond à une région d’intérêt. Une gamme de couleurs de bleu à rouge indique une expression faible à élevée, respectivement. La variabilité de la couleur au sein d’une rangée reflète l’hétérogénéité régionale des protéines et suggère une association spatiale possible avec l’expression différentielle des protéines. Par exemple, dans la présente expérience, S100 et CD56 sont universellement élevés parce qu’ils sont des marqueurs neuronaux.
Les marqueurs présentant la plus grande variabilité comprenaient B7-H3, Ki-67, CD44 et la fibronectine. Ces marqueurs ont des associations importantes avec la prolifération tumorale, la migration et les métastases, respectivement. Il est donc raisonnable qu’ils présentent une variabilité régionale entre les échantillons de noyau malin, d’invasion maligne et de tissu non malin. La représentation numérique des données est également possible; un fichier contenant la valeur d’expression de chaque marqueur protéique dans un ROI sous forme de tableau peut être exporté pour analyse mathématique et statistique. Cette valeur d’expression est produite par la fonction de comptage numérique disponible via DSP, qui quantifie les oligo-PC microaspirés dans chaque ROI (Figure 1 et Figure 2).
Figure 1 : Définition des régions d’intérêt dans les microréseaux tissulaires à partir de biopsies de glioblastome. Coupe, en haut, en hématoxyline et en éosine, d’un microréseau tissulaire contenant plusieurs biopsies par forage de 2 mm de diamètre provenant d’un total de trois patients atteints de glioblastome. En bas, régions d’intérêt définies sur l’image de fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Oligonucléotides photoclivables. Les sondes oligonucléotidiques antisens pour les cibles de protéines ou d’ARN, respectivement, sont liées de manière covalente aux oligonucléotides avec des liants photoclivables. Les sections de tissu sont colorées avec les sondes. La lumière UV est ensuite dirigée vers les ROI pour libérer les oligo-oligos PC, qui sont comptés numériquement. Ce chiffre a été modifié de9, avec la permission de Springer Nature (copyright 2020). Abréviations : PC-oligos = oligonucléotides photoclivables; ROI = régions d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Procédure DSP. 1) Traitement tissulaire : Une lame tissulaire est colorée à l’aide d’anticorps oligo-conjugués ou de sondes à ARN. 2) Sélection du retour sur investissement: La lame de tissu est imagée et les ROI sont délimités, manuellement ou automatiquement en fonction de certains modèles de fluorescence. 3) Clivage des oligonucléotides conjugués: La lumière UV est dirigée vers les ROI, ce qui entraîne le clivage des oligonucléotides photoclivables. 4) Collection PC-oligo: Les oligo-PC sont aspirés dans un tube microcapillaire. 5) Placage: Les PC-oligos aspirés sont déposés dans une plaque de microtitrage. 6) Répétez : les étapes 3 à 5 sont répétées pour chaque retour sur investissement ; Entre chaque cycle, un lavage méticuleux est effectué. 7) Quantification: les pools de PC-oligos résolus spatialement peuvent être hybridés à des codes à barres fluorescents; cela permet de compter numériquement jusqu’à environ 1 million d’événements contraignants par retour sur investissement. Alternativement, les oligo-PC peuvent être quantifiés via NGS, dans lequel la plaque de microtitrage entière est regroupée dans un seul tube et séquencée. Les lectures sont ensuite traduites en comptages numériques et mappées à leur retour sur investissement d’origine, créant une carte visuelle de l’expression des protéines ou de l’ARN dans chaque section de tissu. Ce chiffre a été modifié de9, avec la permission de Springer Nature (copyright 2020). Abréviations : DSP = traitement spatial numérique; PC-oligos = oligonucléotides photoclivables; ROI = régions d’intérêt; NGS = séquençage de nouvelle génération. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Carte thermique représentative d’une expérience DSP. Les colonnes représentent les régions d’intérêt individuelles. Les rangées représentent une cible protéique. L’expression faible est indiquée en bleu et l’expression élevée est affichée en rouge. Abréviation : DSP = traitement spatial numérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| GeoMx Immune Cell Profiling- humain | Module pantumoral |
| -1 | MART1 |
| DC68 | NY-ESO-1 |
| HLA-DR | S100B |
| Ki-67 | BCL-2 |
| Bêta-2 Microglobuline | EpCAM |
| CD11c | Hélène2 |
| CD20 | PTEN |
| CD3 | ER-alpha |
| CD4 | PR |
| CD45 | |
| DC56 | |
| CD8 | |
| CTLA4 | |
| GZMB | |
| -L1 | |
| PanCk | |
| SMA | |
| Fibronectine | |
| Rb IgG | |
| Mme IgG1 | |
| Mme IgG2a | |
| Histone H3 | |
| S6 | |
| GAPDH |
Tableau 1 : Un échantillon représentatif de protéines pouvant être évaluées à l’aide de panels d’anticorps préconçus.
| Bassin de travail Probe U | ||||||
| Module 2 Sonde R | Autres modules | Eau traitée DEPC (microlitres) | Volume total (microlitres) | Sonde U Master Stock (microlitre) | Eau traitée DEPC (microlitre) | Volume total |
| 2 | ... | 16.5 | 2 | 14.5 | 16.5 | |
| 4 | ... | 33 | 4 | 29 | 33 | |
| 6 | ... | 49.5 | 6 | 43.5 | 49.5 | |
| 8 | ... | 66 | 8 | 58 | 66 |
Tableau 2 : Codes d’hybridation et bassins de travail des sondes R et U. Abréviation : hyb = hybridation ; DEPC = pyrocarbonate de diéthyle.
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Discussion
Compte tenu de la diversité des protéines qui pourraient potentiellement influencer l’agressivité des gliomes et de l’idée que plusieurs de ces protéines restent non découvertes, une méthode de quantification des protéines à haut débit est une approche technologique idéale. De plus, étant donné que les données spatiales dans les échantillons oncologiques sont souvent corrélées avec l’expression différentielle18, l’intégration du profilage spatial dans l’approche de quantification des protéines permet une analyse plus efficace.
L’approche à haut débit du DSP lui permet également d’être utilisé dans une approche de type fusil de chasse, ce qui est idéal pour découvrir de nouveaux biomarqueurs potentiels de la maladie et de la réponse au traitement. Dans deux études sur le mélanome, le DSP a été utilisé pour évaluer les réponses à l’association ipilimumab et nivolumab par rapport au nivolumab en monothérapie19 et au traitement néoadjuvant combiné avec l’ipilimumab et le nivolumab par rapport au traitement adjuvant standard20. Dans les deux études, le profilage DSP d’une variété de cibles protéiques après le traitement a démontré l’expression relative différentielle de marqueurs immunologiques clés, suggérant un rôle pour les biomarqueurs potentiels de la réponse thérapeutique.
DSP facilite également la détermination de la signification pathologique ultime de processus complexes au niveau moléculaire. Par exemple, une caractéristique distinctive des gliomes invasifs est leur propension à migrer directement à travers la matrice extracellulaire (MEC), et leur chemin migratoire est souvent guidé par les voies vasculaires et de la substance blanche 1,2. La variabilité de l’expression protéique du microenvironnement tissulaire est une caractéristique de la transition épithélio-mésenchymateuse qui entraîne l’invasion. Plusieurs études ont examiné comment les gliomes peuvent réguler positivement les métalloprotéinases matricielles (MMP), entraînant la dégradation de la MEC environnante et augmentant le caractère invasif21,22,23. En visualisant et en quantifiant l’effet cumulatif en aval de cette régulation différentielle, DSP fournit une analyse holistique à grande échelle.
Un déterminant clé du potentiel malin des gliomes est leur capacité à interagir avec les défenses immunitaires de l’hôte et à les manipuler. Semblables à d’autres tumeurs solides, les gliomes utilisent une variété de mécanismes pour échapper à l’immunosurveillance de l’hôte et perturber l’activation des protéines essentielles à la montée d’une réponse immunitaire. Les progrès récents en immuno-oncologie se sont concentrés sur l’identification des protéines immunogènes qui sont exprimées ou exploitées par les tumeurs. À l’avant-garde de ces développements figurent l’utilisation des lymphocytes T pour détecter les antigènes tumoraux immunologiquement actifs contre lesquels les virus oncolytiques peuvent être dirigés 24,25, et le développement d’inhibiteurs de point de contrôle contre les protéines inhibitrices des lymphocytes T (p. ex. PD1/PDL1 et CTLA4) pour potentialiser l’immunité de l’hôte contre les tumeurs 26,27 . Parmi les autres populations stromales qui occupent une place importante dans le microenvironnement du gliome, mentionnons les macrophages, les cellules endothéliales microvasculaires, les cellules immunitaires et une sous-population récemment identifiée appelée « cellules stromales associées au gliome » (GASC)28. Les interactions de ces cellules avec les chimiokines, les cytokines et les composants de l’ECM ont des implications importantes pour la prolifération tumorale, l’invasion et la réponse au traitement, et servent donc de cibles importantes pour la quantification et la comparaison régionales grâce à des technologies telles que DSP.
Le protocole DSP est convivial et permet plusieurs couches de personnalisation. Comme une grande partie du processus de quantification est automatisée, les principales étapes dépendantes de l’utilisateur visent à atteindre la sensibilité et la spécificité les plus élevées possibles de la détection de cibles. Les étapes clés du protocole comprennent donc la détermination d’une coloration pour la visualisation fluorescente initiale de l’échantillon, la délimitation du retour sur investissement et la sélection des panels d’anticorps.
Lors de la conception d’un protocole de coloration, il est important d’identifier d’abord une cible susceptible de démontrer des différences quantifiables entre les différentes régions de l’échantillon, correspondant à une caractéristique ou un comportement critique du tissu d’origine. Ensuite, un agent qui liera efficacement la cible doit être sélectionné. Par exemple, si l’on espère visualiser des régions d’hyperplasie ou d’atypie nucléaire, H&E ou une coloration nucléaire peut être choisi; Alternativement, si vous souhaitez visualiser des changements dans l’expression d’un gène connu pour être associé à des tissus malins ou précancéreux, un anticorps conjugué fluorophore peut être choisi. Les cellules tumorales elles-mêmes peuvent être spécifiquement marquées dans le cas des tumeurs mutantes IDH1-R132H. Le protocole actuel pourrait être modifié par l’ajout de l’IDH1-R132H marqué par fluorescence comme marqueur morphologique (étape 3.2 du protocole). Jusqu’à quatre colorations par échantillon peuvent être utilisées. Une fois que la visualisation du tissu coloré a eu lieu, les ROI sont désignés. La sélection des RSI devrait refléter les endroits où des différences significatives dans l’expression de la cible des protéines sont attendues. Les considérations clés lors de la sélection des ROI incluent la taille (diamètre de 10 à 600 μm), la forme (cercle, rectangle ou dessiné par l’utilisateur) et la segmentation (délimitation supplémentaire des sous-régions au sein d’un seul retour sur investissement, offrant une couche d’analyse potentielle supplémentaire). Ces variables doivent être optimisées pour capturer le plus efficacement possible la variation spatiale de l’expression cible anticipée en fonction du panel d’anticorps sélectionné.
La sélection du panel d’anticorps est d’une importance cruciale, car l’expression différentielle des anticorps sert en fin de compte de point final à l’étude. Lors de l’exécution de cette étape, il est important de considérer quels marqueurs peuvent présenter une expression qui est corrélée positivement ou négativement avec les stades le long du spectre du développement tumoral, de bénin à pré-invasif, invasif ou malin. Il est également important d’examiner attentivement les propriétés du tissu d’origine et du type de tumeur, car ces deux caractéristiques peuvent influencer l’expression de certains marqueurs.
Étant donné qu’une grande partie du processus est automatisée, les défauts de la procédure sont généralement dus à un dysfonctionnement matériel ou logiciel, offrant une capacité de dépannage limitée à l’utilisateur. Les problèmes qui peuvent survenir comprennent la perturbation de la mesure intégrée du contrôle de la qualité (CQ) (conçue pour signaler et potentiellement omettre les données suggérant un faible rapport signal/bruit, un faible nombre et une détection inadéquate des cibles), des mises à jour logicielles aberrantes et des problèmes de procédure (p. ex. arrêt prématuré de diverses étapes). Pour ces problèmes, il est recommandé à l’utilisateur de contacter le fabricant pour obtenir une assistance à distance. Par ailleurs, si l’utilisateur rencontre des problèmes intrinsèques de données (p. ex., faible nombre global de noyaux, faible variabilité dans l’expression entre les ROI), il peut envisager de répéter les étapes précédentes de la procédure (p. ex., regrouper les données de l’AMT d’origine, redéfinir le retour sur investissement). Il est également important de considérer les variations de densité tissulaire comme un facteur de confusion potentiel de la production antigénique et donc de l’expression des anticorps; Par conséquent, les tissus de densités similaires devraient viser à être sélectionnés pour l’analyse.
Des mesures de contrôle sont intégrées au protocole. Le programme fournit à la fois un contrôle interne positif et négatif qui tient compte des variations dans l’hybridation des oligo-PC aux codes à barres fluorescents. Les protéines d’entretien ménager offrent un autre contrôle positif qui peut également servir de facteur de normalisation sur la base de la cellularité.
La capacité de définir les ROI dans lesquels la quantification se produit est le fondement de la capacité de profilage spatial de DSP. Cette démarcation personnalisable des ROI marque une étape critique et distinctive dans le protocole. L’option de créer un retour sur investissement aussi petit qu’une seule cellule permet une précision régionale dans la quantification des protéines ou des acides nucléiques, et la possibilité de définir plusieurs retours sur investissement et de quantifier leur contenu en tandem grâce à l’analyse multiplex donne une approche à haut débit.
Lorsque les ROI sont sélectionnés pour représenter des régions pathologiquement distinctes au sein d’un échantillon de gliome (par exemple, nécrotique, périvasculaire), le profilage protéomique et la comparaison régionale peuvent révéler des mécanismes de propagation et de progression tumorale. Par exemple, l’IHC a été utilisée pour quantifier régionalement l’expression du facteur inductible par l’hypoxie (HIF-1α) dans des échantillons de glioblastome et a révélé une expression plus élevée près des zones nécrotiques par rapport aux zones périvasculaires29. Ceci est cohérent avec plusieurs études indiquant un rôle de l’hypoxie dans la tumorigenèse du gliome.
La variation régionale a également été largement étudiée parmi les composants des cellules immunitaires du microenvironnement tumoral. Les macrophages/microglies constituent la population cellulaire immunitaire prédominante dans les gliomes et ont fait l’objet d’études approfondies sur une base régionale. Il a été démontré que les sous-populations de macrophages associés aux tumeurs (TAM) jouent différents rôles dans la progression tumorale en fonction de leur emplacement dans la tumeur et du microenvironnement. Ceux à l’intérieur du bord invasif de la tumeur décomposent la membrane basale, favorisant la propagation; ceux dans les zones hypoxiques exercent un effet angiogénique, facilitant la croissance; ceux qui se trouvent à proximité du système vasculaire tumoral sécrètent de l’EGF et des facteurs associés pour diriger les cellules tumorales stromales vers les vaisseaux sanguins, entraînant des métastases30. Ces propriétés critiques et spatialement dépendantes démontrent la valeur des données protéomiques régionales en biologie du cancer et représentent une application supplémentaire importante de la DSP à la caractérisation des populations de cellules immunitaires au sein d’une tumeur et de son microenvironnement.
La technique présente quelques limites, notamment le coût et le nombre relativement faible de cibles disponibles dans les panels d’anticorps de base. De plus, bien que la résolution subcellulaire ne soit pas possible avec DSP, elle sera possible avec les nouvelles technologiesà venir 31. Malgré ces limites, la DSP est une technique puissante pour certains types de questions ciblées et sans réponse en biologie cellulaire du gliome. Cette technologie innovante offre une occasion exceptionnelle de découvrir de nouvelles perspectives biologiques grâce à une évaluation précise de diverses cibles protéiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le soutien du Laboratoire de génomique clinique et de technologie avancée du Département de pathologie et de médecine de laboratoire du système de santé Hitchcock de Dartmouth. Les auteurs remercient également la ressource partagée en pathologie au Dartmouth Cancer Center avec la subvention de soutien du NCI Cancer Center 5P30 CA023108-37.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
| Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
| Master Kit--12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |
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